Name: Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne Cryptosporidium E Giardia spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Scopri un metodo modificato EPA 1623 per rilevare Cryptosporidium e Giardia in acqua usando ultrafiltrazione a flusso tangenziale, separazione immunomagnetica e microscopia a immunofluorescenza.

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Vorremmo ringraziare Ann Grimm e Michael Zimmerman per la revisione critica di questo manoscritto e Doug Hamilton per il suo supporto tecnico.

1. Flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione procedura <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di eluizione (1 L): Per aggiungere 1 L di acqua distillata polifosfato di sodio 0,1 g, 0,1 ml di Tween-80 e 0,01 ml Y-30 antischiuma. </li><li> Preparare gruppo filtro (figura 1) in una cappa di sicurezza biologica: <ol><li> Inserire Masterflex I / P 73 attraverso un tubo lab I / P Masterflex Easy-Load testa della pompa collegata ad un I / P brushless Masterflex unità di precisione. </li><li> Fissare la tubatura a un, glicerina 0-60 psi-riempita manometro munito di un ramo NPT connettore a T a monte della testa della pompa con un morsetto a vite, e ad un connettore a T HDPE a valle della testa della pompa. </li><li> Montare la bottiglia ritentato montando un Nalgene 53-B di riempimento / sfiato tappo con Masterflex L / S 15 tubi di laboratorio e di un connettore a T e fissandolo ad una bottiglia da 1 L heavy duty polipropilene Nalgene. </li><li> Montare Masterflex L / S 24 tubi won una fascetta pizzico (pizzico morsetto 2) e collegarlo dalla bottiglia retentato al HDPE T-connettore. </li><li> Collegare L / S Masterflex tubo 24 laboratorio dal manometro al Asahi Kasei Rexeed 25S alto flusso dializzatore con un morsetto a vite, e dal dializzatore alla bottiglia ritentato. Utilizzare misura adattatori DIN progettati per ospitare ¼ &quot;tubo ID per collegare il tubo al ultrafiltro a fibre cave. </li><li> Montare Masterflex L / S 24 tubi di laboratorio con una fascetta pizzico (pizzico morsetto 1) e collegarlo a una pipetta di plastica da 10 ml con il tappo di punta e cotone rimosso per agire come la linea di assorbimento del campione e quindi collegare il tubo al HDPE T- connettore. </li><li> Inserire un&#39;estremità del tubo Masterflex L/S-36 laboratorio con una rampa fissacavo e collegare il tubo alla porta effluenti situato vicino alla estremità di uscita del filtro. Posizionare l&#39;altra estremità nel contenitore di rifiuti. </li></ol></li><li> Aggiungere 0,01% (w / v) polifosfato di sodio al campione 10 L di acqua e miscelare per 3 min. </li><li> Chiudere il morsetto pizzico 2e rimuovere il tappo di chiusura dal flacone ritentato. Tutti gli altri morsetti dovrebbe essere aperta. </li><li> Impostare la direzione della pompa per spostare il fluido dal connettore a T per il manometro (da destra a sinistra seguente Figura 1). Regolare la velocità della pompa al 25% della velocità massima e accendere la pompa. </li><li> Quando la bottiglia retentato è di 2/3, morsetto pizzico aperto 2 e sostituire rapidamente il tappo di chiusura alla bottiglia ritentato. Controllare tutte le linee e raccordi per garantire non vi siano perdite. </li><li> Aumentare lentamente la velocità della pompa alla velocità di filtrazione desiderata (circa 1,5 L / min), controllando eventuali perdite. Utilizzo di un cilindro graduato e un misuratore di flusso o timer, controllare la portata del filtrato dell&#39;acqua in uscita dalla linea di effluente (blu L / S tubo 36 nella figura 1). Le bolle d&#39;aria possono tipicamente formano all&#39;estremità di uscita del filtro rende difficile raggiungere una pressione stabile e la velocità di filtrazione. Questo è stato corretto pizzicando la linea di effluenti a mano per un momento. Questa azionegeneralmente coassiale la bolla d&#39;aria alla porta e filtrato per uscire attraverso la linea effluente. Ripetere, se necessario, tenendo presente che le bolle d&#39;aria pisello dimensioni sono spesso inevitabili. </li><li> Monitorare il processo di filtrazione. Misurare e registrare la pressione e la velocità di filtrazione come necessario. La pressione non deve mai superare i 20 psi. Si raccomanda che la velocità di filtrazione non deve superare 2,0 L / min. È importante che il volume di acqua nella bottiglia retentato essere monitorate per assicurare che non si svuota. È normale che il volume per aumentare o diminuire leggermente. Se il volume di acqua in bottiglia retentato scende sotto 1/3, quindi rimuovere il tappo di chiusura e un pizzico Chiudere il morsetto 2 sulla linea delle bottiglie ritentato. Portare il volume torna a circa 2/3, aprire il morsetto e sostituire rapidamente il tappo di