Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre seta sintetica di ragno imitando il processo naturale di filatura della seta per replicare in laboratorio il processo di filatura della seta. Grandi quantità di proteina ricombinante della seta vengono prodotte in batteri, purificate mediante cromatografia e concentrate mediante liofilizzazione. La proteina viene solubilizzata e la soluzione di filatura viene spinta attraverso una siringa munita di un ago dal diametro ridotto in un bagno di alcol disidratante.

Infine, le fibre sintetiche appena prodotte vengono sottoposte a un allungamento post-filatura al fine di migliorare l'orientamento molecolare delle catene proteiche. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettrofilatura o la filatura a secco è il costo ridotto, la facilità di manipolazione e la possibilità di ampliare il processo in una produzione su larga scala. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di una nuova classe di biomateriali.

Questi materiali possono essere utilizzati per un'ampia gamma di applicazioni differenti, come suture, protezioni balistiche e corde per strumenti musicali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proprietà dei filati di ragno, può essere applicato anche allo studio di altri tipi di biopolimeri prodotti da proteine ricombinanti. In generale, chi si avvicina per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché richiede competenze in molteplici discipline, tra cui bioingegneria, biofisica, biologia cellulare e molecolare e biochimica.

L'idea di questo metodo è nata quando abbiamo avuto la necessità di riprodurre il processo naturale di filatura compiuto dal ragno, al fine di produrre fibre sintetiche. Per generare il plasmide che verrà utilizzato per la produzione della seta di ragno, il cDNA desiderato della seta di ragno viene amplificato mediante specifici set di primer e ligato in un vettore di espressione procariotico, come PBA topo thio fusion. Questo vettore presenta un marcatore N-terminale di tioridossina per facilitare la solubilizzazione della proteina della seta e un marcatore C-terminale a sei x istidina (his tag) per la purificazione della proteina.

Dopo la ligazione, i prodotti di ligazione vengono trasformati in cellule di e coli competenti e viene coltivata una colonia contenente il plasmide. L'espressione della proteina della seta di ragno viene quindi indotta aggiungendo aose e le cellule vengono centrifugate e conservate a meno 80 gradi Celsius fino all'uso per lisare le cellule batteriche. Aggiungere 20 millilitri di un x tampone di lisi al pellet cellulare per sospendere completamente le cellule. Successivamente, per favorire un'ulteriore lisi cellulare, aggiungere lisozima fino a una concentrazione di un milligrammo per millilitro per digerire il DNA cromosomico, riducendo così la viscosità della soluzione a 100 microgrammi di DNA.

Quindi posizionare il campione su un agitatore orbitale e agitare delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente. Sottoporre la soluzione a sonificazione per un minuto al livello 19 per chiarificarla, quindi centrifugare a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, verificare che il soprannatante sia non viscoso e limpido; se la soluzione risulta viscosa e torbida, aggiungere ulteriore DNA, quindi sottoporre nuovamente a sonificazione e centrifugare per recuperare il soprannatante.

Una volta che il sopranatante è limpido, trasferirlo in una colonna pulita da 25 millilitri BioRad poly prep per la cromatografia di affinità con colonna al nitrilotr acetico (NTA) nickelato. Per purificare la proteina fusa, aggiungere un millilitro di sospensione di NTA nickelato contenente 0,5 millilitri di perle alla colonna, chiudere bene il tappo e il rubinetto, quindi posizionare la colonna su un agitatore per un'ora per favorire l'equilibrazione e consentire il legame del marcatore his a sei X alle perle di NTA nickelato. Posizionare la colonna in posizione verticale su un supporto e lasciare sedimentare le perle di NTA nickelato per circa due minuti.

Quando le perline si sono completamente depositate, si può osservare uno strato di colore blu chiaro sul fondo. Rimuovere il tappo e far scorrere la soluzione attraverso il rubinetto. Raccogliere la soluzione in un tubo conico da 15 millilitri.

Per ulteriori analisi, aggiungere 20 millilitri di tampone di lavaggio 1x e lasciare sedimentare le barbabietole. Aprire il rubinetto e raccogliere il flusso in quattro aliquote da cinque millilitri. Per ulteriori analisi, conservare le aliquote a quattro gradi Celsius o a meno 80 gradi Celsius rispettivamente per conservazione a breve o lungo termine.

Si noti che volumi aggiuntivi di lavaggio possono essere utilizzati per ridurre le proteine contaminanti, tuttavia ciò potrebbe ridurre il rendimento proteico complessivo. Successivamente, aggiungere 20 millilitri di tampone di eluizione 1x e lasciare sedimentare la resina, aprire il rubinetto e lasciare defluire la soluzione. Raccogliere questa soluzione, che contiene 20 millilitri, in quattro aliquote da cinque millilitri per ulteriori analisi.

Conservare a quattro gradi Celsius o a ottanta gradi sotto zero rispettivamente per la conservazione a breve o a lungo termine. Si noti che ulteriori volumi di eluizione possono essere raccolti dalla resina al nitrilotriacetato di nichel se necessario. Successivamente, separare le proteine in base alle loro masse molecolari.

