Name: Flusso Cytometry basata Purificazione S. cerevisiae Zigoti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Scopri un metodo di citometria a flusso per purificare zigoti di Saccharomyces cerevisiae con purezza del 90%. Questa tecnica consente studi dettagliati sulla biologia dei zigoti e la transizione da aploidi a diploidi.

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Ringraziamo il Dott. R. Michael Sramkoski per un aiuto con citometria a flusso, il dottor Purnima Jaiswal e il Dr. Di Wu per prima input e Ilya Aylyarov per un aiuto con le illustrazioni. Supportato da NIH Grant R01GM089872 e la Citometria e Microscopia strumento Imaging Core del Comprehensive Cancer Center, causa (P30 CA43703).

1. La crescita delle cellule aploidi <ol><li> Grow S. cellule di Saccharomyces dallo sfondo S288C (BY4741) in condizioni standard 10. </li><li> Trasforma aploidi per esprimere uno dei due marcatori fluorescenti cospicui 10. I marcatori di scelta sono GFP solubili espressa nel citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizzato con BglII 11) e una singola proteina ribosomale, RPL25, fuso con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, da A. Johnston). Ci aspettiamo che le equivalenti a due colori protocolli di purificazione potrebbe fare uso di altre proteine ​​fluorescenti brillanti che vengono sintetizzati dalle cellule aploidi parentali. In alternativa, la parete cellulare può essere etichettato con lectine fluorescenti. </li><li> Sulla purificazione giorno precedente zigote, inoculare 5 ml culture di ciascun tipo di cellula e crescere con agitazione per una notte a 23 ° C per raggiungere A600 non superiore a 1,0. Grow trasformanti GFP (ATY4442) in completo terreno sintetico di cui 2% di glucosio (CSM-glucosio) unand RPL25-mCherry trasformanti (ATY4552) in sintetico terreno selettivo privo uracile 10. Mantenere colture parallele di ciascun tipo cellulare con agitazione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Conduzione di una croce <ol><li> Regolare la densità ottica (A600) di ciascun campione di 1,0 in terreno fresco. [1 Unità di densità ottica ~ 3 x 10 7 cellule / ml] </li><li> Miscelare volumi uguali di due culture, vortice brevemente 3 volte, seguiti da un vortice più per 10 sec. </li><li> Preparare CSM-glucosio piatti. Le piastre sono identiche a quelle utilizzate per la crescita di routine e sono stati asciugati 45 min dopo la colata e solidificazione del agar 10. </li><li> Distribuire ben 20 40-ml goccioline della miscela 1 centimetro dal bordo della superficie di CSM-glucosio piastre. Quando le goccioline sono dapprima applicato alla superficie avviare il timer per misurare il tempo trascorso. Una volta che il liquido è stato assorbito (circa 30 min), coprire i piatti e lasciarli indisturbati a rootemperatura m. </li></ol> 3. Preparazioni raccolta <ol><li> Campioni raccolto dopo 1,75-2,5 hr a 23 ° C lavando ripetutamente singole goccioline secche dalla piastra usando 150 ml di glucosio-CSM freddo, mantenendo le piastre in ghiaccio. Ripetutamente lavare gocciolina 10-20 volte con lo stesso mezzo di massimizzare il recupero. Raccogliere in 15 ml provette Falcon su ghiaccio. </li><li> Sonda ultrasuoni i campioni 10x al 60% di ampiezza con un sonicatore Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) su ghiaccio. </li><li> Verificare in un microscopio fase che aggrega poche o nessuna rimangono. 15-50% delle cellule sono attesi sono formate zigoti a questo punto. </li><li> Lasciare il tubo di cellule in posizione verticale indisturbata in ghiaccio per 10 min quale ulteriore misura precauzionale (per permettere di risolvere aggregati). </li><li> Recuperare il più in alto del 90% del volume e filtrare attraverso una rete di nylon (BD Falcon tubo in polipropilene con tappo filtro (Rif. 352235)). In un esperimento tipico, 10 7 cellulerecuperato da una piastra a questo punto erano diluiti in 4 ml di glucosio-CSM. </li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Ordinare le celle utilizzando la riflessione Sony iCyt Citometro modello di flusso, (altamente automatizzata ordine parallela) HAPS1 con una punta di 100 micron. Per eccitazione GFP, utilizzare il blu argon-ion, 250 milliwatt laser a 488 nm. Per eccitazione mCherry, utilizzare i 100 milliwatt laser a 561 nm. Anche se non si ha esperienza con altre macchine, ci aspettiamo che Becton Dickinson FACSAria, Becton