Name: Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Impara a valutare l'angiogenesi nelle metastasi ossee da cancro al seno utilizzando risonanza magnetica, tomografia computerizzata e ultrasuoni in un modello di ratto nudo. Questo metodo permette l'analisi non invasiva della vascolarizzazione tumorale in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 e TR SFB-79, TB e DK). Gli autori desiderano ringraziare Bangert Renate, Karin Leotta e Lisa Seyler per un&#39;eccellente assistenza tecnica.

1. Coltura cellulare <ol><li> Culture MDA-MB-231 cellule umane di carcinoma mammario (American Type Culture Collection) in RPMI-1640 (Invitrogen, Germania) supplementato con 10% FCS (Sigma, Germania). Tenere tutte le culture in condizioni standard (37 ° C, atmosfera umidificata, 5% di CO 2) e il passaggio delle cellule 2-3 volte a settimana per tenerli in crescita logaritmica. Per il modello animale descritto di seguito, non vi è alcuna necessità di utilizzo di osso-specifici sottolinee di MDA-MB-231 cellule, come il tasso di ripresa tumore è superiore al 90% 1. </li><li> Raccogliere cellule tumorali sub-confluenti dopo utilizzando EDTA 2 mM in PBS-(salina tamponata con fosfato senza Ca 2 + e Mg 2 +) e 0,25% tripsina (Sigma, Taufkirchen, Germania). Conte MDA-MB-231 cellule nella camera A Neubauer e sospenderle in RPMI-1640 (5x10 5 cellule in 1 ml). </li></ol> 2. Rat Modello Nudo di metastasi ossee <ol><li> Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal responsabile anima governatival comitato etico. </li><li> Utilizzare ratti nudi ad un&#39;età di 6-8 settimane e tenerli a esenti da organismi patogeni condizioni di un adeguato sistema di piccoli animali (ad esempio mini-barriera di sistema). Tenere gli animali in condizioni controllate (21 + / - 2 ° C temperatura ambiente, 60% di umidità, e 12 ore ritmo luce-buio) e di offrire alimenti autoclavato e ad libitum acqua per i topi. </li><li> Prima dell&#39;intervento degli animali, iniettare un farmaco analgesico (ad esempio Carprofen 4 mg / kg sc, grazie alla sua somministrazione singola e breve emivita (circa 8 ore), carprofen non dovrebbe pregiudicare la crescita del tumore). Anestetizzare ratti con una miscela di ossigeno (0,5 l / min) ed isoflurano (1-1,5 vol.%) E assicurarsi che il ratto è anestetizzato respira correttamente e regolarmente prima di iniziare la seguente procedura. </li><li> Posizionare l&#39;animale anestetizzato con un microscopio binoculare operativo appropriato (ad esempio Leica) e lavorare con un ingrandimento di 16 volte. </li><li> Iniziare la procedura chirurgica tagliando la cute e sottocute nel inguinale regione ad una lunghezza di 2-3 cm con le forbici (BC060r Iris forbici 108 mm). Tutte le arterie si diramano l&#39;arteria femorale (FA) devono essere sezionato tra l&#39;arteria epigastrica superficiale (SEA), l&#39;arteria discendente genicular (DGA), poplitea (PA) e dell&#39;arteria safena (SA). </li><li> Mettere clip sulla arteria femorale prossimale dell&#39;origine del mare, nonché sulla DGA, PA e SA per occludere temporaneamente il flusso sanguigno locale. Legare il mare la sua parte distale per consentire l&#39;apertura di questa nave, senza sanguinamento (Figura 1A). </li><li> Tagliare la SEA con le forbici (Vännäs Micro-SCRS-scanalato STR 85 mm) prossimali della legatura (Figura 1B) e gestire una soluzione di 1% papaverina sul mare, per facilitare il successivo inserimento di un ago grazie al rilassamento della nave ( Figura 1C). </li><li> Tagliare circa la metà del diametro del mare con forbici e inserire un ago (0,3 mm di diametro e lunghezza 42 mm) nel lume del mare mentre Functional coloranting il taglio-end del vaso con una pinza (Figura 1D, E). Quando è disponibile, fissare l&#39;ago in un dispositivo esterno per ridurre i movimenti irregolari che potrebbero causare la perforazione della parete del vaso. Collegare una siringa all&#39;ago. Rimuovere la clip dal FA distale e posizionarlo sul arteria safena (Figura 