Mediante analisi SDS-PAGE, visualizzare le proteine con argento o blu brillante di Coomassie R 250; utilizzare solo frazioni pure per i passaggi successivi. Confermare l'identità della proteina purificata mediante analisi Western blot; per rimuovere i sali e concentrare la proteina, effettuare la dialisi e liofilizzare il campione seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato, quindi conservare i campioni liofilizzati a meno 80 gradi Celsius. Lo scopo dei passaggi successivi è preparare la soluzione e la siringa per il processo di filatura, operando sotto cappa di sicurezza.

Aggiungere con attenzione la quantità appropriata di HEXA fluoro, ISOPROPANOL o HFIP in ogni provetta contenente il polvere proteica essiccata per ottenere una concentrazione di 200 milligrammi per millilitro fino a 500 milligrammi per millilitro, oppure dal 20% al 50% peso/volume. Chiudere immediatamente la provetta dopo l'aggiunta di HFIP, sigillare le provette e posizionarle su un agitatore per favorire la solubilizzazione della proteina mediante vortex. Questo processo può richiedere fino a due giorni.

Dopo la solubilizzazione, centrifugare il campione a 16.000 G per due o tre minuti. Una volta che la proteina è in soluzione, viene definita "dope" di filatura. La soluzione sarà estremamente viscosa.

Assicurarsi che non siano presenti aggregati poiché potrebbero intasare la siringa. Nel passaggio successivo, caricare con attenzione almeno 25 microlitri della soluzione polimerica in una siringa Hamilton Gast tight dotata di un ago con diametro interno di 127 micron, tenendo la siringa con l'ago rivolto verso l'alto e premendo lo stantuffo. È molto importante rimuovere le bolle d'aria poiché creerebbero irregolarità nella fibra.

Successivamente, fissare la siringa a un apparato Harvard, pompa per siringa 11 plus. Posizionare un becher da 400 millilitri riempito al 95% di isopropanolo su un supporto mobile in modo che la punta della siringa rompa appena la superficie dell'alcol. Impostare la pompa per siringa a 15 microlitri al minuto e premere start.

L'estrazione della fibra. Dovrebbe richiedere circa uno o due minuti, a seconda del volume iniziale della soluzione per la filatura. Una volta che tutta la soluzione è stata trasformata in fibra, lasciare la fibra in isopropanolo per 20 minuti affinché raggiunga un completo equilibrio.

Successivamente, il campione viene raccolto utilizzando un dispositivo avvolgente. Il dispositivo avvolgente utilizzato in questo caso è stato realizzato incollando pettini metallici su un calibro digitale. Come mostrato in questa immagine, applicare del nastro adesivo bifacciale su entrambi i lati del pettine del dispositivo avvolgente.

Quindi collegare il dispositivo avvolgitore a un motore. Impostare il motore in modo da avvolgere i filamenti a due giri al minuto. Successivamente, utilizzando una pinzetta, afferrare delicatamente un'estremità della fibra e tirarla lentamente fuori dall'isopropanolo.

Attaccarlo al bordo di uno dei bracci del pettine sul rocchetto. Utilizzando il nastro adesivo doppia faccia, eseguire i prossimi passaggi senza interruzioni per evitare che le fibre si secchino. Accendere il motore e utilizzare una bacchetta di vetro per guidare delicatamente la fibra sul dispositivo di avvolgimento.

Non permettere alla fibra di raddoppiarsi e sovrapporsi. Il nastro adesivo doppio. Deve impedire che l'intera fibra scivoli e consentire un allungamento selettivo dei segmenti interni delle fibre all'interno dei bracci del calibro.

Una volta avvolta completamente la fibra, staccare la bobina dal motore e applicare colla sul bordo di ciascuna fibra di seta sul nastro adesivo doppiofaccia. Questo fissa la seta di ragno sull'apparecchiatura. Collegare la bobina all'attuatore lineare per eseguire lo stiramento post-estrusione.

Determinare la lunghezza iniziale delle fibre utilizzando il C. Questa è la lunghezza interna della fibra. Non include la lunghezza incollata e avvolta attorno alla bobina. Immergere la bobina in un bagno di isopropanolo al 75%.

Lasciare equilibrare le fibre per 10 minuti. Impostare la velocità dell'attuatore lineare a 1,5 millimetri al secondo. Sulla base della lunghezza iniziale, calcolare la lunghezza finale per il rapporto di trafilaggio desiderato.

L'allungamento può essere controllato in base alla velocità o alla lunghezza, a seconda dell'allestimento. Ad esempio, con una lunghezza iniziale di 15 millimetri e un rapporto di trazione desiderato post-stiramento di tre x, la lunghezza finale dovrebbe essere di 45 millimetri. Ciò può essere calcolato anche come l'alimentazione dell'attuatore lineare per 20 secondi a una velocità di 1,5 millimetri al secondo.