chiusura, garantendo una tenuta perfetta. Se il volume in bottiglia retentato scende velocemente e, quindi assicurarsi il coperchio bottiglia ritenuto è stretto e il tappo di sfiato è saldamente in posizione, e che l&#39;tubing è ancora in contatto con il campione di acqua. Se questi problemi non si verificano, allora è probabile che la guarnizione del coperchio bottiglia ritentato è male e deve essere sostituito. </li><li> Quando il contenitore del campione è vuoto, morsetto presa immediatamente chiuso 1, ridurre la velocità della pompa al 20% del massimo, togliere il tappo di chiusura dal flacone ritentato e chiudere il morsetto rampa. </li><li> Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 200 ml svitando o avvitando il morsetto rampa. Dopo che il volume è di circa 200 ml, stringere il morsetto rampa per le fasi di eluizione (1,11-1,12). </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di eluizione per il contenitore del campione e lavare l&#39;interno del contenitore. Posizionare la pipetta 10 ml collegato alla linea di assorbimento del campione nel contenitore che contiene la soluzione di eluizione. Assicurarsi che il morsetto rampa è chiuso. Aperto pizzico morsetto 1 e un pizzico vicino morsetto 2 momentaneamente di elaborare la soluzione di eluizione. </li><li> Dopo 500 ml di soluzione di eluizione è redatta, Vicino pizzico morsetto 1 e il morsetto pizzico aperto 2. Lasciare la soluzione di eluizione di circolare per 5 minuti con una velocità della pompa del 20% del massimo. </li><li> Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 100 ml svitando o avvitando il morsetto rampa sulla linea di effluenti. Serrare la fascetta rampa e permettere al campione di circolare per 1 minuto. Evitare di tirare l&#39;aria nel tubo garantendo il volume del campione nella bottiglia retentato è sufficiente a coprire la L / S 15 di entrare nel tubo bottiglia ritentato. </li><li> Invertire la direzione della pompa che costringe il campione nella bottiglia ritentato. Lasciare la pompa per la retromarcia per 20 secondi per un totale di ~ 225 ml in bottiglia retentato. Spegnere la pompa. </li><li> Rimuovere l&#39;I / P Masterflex 73 tubo dalla testa della pompa e scollegare il manometro. Scollegare il L / S Masterflex 24 tubi uscita dalla fibra cava ultrafiltro. Tenere il tubo sopra la bottiglia ritenuto di forzare qualsiasi campione rimanente nellaritentato bottiglia. </li><li> Scollegare tutti i tubi dalla bottiglia e sostituire il tappo di sfiato con un non-sfiato tappo. </li><li> Proseguire fino alla IMS / IFA procedura con il retentato ~ 225 ml. </li></ol> 2. Separazione Procedura immunomagnetica <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: <ol><li> Lasciare i tamponi inclusi nelle Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit a temperatura ambiente. </li><li> 1X SL-buffer A: Aggiungere 1 ml di 10X SL-buffer A a 9 ml di acqua distillata. </li></ol></li><li> Trasferire la ~ 225 ml di liquido dalla bottiglia a un ritentato etichettato 250 ml provetta da centrifuga conica. Risciacquare la bottiglia ritentato due volte con 10 ml di acqua distillata, e aggiungere i risciacqui al tubo da centrifuga conica. Centrifugare la sospensione a 1500 xg per 15 min a 4 ° C senza freno. </li><li> Aspirare il supernatante dal aria-acqua a 5 ml di sopra della imballato pellet per ogni 0,5 ml di volume pellet (cioè aspirato a 15 ml sopra un volume di 1,3 ml pellet, e aspirare a 5 ml di una pastiglia di 0,5 ml o meno). </li><li> Accuratamente risospendere il pellet nel surnatante tramite vortex e / o una pipetta di miscelazione. Trasferire ogni volume di 5 ml di liquido al piatto lati Dynal L10 provetta contenente 1 ml ciascuna di SL-10X e 10X tampone A SL-tampone B. Lavare il tubo conico centrifuga due volte con 2,5 ml di acqua distillata e aggiungere la risciacquatura il tubo L10, portando il volume totale del tubo ml L10 a 12, compresi i buffer. </li><li> Aggiungere 100 ul ciascuno di Dynabeads risospeso ben miste anti-anti-Cryptosporidium e Giardia al tubo L10. Ruotare il tubo L10 a 18 rpm per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore rotatore. </li><li> Posizionare il lato piatto del tubo L10 contro l&#39;MPC-6 magnete e rock delicatamente a mano il tubo end-to-end, a 180 ° per 2 minuti. </li><li> Mantenere il tubo L10 del MPC-6 magnete con il lato magnete alto, decantare il surnatante dal tallone / (oo) cisti complessi bound al magnete. Rimuovere il tubo L10 del magnete e aggiungere 0,5 ml di tampone 1X SL-A al tubo. Trasferire la sospensione con due risciacqui supplementari di 0,5 ml di SL-1X tampone A in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml tenuto in MPC-S con il magnete in posizione verticale. </li><li> Agitare delicatamente