1F). </li><li> Iniettare le MDA-MB-231 cellule sospese in 0,2 ml mezzi lentamente nel mare. In virtù delle clip MDA-MB-231 cellule vengono indirizzati al DGA e PA. Rimuovere l&#39;ago e legare la SEA per prevenire le emorragie prima di togliere le clip delle arterie. Chiudere la ferita con clips chirurgiche e terminare l&#39;anestesia per inalazione. </li><li> Per post-procedura di controllo, i ratti vengono sacrificati in genere 7-8 settimane dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali al fine di evitare gravi complicanze scheletriche. Durante questo tempo, gli animali devono essere monitorati giorno per valutare le dimensioni del tumore e le prove del dolore (ad esempio, deviazioni comportamentali, perdita di peso, difetti del motore). Se gli animali mostrano un tumoredimensione che superi il limite eticamente consentito o evidenza di dolore durante la crescita del tumore, devono essere eutanasia. </li><li> Immuno-deficienti (nude), i ratti sono stati utilizzati per i trapianti umani xenogenous di MDA-MB-231 cellule tumorali del seno. Ratti nudi, non sono stati scelti per visualizzare meglio il tumore in crescita. </li></ol> 3. Magnetic Resonance Imaging (MRI) <ol><li> Dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali, occorrono circa 25-30 giorni di crescita del tumore prima di iniziare con l&#39;imaging. Per RM utilizzare uno scanner dedicato sperimentale o un sistema umano MR con una bobina appropriati condotti su animali. Abbiamo utilizzato un sistema umano MR (Symphony, Siemens, Germania) e una casa costruita bobina di eccitazione per radiofrequenza e rilevazione, progettato come un volume cilindrico risonatore con un diametro interno di 83 mm e una lunghezza utile di 120 mm (Figura 2A). </li><li> Anestetizzare il topo con l&#39;ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un tap<html> e. Collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto (per esempio 0,1 mmol / kg Gd-DTPA in circa 0,5 ml; Magnevist, Bayer-Schering, Germania). </li><li> Mettere il topo nel sistema MR mantenere l&#39;anestesia per inalazione. Iniziare con una sequenza morfologica MR per individuare le metastasi ossee (ad esempio T2 pesata: sequenza turbo spin echo, TR 3240 ms, TE 81 ms, matrice di 152 x 256, FOV 90 x 53,4 millimetri 2, spessore di strato 1,5 mm, 3 medie, scan tempo di 3:40 min). </li><li> Determinare una fetta di metastasi ossee con la più grande diametro e avviare la sequenza per DCE-MRI (ad esempio il recupero di saturazione turbo sequenza di flash, TR 373 ms, TE 1,86 ms, matrice di 192 x 144, FOV 130 x 97,5 mm 2, spessore di strato 5 mm, misure 512, medie 1, tempo di scansione 6:55 min). Dopo circa 30 secondi, inizia a iniettare l&#39;agente di contrasto per un periodo di tempo di 10 sec. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame RMN è di circa 15-20 min per animale. </li></ol>titolo &quot;&gt; 4. volumetrica Tomografia Computerizzata (VCT) <ol><li> Scegliere un opportuno sistema CT, sia un essere umano o uno scanner sperimentale. Qui, abbiamo utilizzato un prototipo di schermo piatto dotato tomografo volumetrico computerizzata (Figura 2B; Volume CT, Siemens, Germania). </li><li> Anestetizzare il topo con l&#39;ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un nastro. Collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto (per esempio 1 g di iodio per kg in circa 0,5 ml; Imeron 400, Bracco, Germania). </li><li> Posizionare il ratto sullo scanner sotto anestesia inalatoria. Utilizzare i seguenti parametri di scansione per VCT: tensione del tubo 80 kV, della corrente del tubo 50 mA, tempo di scansione 51 sec, velocità di rotazione 10 sec, 120 fotogrammi al secondo, matrice 512 x 512 e spessore di strato 0,2 mm. Iniettare l&#39;agente di contrasto durante la seconda rotazione del sistema di flat panel. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame VCT è circa 5-10 min per animal. </li><li> Ricostruzione delle immagini con un FDK modificato (Feldkamp-Davis-Kress) cone-beam algoritmo di ricostruzione (kernel H80a, Afra, Germania). </li></ol> 5. Ultrasound (US) <ol><li> Sperimentali e clinici, i sistemi degli Stati Uniti sono disponibili a questo scopo. Abbiamo usato il sistema clinico Acuson Sequoia 512 sistema a ultrasuoni con un trasduttore 15L8 lineare (figura 2C, Siemens-Acuson, Mountain View, CA). </li><li> Anestetizzare il topo con l&#39;ossigeno e isoflurano come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda e fissarlo sulla coda con un nastro. Collegare una siringa contenente un agente microbolle di contrasto (ad esempio 1,6 ml / kg in circa 0,5 ml; SonoVue, Bracco, Italia). Fissare il trasduttore Stati Uniti sulla rispettiva gamba posteriore si utilizza un treppiede e di applicare il gel degli Stati Uniti tra il trasduttore e la gamba posteriore. </li><li> Eseguire B-mode (frequenza di trasmissione: 17 MHz; indice meccanico: 0,51) per determinare il diametro maggiore della metastasi ossea e fissare il trasduttore in tla sua posizione. Aggiungi il segnale Doppler B-mode immagini per maggiori informazioni sulla perfusione tissutale. Si prega di tenere presente che solo le lesioni che distruggono l&#39;osso corticale sono accessibili alle onde degli Stati Uniti. </li><li> Per dinamica ecocontrastografia (DCE-US), impostare il dispositivo di contrasto degli Stati Uniti in cadenza di impulsi sequencing (CPS) modalità (frequenza di trasmissione: 7 MHz; indice meccanico: 0,18), iniettare le microbolle e registrare un cine loop di lunghezza di 90 sec. Il tempo totale per le suddette procedure per eseguire un esame ecografico è di circa 10-15 minuti per ogni animale. </li></ol> 6. Postprocessing dei dati di imaging <ol><li> Utilizzare le informazioni morfologiche da MRI, VCT e gli Stati Uniti per caratterizzare il tumore dei tessuti molli (MRI, USA) e la distruzione dello scheletro (VCT) di metastasi ossee e di determinare la posizione, dimensione della lesione e il volume delle lesioni con un visualizzatore DICOM (ad esempio OsiriX Dicom Viewer). </li><li> Per ottenere il tipo di ramificazione dei vasi in metastasi ossee (angiografia), i dati VCT possono essere utilizzati. Recostruire immagini 2D o 3D utilizzando le informazioni della fase arteriosa, con o senza tecniche di sottrazione (es. OsiriX Dicom Viewer). </li><li> Al fine di quantificare i parametri di vascolarizzazione da DCE-MRI, DCE-VCT e DCE-US, utilizzare gli strumenti software specifici per le modalità. Per DCE-MRI, determinare la vascolare parametri di ampiezza A (associato con volume di sangue) e il tasso di cambio costante k ep (associato a perfusione e permeabilità vasale) in metastasi ossee con Dyna Lab (Mevis Research, Brema, Germania) in base a due modello compartimentale di 8,9 Brix. Alternativi modelli farmacocinetici di valutazione sono disponibili, ad esempio il modello Tofts 10. </li><li> Per quantificare DCE-VCT di dati, eseguire una analisi descrittiva dei dati per calcolare i parametri come area sotto la curva (AUC) o di aumento del picco (PE) con Dyna Lab (Mevis Research, Brema, Germania). </li><li> Quantificare le informazioni in tempo reale DCE-US utilizzando il software di analisi quantitativa (ad esempio Qontrast, Bracco, Italia) analizzando cine-anelli secondo il modello bolo implementato iniezione. Posizionare la regione di interesse (ROI) sul metastasi ossee, determinare i fattori sia descrittivi come area sotto la curva o parametri quantitativi da colori diversi, ad esempio mappe del volume sanguigno regionale, il flusso sanguigno regionale e il tempo di riempimento. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Dopo l&#39;iniezione intrarteriosa di MDA-MB-231 cellule in mare (figura 1), sito-specifici metastasi ossee sviluppano nella rispettiva gamba posteriore del ratto nudo. Lesioni osteolitiche confinati al femore, tibia e perone possono essere esposte in modo non invasivo con MRI, VCT e degli Stati Uniti (Figura 2) a partire circa 25-30 giorni dopo l&#39;iniezione e follow-up per diverse settimane. Quando si combinano MRI, VCT e Stati Uniti compresi nativa e contrasto avanzate tecniche, informazioni complementari possono essere valutati in metastasi ossee che sono composte da un tessuto molletumore (le cellule tumorali e stroma) e la lesione osteolitica rispettiva (distruzione ossea). Per confronto dei dati tra i rispettivi tecniche, tutte e tre le modalità di imaging possono essere utilizzati in modo sequenziale nel ratto stesso. MRI mostra morfologia del tessuto osseo metastatico morbido che è inizialmente limitata alla cavità midollo osseo e supera successivamente osso corticale in corso di sviluppo. Parametri funzionali quali regionale volume di sangue, perfusione e permeabilità vasale può essere ottenuto da DCE-MRI e quantificato (Figura 3). Struttura ossea, e in particolare i cambiamenti osteolitiche delle metastasi sono valutati in alta risoluzione da VCT. Complementare ai risultati risonanza magnetica, le lesioni osteolitiche si trova adiacente al intramidollare la crescita tumorale. VCT angiografia rivela l&#39;architettura alterata macrovessel di metastasi ossee, e DCE-VCT mostra rispettivi aspetti del microcircolo (Figura 4). A causa della distruzione locale dell&#39;osso corticale in metastatilesioni c, US è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali del tumore dei tessuti molli mediante l&#39;uso di B-mode e tecniche Doppler. Su richiesta delle microbolle, DCE-ci permette in tempo reale immagini di vascolarizzazione nelle metastasi ossee (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig1.jpg" /> Figura 1. Zampa posteriore di un topo nudo preparata per l&#39;inoculazione delle cellule tumorali, come ripreso attraverso un microscopio operazione. A, modello di ramificazione dell&#39;arteria femorale (FA), compresa l&#39;arteria epigastrica superficiale (SEA), l&#39;arteria discendente genicular (DGA), poplitea (PA) e dell&#39;arteria safena (SA). Clip arteriosi immessi sul SA, PA e FA prossimale così come la legatura di mare; B, SEA è stato tagliato prossimale della legatura, C, rilassamento muscolare della VAS dopo l&#39;aggiunta di papaverina, D, incisione del SEA (ripreso da una pinza); E, l&#39;inserimento dell&#39;ago in SEA, F, l&#39;ago fissato nel mare (esterno fi<html> xating dispositivo) e l&#39;iniezione di MDA-MB-231 cellule tumorali attraverso la VAS nel DGA e PA in virtù delle clip. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig2.jpg" /> Figura 2 A, umana MR sistema (Symphony, Siemens, Germania) e una casa costruita bobina di radiofrequenza per l&#39;eccitazione e la rilevazione nello scanner;. B, a schermo piatto dotato tomografo volumetrico computerizzata (CT Volume, Siemens, Germania); C, ecografia clinica del sistema Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig3.jpg" /> Figura 3. Sezioni assiali MR. Pannello di sinistra, T2w RM; pannello centrale, di ampiezza A (DCE-MRI), pannello di destra, il tasso di cambio costante k ep (DCE-MRI). Le frecce indicano le metastasi ossee. La mappa a colori per DCE-MRI intervalli di dati dal rosso (valori elevati) a blu (valori bassi). 78/4178fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Ricostruzioni VCT 3D della metastasi osteolitiche (pannello sinistro) e una angiografia (pannello centrale) e un DCE-VCT sezione orientamento assiale dal parametro di aumento del picco (pannello destro). La mappa a colori per DCE-VCT intervalli di dati dal rosso (valori elevati) a blu (valori bassi). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini ecografiche da B-mode (morfologia, pannello di sinistra), Doppler (perfusione, pannello centrale) e CEUS (pannello di destra, di aumento del picco dopo l&#39;iniezione di microbolle di imaging in tempo reale della vascolarizzazione) di una metastasi ossee. Movie supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4178/4178movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film supplementare</a> .