Afflusso Dickson o Beckman Coulter MoFlo XDP sarebbe bene se equipaggiato con i laser corretti. </li><li> Base ordinamento parametri su un grafico a dispersione in avanti rispetto indietro per cancello cellule vitali. Stabilire una trama di emissione di 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) rispetto a 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) per dividere gli eventi in quattro quadranti, &quot;Rosso + Verde-&quot;, &quot;Rosso + Verde +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;e&quot; Rosso-Verde + &quot;(Figura S2). Utilizzare le cellule non fluorescente come f di serieo la determinazione del &quot;Red-Green-&quot; quadrante. </li><li> Celle di ordinamento con una pressione di 21,5 psi guaina, una frequenza gocciolina di 43.400 gocce / sec, e una pressione di 20,5 psi campione. </li><li> In ordine iniziale (&quot;Recovery Mode&quot;): Raccogliere i campioni in provette Eppendorf refrigerati contenenti 250 ml di freddo CSM-glucosio. Sedimenti 10 sec alla massima velocità in una microcentrifuga refrigerata (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirare la soluzione di flusso (citometria a flusso soluzione guaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Risospendere in 500 ml freddo CSM-glucosio. </li><li> Secondo tipo (&quot;Modalità Purezza&quot;): Condurre il tipo come per l&#39;ordinamento iniziale, usando la modalità &quot;purezza&quot; opzione. Sedimenti il ​​purificato le cellule e risospendere il pellet in 500 ml-1.0 ml CSM-glucosio. Agitare per 15 minuti in piastre da 24 pozzetti a 23 ° C per consentire il recupero metabolico. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopia <ol><li> Preparare pad agarosio come segue: portare una sospensione di 1,5% agarosio (ultrapuraAgarosio, Invitrogen, catalogo # 15.510-07) in CSM-glucosio a ebollizione, brevemente vortice, e quindi applicare campioni 0,3 ml della soluzione di agarosio alla superficie orizzontale vetrini standard e coprirli immediatamente con una seconda slitta (senza applicazione di pressione). </li><li> Dopo raffreddamento per 10 minuti, rimuovere delicatamente la slitta superiore facendolo scorrere orizzontalmente, avendo cura di lasciare una superficie liscia e non disturbare lo strato di agarosio. (Quando la slitta superiore è stato rimosso, il campione di cellule deve essere applicata entro 1-2 min. Quando tenuti in una camera umida a temperatura ambiente senza rimuovere la slitta superiore, tamponi possono essere conservati fino a un giorno prima dell&#39;uso.) </li><li> Campioni di sedimenti e depositi aliquote da 1 ml di pellet su pattini di agarosio (senza toccare la superficie). Immediatamente coprire il campione con un quadrato n ° 1 coprioggetto. Tagliare via l&#39;eccesso di agarosio con un unico taglio lametta. Sigillare le preparazioni con vaselina erogati da una siringa. </li><li> Immagine con Deltavision (Applied Precision) con un obiettivo 100x immersione in olio senza binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z-stack utilizzando il programma Softworx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) ed elaborare minimamente. Successive z-aerei sono stati generalmente raccolti a intervalli di 0,2-0,4 micron. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Livelli di intensità di fluorescenza in cellule aploidi trasformate: Il livello di fluorescenza nei aploidi è illustrato nella figura S1. Prima del, controinterrogatorio epifluorescente dimostrato che essenzialmente tutte trasformanti GFP erano verdi e che tutti i trasformanti mCherry, anche se spesso debole, erano rossi. Per garantire che tutte le cellule utilizzate per la croce erano effettivamente fluorescente, abbiamo utilizzato la sottopopolazione con la più brillante segnale fluorescente. Resa: Aopo l&#39;ordinamento iniziale, il Rosso Verde + campione + (figura S2) include in genere 8-20% del numero di ingresso di cellule e un numero eccessivo di cellule aploidi, forse a causa della persistente adesione cellula-cellula. Poiché arricchimento alta non si ottiene con una specie singola, il campione deve essere parzialmente purificato sonda sonicata due volte al 60% dell&#39;ampiezza seguita da re-ordinamento. (Sorta di recupero in genere una durata compresa tra 1-2 ore, mentre il secondo tipo richiede solo 15 min.) Delle cellule sottoposte al secondo tipo, i + Rosso Verde + campioni inclusi 