In secondo luogo, una volta completato il prelievo dal contenitore, sollevare lentamente la bobina dall'isopropanolo. Attendere un minuto per permettere l'evaporazione delle gocce di isopropanolo e raccogliere i campioni. Per prima cosa, tagliare un'estremità della fibra tenendo l'altra estremità con una pinzetta.

Tagliare quell'estremità e montare la fibra su telai in cartoncino o fogli di alluminio per scopi di prova. Se si desiderano ulteriori rapporti di trafilaggio post bin, abbassare nuovamente la bobina nel bagno di isopropanolo al 75%. Lasciare che le fibre raggiungano l'equilibrio per 10 minuti, quindi procedere al successivo post bin.

Rapporto di trafilaggio. Registrare l'umidità e la temperatura, che potrebbero influire sulle fibre. Proprietà meccaniche.

Lasciare che i campioni raccolti raggiungano l'equilibrio con l'ambiente standard del laboratorio. Un'umidità del 40% e una temperatura di 25 gradi Celsius sono ideali per almeno un'ora prima dei test meccanici. Con la fibra montata sul telaio di cartoncino, applicare colla istantanea ai bordi del cartoncino o della pellicola per fissare la fibra sul telaio.

Prendere nota della dimensione dell'apertura del telaio. Questa è la lunghezza iniziale della fibra testata. Qui viene mostrato un telaio con apertura di un pollice, utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 100 x o superiore per effettuare le misurazioni del diametro lungo l'asse longitudinale della fibra.

Devono essere registrate almeno tre misurazioni. Maggiore è l'ingrandimento utilizzato e maggiore è il numero di misurazioni effettuate, migliore sarà l'accuratezza. Fissare il telaio in cartoncino rigido a un telaio meccanico di carico tenter.

Quindi tagliare il telaio su entrambi i lati in modo che la tensione agisca solo sulla fibra. Strappare il tensore e raccogliere i dati. Si raccomanda una velocità di deformazione standard del 2% al secondo.

La procedura di raccolta dei dati meccanici può variare a seconda del marchio del tenter utilizzato negli studi. Utilizzando i dati raccolti sul diametro medio, è possibile tracciare un diagramma tensione-deformazione in Microsoft Excel. La fibra rotta può ora essere montata su un microscopio elettronico a scansione, Stu, per l'analisi morfologica e le misurazioni del diametro nel punto di rotture.

Il segmento di fibra lontano dal punto di rottura può essere utilizzato per stimare e verificare il diametro iniziale misurato al microscopio ottico. La proteina della seta di ragno MASP uno è stata espressa e purificata da batteri per determinare la purezza della proteina prima della filatura della fibra; le proteine sono state sottoposte a frazionamento per dimensione. Mediante analisi SDS-PAGE seguita da visualizzazione con colorazione argentica, come mostrato qui, le sei soluzioni rivelano che la maggior parte del campione viene rilasciata entro le prime quattro frazioni.

La proteina della seta del ragno TUSP one è stata inoltre prodotta seguendo il protocollo qui presentato ed è stata filata in fibre per determinare le proprietà meccaniche della forma tubulare sintetica. Le fibre sono state filate e sono stati effettuati successivi allungamenti con rapporti crescenti. I colori in questa immagine mostrano fibre sottoposte a diversi rapporti di allungamento successivo compresi tra 2,5 x e 6 x. Le fibre mostrano una bassa variabilità all'interno del rispettivo gruppo di rapporto.

All'aumentare dei rapporti di tiro, la resistenza della fibra aumenta mentre l'estensibilità diminuisce. Tuttavia, le fibre hanno mostrato livelli equivalenti di tenacità. Per valutare l'ultrastruttura delle fibre mediante microscopia elettronica a scansione, sono state acquisite immagini di fibre filate a partire da proteine ricombinanti di tsp uno, come mostrato qui. La superficie esterna liscia è visibile a un ingrandimento di 500 x e a 5.000 ingrandimenti.

Il denso nucleo interno può essere osservato attraverso una frattura naturale della fibra. Ciò suggerisce che le proteine ricombinanti si assemblano e si impaccano correttamente durante il processo di estrusione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 giorni se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante rimuovere tutto il sale dalla proteina ricombinante purificata prima del passaggio di liofilizzazione e assicurarsi anche di utilizzare la corretta concentrazione della soluzione polimerica per evitare l'occlusione dell'ago durante il processo di estrusione. Seguendo questa procedura, altre fibroine, come mes, P one TUSB one e P ysb one, possono essere filate in fibre singole o come materiali compositi al fine di produrre un'ampia gamma di biomateriali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria biomedica e delle scienze dei materiali per esplorare l'uso delle sete sintetiche del ragno in applicazioni con ricadute nel settore militare, medico, artistico, sportivo e automobilistico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come produrre filamenti di seta sintetica o materiali compositi utilizzando proteine purificate da batteri. Non dimenticare che lavorare con AFib può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'operare sotto cappa chimica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.