<ol><li>Bäuerle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+model+with+site-specific+bone+metastasis+induced+by+MDA-MB-231+breast+cancer+cells+and+its+application+to+the+effects+of+an+antibody+against+bone+sialoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein.</a> Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo per indurre metastasi ossea sperimentale qui presentato in combinazione con le procedure di imaging permettono di follow-up lesioni osteolitiche in ratti nudi longitudinalmente. Nel nostro modello, MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno sono iniettati nel mare che è una anastomosi tra l&#39;arteria iliaca attraverso il tronco pudendoepigastric e l&#39;arteria femorale. Di conseguenza, il flusso di sangue nella regione fornito dell&#39;articolazione del ginocchio è mantenuta dopo la legatura del SEA. I vant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 delle cellule umane di cancro al seno </td><td> Type Culture Collection (ATCC) </td><td> HTB-26 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Invitrogen </td><td> 10270 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Carprofen Rimadyl </td><td> Pfizer </td><td> PZN 110208 </td></tr><tr><td> Magnevist </td><td> Bayer-Schering </td><td> PZN 6961516 </td></tr><tr><td> Imeron 400 MCT </td><td> Bracco </td><td> PZN 228654 </td></tr><tr><td> SonoVue </td><td> Bracco </td><td> PZN 1567358 </td></tr><tr><td> Papaverina </td><td> Alfa Aesar </td><td> L 04152 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter</td><td> HDG 9623 </td></tr><tr><td> Symphony (risonanza magnetica) </td><td> Siemens </td><td></td></tr><tr><td> Volume CT (tomografia computerizzata volumetrica) </td><td> Siemens </td><td></td></tr><tr><td> Acuson Sequioa 512 (ultrasuoni) </td><td> Siemens-Acuson </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-modal imaging di angiogenesi in un modello di ratto nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e ultrasuoni

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

L&#39;angiogenesi è un elemento essenziale della crescita del tumore e la formazione di metastasi. In metastasi ossee, fattori angiogenici sono fondamentali per la proliferazione delle cellule tumorali nella cavità midollo osseo, nonché per l&#39;interazione delle cellule tumorali e osso con conseguente distruzione ossea locale. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di metastasi ossee sperimentale che permette di valutare in vivo l&#39;angiogenesi nelle lesioni scheletriche con tecniche non invasive di imaging. Per questo scopo, abbiamo iniettato 10 5 MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno in arteria epigastrica superficiale, che preclude la crescita di metastasi in altre aree del corpo rispetto alla rispettiva gamba posteriore 1. Dopo 25-30 giorni dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali, site-specific di sviluppare metastasi ossee, limitatamente al femore distale, tibia prossimale e prossimale del perone 1. Aspetti morfologici e funzionali di angiogenesi può essere studiata longitudinalmente in meta osseastasi che utilizzano la risonanza magnetica (MRI), tomografia computerizzata volumetrica (VCT) ed ecografia (US). MRI mostra le informazioni morfologiche da parte dei tessuti molli delle metastasi ossee che viene inizialmente confinato alla cavità contenente il midollo osseo e supera successivamente l&#39;osso corticale durante la progressione. Utilizzo di contrasto dinamico-enhanced MRI (DCE-MRI) funzionali compresi i dati del volume ematico regionale, la perfusione e permeabilità vasale può essere ottenuto e quantificati 2-4. Distruzione del tessuto osseo viene catturato in alta risoluzione utilizzando l&#39;imaging morfologico VCT. Complementare ai risultati risonanza magnetica, le lesioni osteolitiche possono essere adiacente a siti di crescita del tumore intramidollare. Dopo l&#39;applicazione di contrasto, VCT angiografia rivela