Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Questo esperimento utilizza tecniche di imaging complementari per valutare in modo non invasivo l'angiogenesi in un modello ratto di cancro al seno. Per la metastasi ossea, si iniettano prima cellule tumorali umane del cancro al seno nell'arteria epigastrica superficiale per indurre metastasi ossee osteolitiche site-specific nella zampa posteriore di ratti nudi. Dopo 25-30 giorni, preparare l'animale per l'analisi mediante imaging ed acquisire i dati mediante risonanza magnetica, tomografia computerizzata ed ecografia.

Successivamente, utilizzare i dati morfologici e funzionali complementari ottenuti mediante queste modalità di imaging per descrivere diversi aspetti della vascolarizzazione nelle lesioni osteolitiche. I risultati ottenuti comprendono l'architettura dei vasi macroscopici, il volume ematico locale, la perfusione e la permeabilità, nonché l'imaging in tempo reale della vascolarizzazione nelle metastasi ossee. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo dell'angiogenesi nella patogenesi delle metastasi ossee, con implicazioni per la diagnostica per immagini e il trattamento delle lesioni ossee maligne.

Per il modello animale qui descritto, non è necessario utilizzare una sottolinea cellulare specifica per l'osso N-D-A-M-B 2 3 1 poiché la percentuale di attecchimento del tumore è superiore al 90%. Iniziare con una coltura logaritmica di cellule tumorali umane del carcinoma mammario in RPMI 1640. Il mezzo è integrato con il 10% di siero fetale bovino. Dopo aver raccolto le cellule tumorali subconfluenti mediante tripsina, enumerare le cellule utilizzando una camera di Neubauer e sospenderle in RPMI 1640. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Governo competente. Anestetizzare il ratto di sei-otto settimane come indicato nel testo allegato per la procedura chirurgica.

Utilizzare un microscopio operatorio binoculare adeguato con un ingrandimento di 16 volte. Iniziare tagliando la cute e il tessuto sottocutaneo nella regione mediana per una lunghezza di due-tre centimetri. Procedere quindi dissezionando tutte le arterie che si diramano dall'arteria femorale, applicando clip sull'arteria femorale prossimalmente all'origine della S CA, nonché sulla DGA, PA e S SA per occludere temporaneamente il flusso sanguigno locale.

Quindi legare l'arteria epatica superiore (SEA) nella sua parte distale per permettere l'apertura di questo vaso senza sanguinamento. Tagliare l'arteria epatica superiore (SEA) a monte della legatura e somministrare una soluzione al 1% di pipen sull'arteria epatica superiore (SEA). A questo punto, tagliare circa metà del diametro della s.e. con le forbici e, tenendo il capo reciso del vaso con una pinza, inserire un ago nella sua lume.

Se possibile, fissare l'ago a un dispositivo esterno per ridurre i movimenti irregolari che potrebbero provocare una perforazione della parete vascolare. Quindi collegare una siringa all'ago. Rimuovere il clip dall'arteria femorale distale e posizionarlo sull'arteria safena.

Procedere con l'iniezione lenta di 0,2 millilitri di cellule tumorali del seno MDA-MB-231 nell'arteria epigastrica superficiale. Notare che, grazie alle clip, le cellule vengono indirizzate verso la DGA e l'pa. Rimuovere l'ago e legare l'arteria epigastrica superficiale per prevenire emorragie, prima di togliere le clip arteriose.

Dopo la chiusura della ferita e la cessazione dell'anestesia inalatoria, consentire da 25 a 30 giorni di crescita del tumore nell'animale. Utilizzare uno scanner RM sperimentale dedicato o un sistema RM per uso umano dotato di una bobina per animali appropriata, come questa bobina realizzata in laboratorio, per l'eccitazione e il rilevamento in radiofrequenza. Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e fluoruro di ISO, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda.

Utilizzando del nastro, collegare una siringa contenente il mezzo di contrasto. Successivamente, posizionare il ratto nel sistema di risonanza magnetica mantenendo l'anestesia inalatoria. Iniziare con una sequenza morfologica di risonanza magnetica per localizzare la metastasi ossea.

Successivamente, individuare una sezione della metastasi ossea con il diametro maggiore e avviare la sequenza per D-C-E-M-R-I dopo circa 30 secondi. Iniziare a iniettare l'agente di contrasto in un periodo di tempo di 10 secondi. Scegliere un sistema TC appropriato, umano o sperimentale.

Qui utilizziamo un prototipo di tomografo computerizzato volumetrico dotato di un pannello piatto. Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e isoflurano, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda utilizzando del nastro adesivo. Quindi collegare una siringa contenente mezzo di contrasto.

Ora posizionare il ratto sullo scanner sotto anestesia inalatoria. Impostare i parametri di scansione per la TCV. Sono disponibili diversi sistemi ecografici sperimentali e clinici per questo scopo.

Dopo aver anestetizzato il ratto con ossigeno e isoflurano, inserire un catetere nella vena della coda e fissarlo alla coda utilizzando un nastro adesivo. Quindi collegare una siringa contenente un agente di contrasto a microbolle. Fissare il trasduttore ecografico alla zampa posteriore corrispondente utilizzando un treppiede e applicare del gel ecografico tra il trasduttore e la zampa posteriore.