il tubo nel MPC-S magnete a 180 ° per 1 minuto. Con il magnete in posizione, aspirare il supernatante usando una pipetta Pasteur diretta al fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1X PBS al lato anteriore della provetta, rimuovere il magnete e oscillare delicatamente il tubo fino a quando le perle vengono risospese. Sostituire il magnete in posizione verticale e oscillare delicatamente il tubo 180 ° per 1 minuto. Aspirare il PBS risciacquo, senza disturbare il pellet tallone, utilizzando una pipetta Pasteur per rimuovere quanto più possibile i detriti. </li><li> Rimuovere il magnete e aggiungono 50 pl di acqua distillata al lato posteriore della provetta. Vortex il tubo a tutta velocità per 50 secondi,incubare il tubo a 80 ° C per 10 minuti seguiti da un vortice 30 secondi. Sostituire il magnete nella MPC-S in posizione inclinata, legando le perline al magnete e lasciando i (oo) cisti nel liquido. Applicare il (oo) sospensione cisti a una diapositiva SingleSpot bene. </li><li> Ripetere passo 2,10, applicando il liquido stesso pozzo contenente la dissociazione prima. Vetrino su uno scivolo 37 ° C per 1 ora calda per asciugare la sospensione al vetrino. </li></ol> 3. Colorazione ed esame <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di lavoro DAPI: Aggiungere 25 ml di soluzione DAPI magazzino (2 mg / ml in metanolo) a 25 ml di PBS 1X. Negozio di stock e le soluzioni di lavoro tra 1 ° C e 10 ° C al buio. </li><li> Applicare 50 pl di metanolo alla slitta bene e lasciare asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 50 pl della soluzione di DAPI lavoro alla slitta pozzetto ed incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un Kimwipe per Wick il DAPI dal pozzo. Applicare il 50 microlitri di EasyStain. Incubare a 35 ° C per 30 minuti. </li><li> Wick la macchia del bene con un Kimwipe, e poi aggiungere lentamente 300 ml di tampone di fissaggio a freddo EasyStain, permettendogli di scendere oltre il bordo bene. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un Kimwipe a Wick il buffer dal pozzo e applicare 10 pl di medio EasyStain di montaggio. </li><li> Con attenzione applicare un vetrino, eliminando eventuali bolle che si verificano. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. </li><li> Scansione l&#39;intera diapositiva utilizzando il filtro FITC, con ingrandimento 200X totale, per ovoidale o sferica oggetti fluorescenti verde mela che assomigliano a uno oocisti o cisti. Esaminare tutti gli oggetti con il filtro DAPI a 1000X ingrandimento totale e poi con DIC, anche a 1000X ingrandimento totale. Registrare il formato utilizzando un micrometro oculare calibrato e caratteristiche morfologiche. </li><li> Risultati del documento. </li></ol> Nota: Ulteriori informazioniinformazioni sulla procedura originale si trova nella versione di dicembre 2005 di metodo EPA 1623 12. Il flusso tangenziale a fibre cave ultrafiltrazione procedura descritta viene utilizzata al posto della sezione di 12,0 metodo EPA 1623. La dissociazione di calore modifica la sezione 13.3.3 del metodo EPA 1623. La procedura descrive anche un ulteriore risciacquo PBS durante il processo di IMS che può essere inserito nella versione del dicembre 2005 Method 1623 dopo la sezione 13.3.2.16. L&#39;elenco completo dei beni di consumo, reagenti e attrezzature utilizzati per il metodo EPA 1623 l&#39;inserimento di tali modifiche è elencato nella lista degli equipaggiamenti. 4. Risultati rappresentativi Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia recuperati attraverso i processi di filtrazione e separazione immunomagnetica sono rilevati da analisi microscopica. A 200X ingrandimento totale, ogni organismo esibendo un tipico schema di colorazione, dimensione, forma e come mostrato in figura 2 </strong&gt; dovrebbe essere ulteriormente osservare con olio da immersione a 1000X ingrandimento totale. Ciò consentirà la misurazione e l&#39;identificazione di una delle caratteristiche tipiche che definiscono o caratteristiche atipiche che escludono l&#39;identificazione positiva. Cryptosporidium è un oggetto sferico ovoidale per 4 a 6 micron di diametro che presenta una brillante fluorescenza verde mela con bordi FITC brillantemente evidenziato (Figura 3A ). Con DAPI UV, uno oocisti esporrà una delle seguenti categorie tipiche funzionalità: la luce interna colorazione blu con bordo verde e senza nuclei distinti (DAPI negativo), intensa colorazione blu interno, o fino a quattro distinti, sky-blue nuclei (DAPI positivo - Figura 3B). Caratteristiche atipiche includono deviazioni di colore, struttura, o fluorescenza DAPI (ad esempio, troppi nuclei tinto, rosso fluorescente strutture interne). Se l&#39;oggetto fluorescente ha soddisfatto i criteri per FITC tipico e