Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e visualizzare le specie di Cryptosporidium e Giardia presenti nell'acqua. Questo viene ottenuto innanzitutto concentrando il campione d'acqua mediante filtrazione tangenziale a flusso trasversale, con fibre cave e ultrafiltrazione. Il secondo passaggio consiste nell'eluire gli organismi e trattenere i detriti dal filtro dopo una centrifugazione.

La separazione immunomagnetica consente la separazione selettiva dei parassiti dal materiale concentrato. Le microsfere magnetiche vengono staccate dai parassiti mediante dissociazione termica e rimosse utilizzando un magnete. Le cisti e le O cisti vengono quindi posizionate su un vetrino e il campione viene colorato per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza.

Il vantaggio principale della filtrazione hofi rispetto alle tecniche esistenti è che il filtro ultra è significativamente meno costoso e cattura diversi microrganismi oltre a Cryptosporidium e Giardia, come virus e batteri. In generale, chi si approccia per la prima volta all'immunoseparazione potrebbe avere difficoltà nella gestione della quantità e del tipo di detriti associati a campioni diversi, provenienti da condizioni climatiche molto variabili. Iniziare assemblando l'apparato di ultrafiltrazione all'interno di una cappa a sicurezza biologica.

Una volta assemblato, l'apparato funziona nel modo seguente: il campione d'acqua entra nel sistema passando attraverso il connettore a T nero e scorre attraverso la testa della pompa, il manometro e nel filtro ad ultrafiltrazione a fibra cava; l'acqua filtrata fuoriesce lateralmente dal filtro per finire nel contenitore dei rifiuti. L'acqua trattenuta, contenente gli organismi, viene spinta nella bottiglia del concentrato e ricircolata all'interno del sistema fino a quando il volume d'acqua non si riduce. Per iniziare la procedura, rimuovere il tappo di sfiato e aprire tutte le pinze tranne la pinza a pressione numero due, che deve essere chiusa in modo da permettere alla bottiglia del concentrato di riempirsi con l'acqua; impostare il senso di rotazione della pompa in modo che il campione d'acqua fluisca verso il filtro.

Quindi regolare la velocità della pompa al 25% e accendere la pompa quando la bottiglia del rinato è piena per due terzi. Chiudere con il morsetto numero due e sigillare rapidamente la bottiglia in modo stretto utilizzando il tappo di ventilazione. Controllare tutte le tubazioni e le connessioni per assicurarsi che non ci siano perdite.

Aumentare quindi lentamente la velocità della pompa fino a circa 1,5 litri al minuto utilizzando un cilindro graduato e un timer o un flussimetro, verificando che la velocità del filtrato, ovvero la velocità con cui l'acqua esce dalla linea di effluente, sia effettivamente di 1,5 litri al minuto. Monitorare il processo di filtrazione assicurandosi che la bottiglia del retentato non si svuoti mai, anche se il volume potrebbe aumentare o diminuire leggermente. Se il volume scende al di sotto di un terzo, rimuovere il tappo di sfiato e chiudere la fascetta di bloccaggio due.

Di nuovo, lasciare che il volume nella bottiglia aumenti fino a due terzi. Quindi riavvitare saldamente il tappo di ventilazione e riaprire la pinza due. Una volta che il contenitore del campione è vuoto, chiudere immediatamente la pinza a pressione uno, ridurre la velocità della pompa al 20%. Rimuovere il tappo di ventilazione dalla bottiglia del retentato e chiudere la pinza ramp che collega il tubo di effluente della colonna filtrante al serbatoio degli scarti.

Serrare o allentare la morsetto della rampa per regolare il volume nel flacone del retentato a circa 200 millilitri. Successivamente, serrare il morsetto della rampa per l'eluente per eluire il campione. Aggiungere innanzitutto 500 millilitri di soluzione eluente al contenitore del campione, risciacquando nel contempo l'interno del contenitore.

Quindi posizionare la pipetta da 10 millilitri collegata alla linea di prelievo del campione nel contenitore della soluzione eluente. Aprire momentaneamente la pinza a pressione uno e chiudere la pinza a pressione due per aspirare la soluzione eluente. Una volta caricata tutta la soluzione, chiudere la pinza a pressione uno, aprire la pinza a pressione due e far circolare la soluzione per cinque minuti con una velocità della pompa del 20%. Stringere o allentare la pinza regolabile per portare il volume del campione nel contenitore del filtrato a circa 100 millilitri.

Quindi serrare completamente la morsetto della rampa e lasciare ricircolare il campione per un minuto. A questo punto, invertire il senso della pompa per 20 secondi. Ciò porterà all'accumulo di circa 225 millilitri di campione nel flacone tate.

Quindi spegnere la pompa. Rimuovere il tubo dalla testa della pompa e dal tubo in uscita dal filtro e tenere il tubo sopra la bottiglia di raccolta per far defluire qualsiasi campione rimanente nella bottiglia. Successivamente, scollegare tutti i tubi dalla bottiglia e sostituire il tappo areato con un tappo non areato.

Trasferire il campione concentrato in un tubo conico da centrifuga da 250 millilitri. Risciacquare il flacone del filtrato due volte con 10 millilitri di acqua reagente e trasferire il liquido di risciacquo nel tubo da centrifuga. Centrifugare il campione a un minimo di 1500 ×g per 15 minuti.

Non utilizzare l'arresto rapido per interrompere la centrifugazione. Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione il soprannatante fino a cinque millilitri al di sopra del pellet. È necessario prestare particolare attenzione a rimanere nella parte superiore del livello liquido ed evitare di aspirare le O cisti e le cisti contenute all'interno del pellet.