Successivamente, eseguire la trasmissione in modalità B. Per determinare il diametro massimo della metastasi ossea e fissare la sonda in questa posizione, aggiungere il segnale Doppler alle immagini in modalità B per ottenere informazioni sulla perfusione tissutale. Tenere presente che solo le lesioni che alterano il tessuto osseo corticale sono accessibili alle onde ultrasoniche.

Per l'ecografia con mezzo di contrasto dinamico, impostare il dispositivo ecografico in modalità cadenza con sequenza pulsata per il mezzo di contrasto, iniettare i microbolle e registrare un loop breve della durata di 90 secondi. Elaborare le informazioni morfologiche ottenute da M-R-I-V-C-T ed ecografia per caratterizzare il tumore del tessuto molle e la distruzione scheletrica delle metastasi ossee. Successivamente, determinare la localizzazione e il volume delle metastasi ossee utilizzando un visualizzatore DICOM per l'angiografia.

Utilizzando il visualizzatore DICOM eRx, considerare i dati della TAC per ottenere il modello di ramificazione dei vasi nelle metastasi ossee. Ricostruire immagini 2D o 3D utilizzando le informazioni della fase arteriosa, con o senza tecniche di sottrazione. Per quantificare i parametri funzionali della vascolarizzazione provenienti dalla D-C-M-R-I-D-C-E-V-C-T e dall'ecografia con mezzo di contrasto dinamico (DCE), utilizzare strumenti software specifici per ciascuna metodica.

Per la D-C-E-M-R, utilizzo Dyna Lab per determinare i parametri vascolari associati al volume ematico e alla costante di scambio correlate al flusso ematico e alla permeabilità vascolare nelle metastasi ossee. Per quantificare i dati D-C-E-V-C-T, effettuare un'analisi descrittiva dei dati al fine di calcolare parametri come l'area sotto la curva o il massimo di potenziamento. Quantificare inoltre le informazioni ottenute dall'ecografia DCE in tempo reale, utilizzando un software di analisi quantitativa mediante l'analisi di loop cinematografici. In base al modello di iniezione a bolo implementato, posizionare la regione di interesse sulla metastasi ossea per determinare fattori descrittivi come l'area sotto la curva oppure parametri quantitativi derivati da mappe codificate a colori.

L'iniezione intraarteriosa di cellule M-D-A-M-B 2 31 nell'arteria epigastrica superficiale (SEA) è stata utilizzata per indurre metastasi ossee site-specific nell'arto posteriore corrispondente del ratto nudo. Questa immagine mostra il pattern di ramificazione dell'arteria femorale, inclusa l'arteria epigastrica superficiale, l'arteria femorale profonda, l'arteria poplitea e l'arteria safena. Le clip arteriose sono posizionate sull'arteria safena, sull'arteria poplitea (PA) e sulla porzione prossimale dell'arteria femorale (FA), oltre alla legatura dell'arteria epigastrica superficiale (SEA).

L'SEA è quindi sezionato in prossimità della legatura e, dopo l'aggiunta di papaina, il muscolo della parete vascolare viene rilassato utilizzando pinzette. L'SEA viene inciso e un ago viene inserito nell'SEA mediante un dispositivo esterno di fissaggio dell'ago. Le cellule tumorali del carcinoma della mammella umano vengono iniettate attraverso l'SEA e indirizzate nell'DGA e nell'pa.

Le lesioni osteolitiche da clipse, limitate a femore, tibia e perone, possono essere visualizzate in modo non invasivo mediante MRI, TC e ultrasuoni a partire da circa 25-30 giorni dopo l'iniezione e monitorate per diverse settimane. Tutte e tre le modalità di imaging possono essere utilizzate in modo sequenziale nello stesso ratto. L'MRI mostra la morfologia del tessuto molle metastatico osseo, inizialmente confinato alla cavità del midollo osseo e successivamente esteso oltre l'osso corticale nel corso dello sviluppo.

In queste sezioni assiali, l'immagine RM pesata in T2 mostra la componente dei tessuti molli della metastasi ossea e le mappe colorate D-C-E-M-R-I mostrano i valori di ampiezza A e della costante di velocità di scambio all'interno della struttura ossea della lesione; in particolare, le alterazioni osteolitiche nelle metastasi vengono valutate in alta risoluzione mediante VCT, complementare ai reperti della RM. Le lesioni OSTEOLITICHE si trovano adiacenti alla crescita tumorale intramidollare. L'angiografia con VCT rivela l'architettura alterata dei vasi macroscopici delle metastasi ossee e la D-C-E-V-C-T mostra gli aspetti corrispondenti della microcircolazione dovuti alla distruzione locale del tessuto osseo corticale nelle lesioni metastatiche. L'ecografia è applicabile per valutare le caratteristiche morfologiche e funzionali del tumore dei tessuti molli mediante l'uso delle tecniche in modo B e Doppler.

Dopo l'applicazione di microbolle, l'ecografia con contrasto dinamico consente l'acquisizione in tempo reale dell'immagine della vascolarizzazione nelle metastasi ossee. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come inoculare cellule tumorali per ottenere un carcinoma mammario sito-specifico e metastasi ossee, al fine di analizzare aspetti morfologici e funzionali dell'angiogenesi in queste lesioni in modo non invasivo.