colorazione DAPI, è esaminato tramite le interferenze con differenzialecontrasto (DIC). L&#39;oggetto viene esaminato per atipici caratteristiche esterne o interne morfologici come ornamento parete cellulare, o uno o due nuclei grandi riempimento della cella. Se le strutture atipici non si osservano, l&#39;oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come una struttura amorfa o vuoto con uno a quattro sporozoiti presenti (Figura 3C). Allo stesso modo, Giardia oggetti simili vengono esaminati per quanto riguarda la colorazione FITC e DAPI così come le caratteristiche di CID, come assonemi, corpi mediani e nuclei cisti di Giardia sono rotonde ad oggetti ovoidali brillanti mela verde, 8 - 18 micron di lunghezza per 5 - 15 um ampio con bordi brillantemente evidenziato (Figura 3D). Con DAPI UV, la cisti Giardia esporrà DAPI-colorazione negativa, o DAPI-positive caratteristiche (Figura 3E). L&#39;oggetto fluorescente viene esaminato per le caratteristiche DIC tipici e atipici nello stesso modo come descritto per Cryptosporidium.Se caratteristiche atipiche non vengono osservate, l&#39;oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come vuoto struttura di contenimento amorfa, o con uno o più tipi di strutture interne presenti (Figura 3F). Qualsiasi organismo che si osserva di avere caratteristiche atipiche non dovrebbe essere considerato come un (oo) cisti. Analisi al microscopio di campioni ambientali può essere difficile in quanto vi sono organismi che possono auto-fluorescenti o cross-reagiscono con il FITC-coniugato anti-Cryptosporidium e / o anticorpi anti-Giardia 1. Si raccomanda che un analista avere familiarità con i microbi acquatici e decine di revisione di slide per acquisire esperienza identificare Cryptosporidium e Giardia. Almeno tre (oo) cisti sul vetrino del controllo positivo colorazione dovrebbe essere caratterizzato prima di ogni sessione al microscopio. Campioni di controllo di qualità può essere arricchito con (oo) cisti per determinare il rec per centoOvery per ogni protozoo utilizzando il calcolo: (Oo) Percentuale di recupero cisti = ((Count Sample QC - Contare da campioni non diluiti) / Spike) x 100. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione grafica del flusso tangenziale a fibre cave sistema di ultrafiltrazione. Il tubo di codifica a colori per facilitare sia l&#39;assemblaggio del sistema. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine rappresentativa fluorescenza di Cryptosporidium e Giardia (oo) cisti. Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sono state colorate con marcato con FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticorpi. Frecce, cisti Giardia, punte di freccia, oocisti di Cryptosporidium. Un totale di quattro oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sei sono stati trovati nel piano di messa a fuoco. I campioni osservabilied in un ingrandimento di 200X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Figura 3 immagini rappresentative microscopiche di oocisti di Cryptosporidium e cisti Giaridia utilizzati per la caratterizzazione oocisti di Cryptosporidium (A - C). Brillante fluorescenza verde mela FITC di oggetti sferici da 4 a 6 micron di diametro con i bordi evidenziati brillantemente (A) contenenti fino a quattro distinti, sky-blue nuclei DAPI (B) e una a quattro sporozoiti (S) per oocisti (C). cisti di Giardia (D - F). Brillante verde mela FITC del round agli oggetti ovoidali 8 - 18 micron di lunghezza per 5 - 15 micron di larghezza con bordi luminosi evidenziati (D) contenenti fino a quattro sky-blue nuclei DAPI (E) e con uno o più distinguibile struttura interna tale come nuclei (N), corpo mediano (M) e assonemi o (A) (F). Frecce bianche, fluorescenza verde mela brillante colorazione oocisti di Cryptosporidium e Giardia cisti walls, punte di freccia bianche, nuclei DAPI positivi. I campioni osservati sotto ingrandimento 1000X.

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</ol>

L&#39;Agenzia degli Stati Uniti Environmental Protection attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo in collaborazione con l&#39;Ufficio delle acque sotterranee e centro di assistenza tecnica l&#39;acqua potabile ha finanziato la ricerca descritta qui. Tutto il lavoro è stato sostenuto in loco presso l&#39;EPA, Cincinnati, Ohio. Sebbene le informazioni descritte in questo articolo è stato finanziato in tutto o in parte dal Protection Agency degli Stati Uniti ambientale ai sensi del contratto (Contract EP-C-06-031) a Shaw Ambientale e delle Infrastrutture, Inc, che non riflette necessariamente le opinioni della Agenzia e senza l&#39;approvazione ufficiale può essere presupposta. E &#39;stato oggetto di un ricorso dell&#39;Agenzia e approvate per la pubblicazione.

Flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione è una tecnica alternativa ed efficace per la concentrazione iniziale di oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia dall&#39;acqua. Fibre cave ultrafiltrazione è meno costoso dei filtri tradizionali. Dal momento che ha la capacità di concentrarsi oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia da una varietà di differenti matrici acqua è una valida alternativa alle tecniche di filtrazione attualmente utilizzate per il metodo EPA 1623. Come con la maggior parte degli altri metodi di filtrazione, a fibre cave di ultrafiltrazione è incline alla formazione di incrostazioni con campioni molto torbidi. Acqua alta pressione potrebbe derivare dal fouling filtro, quindi si consiglia di monitorare la pressione durante il ciclo di filtrazione. Oltre a oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia, fibra cava ultrafiltrazione ha dimostrato di essere in grado di concentrare batteri e virus 1-3,5,8. A fibre cave o ultrafiltrazioneutlined in questo metodo può essere utilizzato per concentrare organismi multipli in un singolo campione. È interessante notare che ottenere un volume finale tra 200 e 250 ml è il passaggio critico finale del procedimento di concentrazione in modo che le fasi di centrifugazione aggiuntivi, che può provocare (oo) perdita cisti, vengono evitati (passo 2.2). Tuttavia, consentendo il volume nella bottiglia si abbassa troppo può avere effetti sfavorevoli sui recuperi dal momento che non sarà sufficiente volume di liquido per forzare tutte le oocisti o cisti nella bottiglia ritentato. Pertanto si raccomanda di mantenere un volume finale tra 200 e 250 ml. Il calore dissociazione è un&#39;alternativa alla fase acido dissociazione in Method 1623. Questo passaggio alternativa è stato dimostrato per migliorare il recupero Cryptosporidium oocisti e ridurre la variazione metodo quando isolato sia da acqua di fiume o reagente 9. Un side-by-side confronto di acido e calore metodi dissociazione dimostrato che utilizza il calore per dissociazionete gli organismi delle sfere immunomagnetiche prodotto recuperi medi più elevati sia per Cryptosporidium e Giardia. Inoltre, la precisione dei recuperi di Cryptosporidium e Giardia era migliore nei campioni trattati con il calore di dissociazione rispetto a dissociazione acida 9. L&#39;incorporazione di HFUF come la fase di concentrazione consente una maggiore flessibilità, fornendo la capacità di concentrarsi di più organismi. Inoltre si tratta di una alternativa meno costosa alle attuali opzioni di filtraggio Metodo 1623.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / Reagente </td><td> Venditore </td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R umide fibre cave ultrafiltri </td><td> Comporre Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Drive Brushless </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Easy Load testa della pompa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Nero Tee HDPE, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> Plastics USA </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex connettore a T L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene heavy-duty pp 1 L bottiglia </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene riempimento / sfiato tappo per 1/4 &quot;tubo, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometro </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Giunto dritto, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT ramo tee, pp naturale </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610-75 </td></tr><tr><td> Morsetti a pinza, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> Custom fit DIN adattatori </td><td> Prodotti stampati Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Anello di supporto </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Anello di sostegno morsetti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa di clamp, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Polifosfato di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Tiosolfato di sodio pentaidrato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 emulsione </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L pieghevole polietilene ad alta densità cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugare portabottiglie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml provette per centrifuga coniche </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Imbuto monouso </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Bottiglia di lavaggio </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Rotore oscillante </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugare adattatori secchio per 250 ml provette coniche </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 pl grandi puntali calibro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> IoDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> Provette da 50 ml coniche </td><td> Falco </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 tubi piatti lati </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 magnete </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipette </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml bassa aderenza microcentrifuga tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 pipette Pasteur pollici </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S magnete </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vortice </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotatore mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Blocco