l&#39;architettura macrovessel nelle metastasi ossee in alta risoluzione, e DCE-VCT permette di comprendere a livello del microcircolo di queste lesioni 5,6. Degli Stati Uniti è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali da lesioni scheletriche a causa diosteolisi locale di osso corticale. Utilizzando B-mode e le tecniche Doppler, la struttura e la perfusione dei tessuti molli metastasi possono essere valutati, rispettivamente. DCE-ci permette in tempo reale immagini di vascolarizzazione in metastasi ossee dopo l&#39;iniezione di microbolle 7. In conclusione, in un modello di site-specific ossa tumore al seno metastasi multi-modali tra cui tecniche di imaging MRI, VCT offerta degli Stati Uniti e le informazioni complementari sulla morfologia e parametri funzionali di angiogenesi in queste lesioni scheletriche.

Nella patogenesi di metastasi ossea, l&#39;angiogenesi è un processo fondamentale e rappresenta quindi un bersaglio per l&#39;imaging e la terapia. Qui vi presentiamo un modello di ratto del site-specific metastasi ossee cancro al seno e strategie per descrivere in modo non invasivo l&#39;angiogenesi immagine<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e gli ultrasuoni.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

L'angiogenesi è una caratteristica essenziale della crescita tumorale e della formazione di metastasi. Nelle metastasi ossee, i fattori angiogenici sono fondamentali per le cellule tumorali...

Questo esperimento utilizza tecniche di imaging complementari per valutare in modo non invasivo l'angiogenesi in un modello ratto di cancro al seno. Per la metastasi ossea, si iniettano prima cellule tumorali umane del cancro al seno nell'arteria epigastrica superficiale per indurre metastasi ossee osteolitiche site-specific nella zampa posteriore di ratti nudi. Dopo 25-30 giorni, preparare l'animale per l'analisi mediante imaging ed acquisire i dati mediante risonanza magnetica, tomografia computerizzata ed ecografia.Successivamente, utilizzare i dati morfologici e funzionali complementari ottenuti mediante queste modalità di imaging per descrivere diversi aspetti della vascolarizzazione nelle lesioni osteolitiche. I risultati ottenuti comprendono l'architettura dei vasi macroscopici, il volume ematico locale, la perfusione e la permeabilità, nonché l'imaging in tempo reale della vascolarizzazione nelle metastasi ossee. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo dell'angiogenesi nella patogenesi delle metastasi ossee, con implicazioni per la diagnostica per immagini e il trattamento delle lesioni ossee maligne.Per il modello animale qui descritto, non è necessario utilizzare una sottolinea cellulare specifica per l'osso N-D-A-M-B 2 3 1 poiché la percentuale di attecchimento del tumore è superiore al 90%. Iniziare con una coltura logaritmica di cellule tumorali umane del carcinoma mammario in RPMI 1640. Il mezzo è integrato con il 10% di siero fetale bovino. Dopo aver raccolto le cellule tumorali subconfluenti mediante tripsina, enumerare le cellule utilizzando una camera di Neubauer e sospenderle in RPMI 1640. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Governo competente. Anestetizzare il ratto di sei-otto settimane come indicato nel testo allegato per la procedura chirurgica.Utilizzare un microscopio operatorio binoculare adeguato con un ingrandimento di 16 volte. Iniziare tagliando la cute e il tessuto sottocutaneo nella regione mediana per una lunghezza di due-tre centimetri. Procedere quindi dissezionando tutte le arterie che si diramano dall'arteria femorale, applicando clip sull'arteria femorale prossimalmente all'origine della S CA, nonché sulla DGA, PA e S SA per occludere temporaneamente il flusso sanguigno locale.Quindi legare l'arteria epatica superiore (SEA) nella sua parte distale per permettere l'apertura di questo vaso senza sanguinamento. Tagliare l'arteria epatica superiore (SEA) a monte della legatura e