Vortexare il tubo per risospendere completamente il pellet. Trasferire quindi il campione in un tubo Dyal L 10 a pareti piatte contenente un millilitro di ciascuno dei tamponi 10 X SL A e B. Risciacquare il tubo della centrifuga due volte con 2,5 millilitri di acqua reagente e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo Dyal L 10. Aggiungere 100 microlitri ciascuno di anticorpi magnetici coniugati anti *Cryptosporidium* e anti *Giardia*, portando il volume finale a 12 millilitri, nel tubo.

Quindi ruotare il tubo a 18 giri/min per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rotante. Posizionare il lato piatto del tubo contro il magnete MP six e agitare delicatamente il tubo per due minuti senza rimuoverlo dal magnete. Mantenere il lato piatto rivolto verso l'alto e decantare il soprannatante.

Avendo cura di non disturbare le perle trattenute sul lato piatto del tubo vicino al magnete. Rimuovere il tubo del campione dal magnete e risciacquare il lato piatto del tubo tre volte con 500 microlitri di tampone A, evitando i detriti sul lato arrotondato del tubo. Trasferire ogni volume di risciacquo in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri posizionato all'interno di un magnete MPCS.

Con il magnete in posizione verticale, chiudere il tubo e agitarlo delicatamente per un minuto. Successivamente, mantenendo il magnete in posizione, aspirare il soprannatante utilizzando una pipetta Pasteur posizionata sul fondo del tubo e aggiungere delicatamente un millilitro di PBS nel tubo.

Attenzione a non disturbare il pellet delle perle. Appoggiare alla parete del tubo adiacente al magnete. Rimuovere la striscia magnetica e agitare delicatamente il tubo finché le perle non sono completamente risospese.

Riinserire la striscia magnetica in posizione verticale. Agitare delicatamente il tubo per un minuto ed aspirare il soprannatante, rimuovendo il maggior quantitativo possibile di detriti senza disturbare le perle. Dopo questo lavaggio, rimuovere il magnete ed aggiungere 50 microlitri di acqua reagente direttamente sulla piastra di perle.

Vortexare il tubo alla massima velocità per 50 secondi per risospendere le perle. Incubare quindi il campione a 80 gradi Celsius per 10 minuti, consentendo alle cisti di Giardia e alle oocisti di Cryptosporidium di dissociarsi dalle perle. Al termine dell'incubazione, vortexare il campione per 30 secondi. Successivamente, posizionare la striscia magnetica all'interno del MPCS utilizzando la posizione inclinata per separare le perle dalle cisti e dalle oocisti in sospensione.

Trasferire il surnatante contenente le cisti e le O cisti su un'unità di vetrino. Ripetere una seconda volta l'aggiunta di acqua, la vortexazione e i passaggi di dissociazione termica, aggiungendo il surnatante allo stesso vetrino. Successivamente, posizionare il vetrino su un riscaldatore per vetrini a 37 gradi Celsius per far asciugare la sospensione.

Iniziare applicando 50 microlitri di metanolo sul vetrino per fissare il campione e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di soluzione DPI e incubare il vetrino per due minuti a temperatura ambiente. Per colorare i nuclei, utilizzare un fazzoletto Kim per rimuovere il liquido dal pozzetto avendo cura di non toccare il pozzetto.

Quindi aggiungere 50 microlitri di colorante facile per colorare la parete cellulare delle cisti di Giardia e delle oocisti di Cryptosporidium. Incubare il campione a 35 gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il colorante con il fazzoletto Kim come in precedenza.

Quindi aggiungere lentamente 300 microlitri di buffer fissante easy stain freddo posizionando con attenzione la punta della pipetta all'esterno del pozzetto e permettendo al liquido di fluire nel pozzetto. Incubare il vetrino per due minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il buffer utilizzando un fazzoletto di carta assorbente e applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio; posizionare delicatamente un coprioggetto sul campione, eliminando eventuali bolle d'aria, e sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare il vetrino con un ingrandimento compreso tra 200x e 1000x e un filtro fse quindi DPI a un ingrandimento di 200x; le forme cistiche e le O-cisti appaiono come strutture ovali fluorescenti di un brillante colore verde mela, con margini intensamente evidenziati.

Le oocisti di Cryptosporidium sono rotonde e variano in dimensione da quattro a sei micron. Le cisti di Giardia sono più grandi, con una larghezza da cinque a 15 micron e una lunghezza da otto a 18 micron, e possono apparire rotonde o ovali a un ingrandimento di 1000 x. Utilizzando il filtro DPI, è possibile apprezzare meglio la struttura interna delle cisti e delle CYS.

Tipicamente, all'interno dell'oocisti di Cryptosporidium e delle cisti di Giardia sono visibili fino a quattro sporozoiti, che appaiono come nuclei colorati in blu cielo dal colorante DPI. La microscopia a contrasto di fase differenziale (DIC) può inoltre agevolare l'identificazione corretta dei parassiti, poiché possono essere apprezzate ulteriori caratteristiche morfologiche. Gli sporozoiti di Cryptosporidium possono essere visibili mediante DIC; le cisti di Giardia spesso mostrano una o più strutture interne distinguibili, come nuclei visibili, organelli a forma di mezzaluna denominati corpi mediani e strutture flagellari interne chiamate assoni.

È importante notare che la procedura di ultrafiltrazione con fibra piena (holo fiber) è in grado di catturare multipli microrganismi. Inoltre, altri saggi di rilevamento come la QPCR e il genotipaggio possono essere applicati ai campioni concentrati, rendendo questo metodo più flessibile e meglio adattabile alle vostre applicazioni. Grazie per averci guardato e fateci sapere se avete domande.