riscaldante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armatura Beads </td><td> Lab Armatura </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Termometro digitale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfato-buffer salino 1X pH 7.4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Diapositive singolo punto </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain kit diretta </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-DiamidIno-2-fenil dicloridrato indolo (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Cancella lo smalto </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> scorrere caldo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Olio di immersione, di tipo A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Microscopio Nikon 90i con capacità DIC </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Piano obiettivo APO olio 100X </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Pianificare Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC filtro </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtro </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-cite illuminatore a fluorescenza </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lens carta </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard sacchetto usa e getta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard sharps container </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno al 3% </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Candeggina </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

un metodo modificato epa 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare waterborne<em&gt; cryptosporidium</em&gt; e<em&gt; giardia spp.</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Specie di Cryptosporidium e Giardia sono due dei più diffusi protozoi che provocano epidemie di malattie diarroiche trasmesse dall&#39;acqua in tutto il mondo. Per meglio caratterizzare la prevalenza di questi patogeni, il metodo EPA 1623 è stato sviluppato e utilizzato per monitorare i livelli di questi organismi in acqua potabile degli Stati Uniti fornisce 12. Il metodo ha tre parti principali: il primo è la concentrazione del campione in cui viene filtrato almeno 10 L di acqua di superficie grezza. Gli organismi e detriti intrappolati vengono poi eluite dal filtro e centrifugato per concentrare ulteriormente il campione. La seconda parte del metodo utilizza una procedura di separazione immunomagnetica cui è applicato il campione concentrato a sfere immunomagnetiche che si legano specificamente alle oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia consentendo rimozione specifica dei parassiti dal detriti concentrato. Questi (oo) cisti sono poi staccati dalle biglie magnetiche da una dissociazione dell&#39;acido proceduradure. La parte finale del metodo è la colorazione per immunofluorescenza enumerazione e dove sono applicati (oo) cisti ad un vetrini colorati, e enumerate da microscopia. Metodo 1623 dispone di quattro quotate sistemi a concentrazione del campione per catturare oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia in acqua: filtri Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek filtri HV (Pall Corporation), Filta-Max filtri (IDEXX, Westbrook, MA), o centrifugazione a flusso continuo (Haemonetics, Braintree, MA). Tuttavia, Cryptosporidium e Giardia (oo) cisti recuperi sono cambiate notevolmente a seconda della matrice acqua di sorgente e filtri utilizzati 1,14. Un nuovo flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione (HFUF) sistema è stato recentemente dimostrato di essere più efficiente e più robusto al recupero oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia da matrici acquatici, inoltre, è meno costoso rispetto all&#39;opzione capsule altri filtros e può concentrarsi agenti patogeni contemporaneamente 1-3,5-8,10,11. Inoltre, studi precedenti di Hill e colleghi hanno dimostrato che il HFUF ha migliorato significativamente i recuperi oocisti di Cryptosporidium se direttamente confrontati con i filtri HV Envirochek 4. Ulteriori modifiche agli attuali metodi sono stati segnalati anche per migliorare le prestazioni del metodo. Sostituzione del procedimento di dissociazione acida con calore dissociazione ha dimostrato di essere più efficace a separare Cryptosporidium le biglie magnetiche in alcune matrici 9,13. Questo protocollo descrive un metodo modificato 1623 che utilizza il nuovo sistema di filtrazione HFUF con il passaggio di calore dissociazione. L&#39;uso di HFUF con questo metodo modificato è un alternativa meno costosa alle attuali metodo EPA 1623 le opzioni di filtraggio e fornisce una maggiore flessibilità consentendo la concentrazione degli organismi più.

Questo protocollo descrive l&#39;uso di un flusso tangenziale a fibre cave sistema di concentrazione del campione di ultrafiltrazione ed una dissociazione calore come procedura alternativa per la rilevazione di acquosa<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia</em&gt; Le specie che utilizzano il metodo EPA 1623.

Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Le specie di Cryptosporidium e Giardia sono tra i protozoi più diffusi che causano epidemie di malattie diarroiche trasmesse dall'acqua in tutto il mondo. Per meglio...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e visualizzare le specie di Cryptosporidium e Giardia presenti nell'acqua. Questo viene ottenuto innanzitutto concentrando il campione d'acqua mediante filtrazione tangenziale a flusso trasversale, con fibre cave e ultrafiltrazione. Il secondo passaggio consiste nell'eluire gli organismi e trattenere i detriti dal filtro dopo una centrifugazione.La separazione immunomagnetica consente la separazione selettiva dei parassiti dal materiale concentrato. Le microsfere magnetiche vengono staccate dai parassiti mediante dissociazione termica e rimosse utilizzando un magnete. Le cisti e le O cisti vengono quindi posizionate su un vetrino e il campione viene colorato per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza.Il vantaggio principale della filtrazione hofi rispetto alle tecniche esistenti è che il filtro ultra è significativamente meno costoso e cattura diversi microrganismi oltre a Cryptosporidium e Giardia, come virus e batteri. In generale, chi si approccia per la prima volta all'immunoseparazione potrebbe avere difficoltà nella gestione della quantità e del tipo di detriti associati a campioni diversi, provenienti da condizioni climatiche molto variabili. Iniziare assemblando l'apparato di ultrafiltrazione all'interno di una cappa a sicurezza biologica.Una volta assemblato, l'apparato funziona nel modo seguente: il campione d'acqua entra nel sistema passando attraverso il connettore a T nero e scorre attraverso la testa della pompa, il manometro e nel filtro ad ultrafiltrazione a fibra cava; l'acqua filtrata fuoriesce lateralmente dal filtro per finire nel contenitore dei rifiuti. L'acqua trattenuta, contenente gli organismi, viene spinta nella bottiglia del concentrato e ricircolata all'interno del sistema fino a quando il volume d'acqua non si riduce. Per iniziare la procedura, rimuovere il tappo di sfiato e aprire tutte le pinze tranne la pinza a pressione numero due, che deve essere chiusa in modo da permettere alla bottiglia del concentrato di riempirsi con l'acqua; impostare il senso di rotazione della pompa in modo che il campione d'acqua fluisca verso il filtro.Quindi regolare la velocità della pompa al 25% e accendere la pompa quando la bottiglia del rinato è piena per due terzi. Chiudere con il morsetto numero due e sigillare rapidamente la bottiglia in modo stretto utilizzando il tappo di ventilazione. Controllare tutte le tubazioni e le connessioni per assicurarsi che non ci siano perdite.Aumentare quindi lentamente la velocità della pompa fino a circa 1,5 litri al minuto utilizzando un cilindro graduato e un timer o un flussimetro, verificando che la velocità del filtrato, ovvero la velocità con cui l'acqua esce dalla linea di effluente, sia effettivamente di 1,5 litri al minuto. Monitorare il processo di filtrazione assicurandosi che la bottiglia del retentato non si svuoti mai, anche se il volume potrebbe aumentare o diminuire leggermente. Se il volume scende al di sotto di un terzo, rimuovere il tappo di sfiato e chiudere la fascetta di bloccaggio due.Di nuovo, lasciare che il volume nella bottiglia aumenti fino a due terzi. Quindi riavvitare saldamente il tappo di ventilazione e riaprire la pinza due. Una volta che il contenitore del campione è vuoto, chiudere immediatamente la pinza a pressione uno, ridurre la velocità della pompa al 20%. Rimuovere il tappo di ventilazione dalla bottiglia del retentato e chiudere la pinza ramp che collega il tubo di effluente della colonna filtrante al serbatoio degli scarti.Serrare o allentare la morsetto della rampa per regolare il volume nel flacone del retentato a circa 200 millilitri. Successivamente, serrare il morsetto della rampa per l'eluente per eluire il campione. Aggiungere innanzitutto 500 millilitri di soluzione eluente al contenitore del campione, risciacquando nel contempo l'interno del contenitore.Quindi posizionare la pipetta da 10 millilitri collegata alla linea di prelievo del campione nel contenitore della soluzione eluente. Aprire momentaneamente la pinza a pressione uno e chiudere la pinza a pressione due per aspirare la soluzione eluente. Una volta caricata tutta la soluzione, chiudere la pinza a pressione uno, aprire la pinza a pressione due e far circolare la soluzione per cinque minuti con una velocità della pompa del 20%. Stringere o allentare la pinza regolabile per portare il volume del campione nel contenitore del filtrato a circa 100 millilitri.Quindi serrare completamente la morsetto della rampa e lasciare ricircolare il campione per un minuto. A questo punto, invertire il senso della pompa per 20 secondi. Ciò porterà all'accumulo di circa 225 millilitri di campione nel flacone tate.Quindi spegnere la pompa. Rimuovere il tubo dalla testa della pompa e dal tubo in uscita dal filtro e tenere il tubo sopra la bottiglia di raccolta per far defluire qualsiasi campione rimanente nella bottiglia. Successivamente, scollegare tutti i tubi dalla bottiglia e sostituire il tappo areato con un tappo non areato.Trasferire il campione concentrato in un tubo conico da centrifuga da 250 millilitri. Risciacquare il flacone del filtrato due volte con 10 millilitri di acqua reagente e trasferire il liquido di risciacquo nel tubo da centrifuga. Centrifugare il campione a un minimo di 1500 ×g per 15 minuti.Non utilizzare l'arresto rapido per interrompere la centrifugazione. Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione il soprannatante fino a cinque millilitri al di sopra del pellet. È necessario prestare particolare attenzione a rimanere nella parte superiore del livello liquido ed evitare di aspirare le O cisti e le cisti contenute all'interno del pellet.Vortexare il tubo per risospendere completamente il pellet. Trasferire quindi il campione in un tubo Dyal L 10 a pareti piatte contenente un millilitro di ciascuno dei tamponi 10 X SL A e B. Risciacquare il tubo della centrifuga due volte con 2,5 millilitri di acqua reagente e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo Dyal L 10. Aggiungere 100 microlitri ciascuno di anticorpi magnetici coniugati anti *Cryptosporidium* e anti *Giardia*, portando il volume finale a 12 millilitri, nel tubo.Quindi ruotare il tubo a 18 giri/min per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rotante. Posizionare il lato piatto del tubo contro il magnete MP six e agitare delicatamente il tubo per due minuti senza rimuoverlo dal magnete. Mantenere il lato piatto rivolto verso l'alto e decantare il soprannatante.Avendo cura di non disturbare le perle trattenute sul lato piatto del tubo vicino al magnete. Rimuovere il tubo del campione dal magnete e risciacquare il lato piatto del tubo tre volte con 500 microlitri di tampone A, evitando i detriti sul lato arrotondato del tubo. Trasferire ogni volume di risciacquo in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri posizionato all'interno di un magnete MPCS. Con il magnete in posizione verticale, chiudere il tubo e agitarlo delicatamente per un minuto. Successivamente, mantenendo il magnete in posizione, aspirare il soprannatante utilizzando una pipetta Pasteur posizionata sul fondo del tubo e aggiungere delicatamente un millilitro di PBS nel tubo.Attenzione a non disturbare il pellet delle perle. Appoggiare alla parete del tubo adiacente al magnete. Rimuovere la striscia magnetica e agitare delicatamente il tubo finché le perle non sono completamente risospese.Riinserire la striscia magnetica in posizione verticale. Agitare delicatamente il tubo per un minuto ed aspirare il soprannatante, rimuovendo il maggior quantitativo possibile di detriti senza disturbare le perle. Dopo questo lavaggio, rimuovere il magnete ed aggiungere 50 microlitri di acqua reagente direttamente sulla piastra di perle.Vortexare il tubo alla massima velocità per 50 secondi per risospendere le perle. Incubare quindi il campione a 80 gradi Celsius per 10 minuti, consentendo alle cisti di Giardia e alle oocisti di Cryptosporidium di dissociarsi dalle perle. Al termine dell'incubazione, vortexare il campione per 30 secondi. Successivamente, posizionare la striscia magnetica all'interno del MPCS utilizzando la posizione inclinata per separare le perle dalle cisti e dalle oocisti in sospensione.Trasferire il surnatante contenente le cisti e le O cisti su un'unità di vetrino. Ripetere una seconda volta l'aggiunta di acqua, la vortexazione e i passaggi di dissociazione termica, aggiungendo il surnatante allo stesso vetrino. Successivamente, posizionare il vetrino su un riscaldatore per vetrini a 37 gradi Celsius per far asciugare la sospensione.Iniziare applicando 50 microlitri di metanolo sul vetrino per fissare il campione e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di soluzione DPI e incubare il vetrino per due minuti a temperatura ambiente. Per colorare i nuclei, utilizzare un fazzoletto Kim per rimuovere il liquido dal pozzetto avendo cura di non toccare il pozzetto.Quindi aggiungere 50 microlitri di colorante facile per colorare la parete cellulare delle cisti di Giardia e delle oocisti di Cryptosporidium. Incubare il campione a 35 gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il colorante con il fazzoletto Kim come in precedenza.Quindi aggiungere lentamente 300 microlitri di buffer fissante easy stain freddo posizionando con attenzione la punta della pipetta all'esterno del pozzetto e permettendo al liquido di fluire nel pozzetto. Incubare il vetrino per due minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il buffer utilizzando un fazzoletto di carta assorbente e applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio; posizionare delicatamente un coprioggetto sul campione, eliminando eventuali bolle d'aria, e sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare il vetrino con un ingrandimento compreso tra 200x e 1000x e un filtro fse quindi DPI a un ingrandimento di 200x; le forme cistiche e le O-cisti appaiono come strutture ovali fluorescenti di un brillante colore verde mela, con margini intensamente evidenziati.Le oocisti di Cryptosporidium sono rotonde e variano in dimensione da quattro a sei micron. Le cisti di Giardia sono più grandi, con una larghezza da cinque a 15 micron e una lunghezza da otto a 18 micron, e possono apparire rotonde o ovali a un ingrandimento di 1000 x. Utilizzando il filtro DPI, è possibile apprezzare meglio la struttura interna delle cisti e delle CYS.Tipicamente, all'interno dell'oocisti di Cryptosporidium e delle cisti di Giardia sono visibili fino a quattro sporozoiti, che appaiono come nuclei colorati in blu cielo dal colorante DPI. La microscopia a contrasto di fase differenziale (DIC) può inoltre agevolare l'identificazione corretta dei parassiti, poiché possono essere apprezzate ulteriori caratteristiche morfologiche. Gli sporozoiti di Cryptosporidium possono essere visibili mediante DIC; le cisti di Giardia spesso mostrano una o più strutture interne distinguibili, come nuclei visibili, organelli a forma di mezzaluna denominati corpi mediani e strutture flagellari interne chiamate assoni.È importante notare che la procedura di ultrafiltrazione con fibra piena (holo fiber) è in grado di catturare multipli microrganismi. Inoltre, altri saggi di rilevamento come la QPCR e il genotipaggio possono essere applicati ai campioni concentrati, rendendo questo metodo più flessibile e meglio adattabile alle vostre applicazioni. Grazie per averci guardato e fateci sapere se avete domande.

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