somministrare una soluzione al 1% di pipen sull'arteria epatica superiore (SEA). A questo punto, tagliare circa metà del diametro della s.e. con le forbici e, tenendo il capo reciso del vaso con una pinza, inserire un ago nella sua lume.Se possibile, fissare l'ago a un dispositivo esterno per ridurre i movimenti irregolari che potrebbero provocare una perforazione della parete vascolare. Quindi collegare una siringa all'ago. Rimuovere il clip dall'arteria femorale distale e posizionarlo sull'arteria safena. Procedere con l'iniezione lenta di 0,2 millilitri di cellule tumorali del seno MDA-MB-231 nell'arteria epigastrica superficiale. Notare che, grazie alle clip, le cellule vengono indirizzate verso la DGA e l'pa. Rimuovere l'ago e legare l'arteria epigastrica superficiale per prevenire emorragie, prima di togliere le clip arteriose.Dopo la chiusura della ferita e la cessazione dell'anestesia inalatoria, consentire da 25 a 30 giorni di crescita del tumore nell'animale. Utilizzare uno scanner RM sperimentale dedicato o un sistema RM per uso umano dotato di una bobina per animali appropriata, come questa bobina realizzata in laboratorio, per l'eccitazione e il rilevamento in radiofrequenza. Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e fluoruro di ISO, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda.Utilizzando del nastro, collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto. Successivamente, posizionare il ratto nel sistema di risonanza magnetica mantenendo l'anestesia inalatoria. Iniziare con una sequenza morfologica di risonanza magnetica per localizzare la metastasi ossea.Successivamente, individuare una sezione della metastasi ossea con il diametro maggiore e avviare la sequenza per D-C-E-M-R-I dopo circa 30 secondi. Iniziare a iniettare l'agente di contrasto in un periodo di tempo di 10 secondi. Scegliere un sistema TC appropriato, umano o sperimentale.Qui utilizziamo un prototipo di tomografo computerizzato volumetrico dotato di un pannello piatto. Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e isoflurano, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda utilizzando del nastro adesivo. Quindi collegare una siringa contenente mezzo di contrasto.Ora posizionare il ratto sullo scanner sotto anestesia inalatoria. Impostare i parametri di scansione per la TCV. Sono disponibili diversi sistemi ecografici sperimentali e clinici per questo scopo.Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e isoflurano, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda utilizzando un nastro adesivo. Quindi collegare una siringa contenente un agente di contrasto a microbolle. Fissare il trasduttore ecografico alla zampa posteriore corrispondente utilizzando un treppiede e applicare del gel ecografico tra il trasduttore e la zampa posteriore.Successivamente, eseguire la trasmissione in modalità B. Per determinare il diametro massimo della metastasi ossea e fissare la sonda in questa posizione, aggiungere il segnale Doppler alle immagini in modalità B per ottenere informazioni sulla perfusione tissutale. Tenere presente che solo le lesioni che alterano il tessuto osseo corticale sono accessibili alle onde ultrasoniche.Per l'ecografia con mezzo di contrasto dinamico, impostare il dispositivo ecografico in modalità cadenza con sequenza pulsata per il mezzo di contrasto, iniettare i microbolle e registrare un loop breve della durata di 90 secondi. Elaborare le informazioni morfologiche ottenute da M-R-I-V-C-T ed ecografia per caratterizzare il tumore del tessuto molle e la distruzione scheletrica delle metastasi ossee. Successivamente, determinare la localizzazione e il volume delle metastasi ossee utilizzando un visualizzatore DICOM per l'angiografia.Utilizzando il visualizzatore DICOM eRx, considerare i dati della TAC per ottenere il modello di ramificazione dei vasi nelle metastasi ossee. Ricostruire immagini 2D o 3D utilizzando le informazioni della fase arteriosa, con o senza tecniche di sottrazione. Per quantificare i parametri funzionali della vascolarizzazione provenienti dalla D-C-M-R-I-D-C-E-V-C-T e dall'ecografia con mezzo di contrasto dinamico (DCE), utilizzare strumenti software specifici per ciascuna metodica.Per la D-C-E-M-R, utilizzo Dyna Lab per determinare i parametri vascolari associati al volume ematico e alla costante di scambio correlate al flusso ematico e alla permeabilità vascolare nelle metastasi ossee. Per quantificare i dati D-C-E-V-C-T, effettuare un'analisi descrittiva dei dati al fine di calcolare parametri come l'area sotto la curva o il massimo di potenziamento. Quantificare inoltre le informazioni ottenute dall'ecografia DCE in tempo reale, utilizzando un software di analisi quantitativa mediante l'analisi di loop cinematografici. In base al modello di iniezione a bolo implementato, posizionare la regione di interesse sulla metastasi ossea per determinare fattori descrittivi come l'area sotto la curva oppure parametri quantitativi derivati da mappe codificate a colori.L'iniezione intraarteriosa di cellule M-D-A-M-B 2 31 nell'arteria epigastrica superficiale (SEA) è stata utilizzata per indurre metastasi ossee site-specific nell'arto posteriore corrispondente del ratto nudo. Questa immagine mostra il pattern di ramificazione dell'arteria femorale, inclusa l'arteria epigastrica superficiale, l'arteria femorale profonda, l'arteria poplitea e l'arteria safena. Le clip arteriose sono posizionate sull'arteria safena, sull'arteria poplitea (PA) e sulla porzione prossimale dell'arteria femorale (FA), oltre alla legatura dell'arteria epigastrica superficiale (SEA).L'SEA è quindi sezionato in prossimità della legatura e, dopo l'aggiunta di papaina, il muscolo della parete vascolare viene rilassato utilizzando pinzette. L'SEA viene inciso e un ago viene inserito nell'SEA mediante un dispositivo esterno di fissaggio dell'ago. Le cellule tumorali del carcinoma della mammella umano vengono iniettate attraverso l'SEA e indirizzate nell'DGA e nell'pa.Le lesioni osteolitiche da clipse, limitate a femore, tibia e perone, possono essere visualizzate in modo non invasivo mediante MRI, TC e ultrasuoni a partire da circa 25-30 giorni dopo l'iniezione e monitorate per diverse settimane. Tutte e tre le modalità di imaging possono essere utilizzate in modo sequenziale nello stesso ratto. L'MRI mostra la morfologia del tessuto molle metastatico osseo, inizialmente confinato alla cavità del midollo osseo e successivamente esteso oltre l'osso corticale nel corso dello sviluppo.In queste sezioni assiali, l'immagine RM pesata in T2 mostra la componente dei tessuti molli della metastasi ossea e le mappe colorate D-C-E-M-R-I mostrano i valori di ampiezza A e della costante di velocità di scambio all'interno della struttura ossea della lesione; in particolare, le alterazioni osteolitiche nelle metastasi vengono valutate in alta risoluzione mediante VCT, complementare ai reperti della RM. Le lesioni OSTEOLITICHE si trovano adiacenti alla crescita tumorale intramidollare. L'angiografia con VCT rivela l'architettura alterata dei vasi macroscopici delle metastasi ossee e la D-C-E-V-C-T mostra gli aspetti corrispondenti della microcircolazione dovuti alla distruzione locale del tessuto osseo corticale nelle lesioni metastatiche. L'ecografia è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali del tumore dei tessuti molli mediante l'uso delle tecniche in modo B e Doppler.Dopo l'applicazione di microbolle, l'ecografia con contrasto dinamico consente l'acquisizione in tempo reale dell'immagine della vascolarizzazione nelle metastasi ossee. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come inoculare cellule tumorali per ottenere un carcinoma mammario sito-specifico e metastasi ossee, al fine di analizzare aspetti morfologici e funzionali dell'angiogenesi in queste lesioni in modo non invasivo.

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