23-52% delle celle di input. Esame microscopico Fase: Esame al microscopio a contrasto di fase è emerso che la purezza della preparazione zigote finale in media circa il 90% rispetto al 21 Preparazioni (che vanno dal 86% al 91%). I contaminanti erano o aploidi verdi o rossi, o coppie di aploidi che erano in contatto tra loro. Figura 3 cataloga la percentuale di zigoti che hannonessuna gemma, boccioli mediale (Med), germogli laterali (Lat) né boccioli terminali (Term), il numero di aploidi coppie dello stesso colore (&quot;2Same&quot;) o colore diverso (&quot;2Hap&quot;), aploidi e come singoli ( HAP). Quando le cellule sono state raccolte dopo 1,75 ore, più del 50% sono stati unbudded e le altre sottocategorie (mediale, con gemme laterali o terminali) erano ugualmente rappresentati. Dopo 2,5 ore ci sono stati numero approssimativamente uguale di zigoti in ciascuna delle quattro categorie (unbudded, con gemme mediale, laterale o terminale). Osservazioni al microscopio (Figura 4): La struttura di zigoti sembra rimanere invariato durante la purificazione. In base alla durata della croce, la popolazione ha avuto proporzioni diverse di zigoti unbudded e germogliato, come spiegato sopra. Poiché entrambi i aploidi verde e rosso mostrato notevoli variazioni di intensità del segnale fluorescente, alcuni zigoti erano prevalentemente rosso mentre altri erano prevalentemente verde, come si osserva dalla Comparing le singole immagini a colori alle immagini combinate in Figura 4. Si noti inoltre che la GFP (MW 26kDa) entra nel nucleo e può essere trovato nel nucleo anche quando i nuclei non sono fusi. Vacuoli spiccano come neri non fluorescenti sfere. Il prodotto finale di purificazione produce una popolazione variegata a vari stadi di sviluppo. Zigoti etichettati Una fusione non hanno subito. Di tipo B sono unbudded zigoti. Tipo C hanno una piccola gemma. Tipo D hanno un bocciolo più grande, e zigoti di tipo E sono in procinto di subire citochinesi. Si noti inoltre che molti dei zigoti precedenti presentano ancora un non fluorescente linea mediana divisione (*), e che la vacuolare &quot;struttura di ereditarietà&quot; (I) 12 può essere spesso visto estendersi dal zigote nella gemma. In alcuni casi, il segnale verde ha ridistribuito nel compagno in misura molto maggiore che il segnale rosso. Questo riflette il ritardo di trasferimento che è caratteristica di polisomi (Tartakoff, in preparazione). 6 zigoti, il che è sufficiente per molte immunoblot, utilizzando procedure rivelazione chemiluminescente. Usando fenolo-cloroformio protocolli di isolamento si estraggono circa 1,5 mg di RNA da questo numero di cellule. Poiché gli zigoti purificati sono stati refrigerati, prima di ulteriori analisi si consiglia di incubazione a 23 ° C in terreno di crescita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronologia della formazione dello zigote. Zigoti come intermedia tra aploidi e diploidi. Questo diagramma mostra l&#39;attivazione classica (shmooing) di aploidi, la loro fusione, e la formazione della gemma iniziale. Germogli può essere sia mediale (M), laterale (L) o terminale (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Schematica del protocollo di purificazione zigote. Dopo incubazione sulla superficie delle piastre di agar in mezzo completo con glucosio, la miscela di cellule è stato recuperato mediante lavaggio e quindi sottoposto ad un ordinamento iniziale in &quot;modalità di recupero&quot;, seguito da un secondo ordinamento in &quot;modalità purezza. &quot; Il colore giallo indica che sia mCherry e segnali GFP erano visibili nei zigoti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Varietà di zigoti nelle miscele di accoppiamento purificati frazioni. State raccolte dopo 1,75 o 2,5 ore per recuperare frazioni arricchite in zigoti relativamente precoci vs relativamente più maturo. Otto esperimenti indipendenti, indicati con i colori distinti, sono state eseguite per ciascun punto temporale. I grafici indicano i numeri relativi di zigoti che have spazialmente distinti modelli di formazione di gemme. Data la breve durata dell&#39;incubazione (meno di 2,5 ore a temperatura ambiente) tutte gemme osservati sono eventi iniziali zigotici erba. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. Esame DeltaVision di frazioni arricchite. Un tipico campo è stato esaminato al microscopio Deltavision. Le illustrazioni mostrano sia i colori sia rosso e verde o singolo. Il rosso corrisponde all&#39;etichetta polisomale (Rpl25p-mCherry) e il verde GFP citosolico. Nota l&#39;arricchimento elevato di zigoti, e le caratteristiche designate subcellulari: i (v) vacuoli, gemme (b), nucleo (n), &quot;struttura di ereditarietà&quot; vacuolare (i), e la partizione (*) che sembra separare il parentale domini in zigoti relativamente presto. Il loro colore variabile globale riflette l&#39;intensità relativa dei aploidi che fuse. Nei casi in cui i due domini parentali mantengonoun colore diverso, equilibrio dei marcatori (GFP citoplasmatica, mCherry-tagged polisomi) era incompleta. Time-lapse studi in corso mostrano che ridistribuisce GFP solubili prima polisomi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Supplementari Legends <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figura S1. Fluorescenza di cellule aploidi a sinistra:. Cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati esaminati per rilevare un segnale verde. La finestra rettangolare è stato impostato per evitare le cellule negative. Grafico Oriente: cellule che esprimono GFP citosolico sono stati analizzati, mostrando la popolazione nettamente luminosa principale di positivi. Più a destra: cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati analizzati. Il rettangolo (identico a quello all&#39;estrema sinistra) comprende più brillanti cellule e permette tuttinegativi da evitare. Il &quot;R2&quot; designazione indica la percentuale di cellule recuperate nel rettangolo indicato. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. Distribuzione cellulare in cernita prima e seconda. Questi due colori grafici indicano la percentuale di verde + rosso + cellule nel quadrante in alto a destra (R5). Questa percentuale sale al 52% del secondo tipo. Asse orizzontale: segnale verde. Asse verticale: segnale rosso.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La disponibilità di zigoti purificati dovrebbe facilitare gli studi biochimici tra cui trascrittomica, proteomica e lipidomica, nonché di indagine dei meccanismi attraverso i quali si sottopongono zigoti ciclo cellulare rientro, rimodellamento della parete cellulare, caratteristiche in erba e l&#39;ereditarietà, ecc In alternativa, zigoti possono essere generati a partire con ceppi caratteristici portatori di mutazioni in uno o entrambi i genitori. Inoltre, gli zigoti purificati, come per cellule aploidi o diploide, pos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / attrezzature </td><td> Fonte </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codifica GFP citoplasmatica 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codifica RPL25 fuso mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicatore </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tubo in polipropilene con tappo filtro </td><td> BD Falcon </td><td> Rif. 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifuga refrigerata </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Citometria di flusso soluzione guaina </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Riflessione Modello citometro a flusso </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvoluzione microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Montante microscopio a epifluorescenza </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM glucosio formulazione Note: Per le piastre di agar, è sufficiente includere il 2% agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flusso cytometry basata purificazione<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zigoti

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zigoti sono intermedi essenziali tra aploidi e diploidi stati del ciclo di vita di molti organismi, tra cui il lievito (Figura 1) 1. S. Saccharomyces zigoti risultato dalla fusione di cellule aploidi di tipo accoppiamento distinte (Mata, MATalpha) e danno luogo a corrispondenti diploidi stabili che successivamente generano ben il 20 progenie diploide a causa delle loro divisioni mitotiche sorprendentemente asimmetrica 2. Formazione dello zigote è orchestrato da una complessa sequenza di eventi: In questo processo, fattori solubili accoppiamento legano a recettori cognate, innescando cascate di segnalazione recettoriali che facilitano interruzione del ciclo cellulare e culminano fusione cellula-cellula. Zigoti può essere considerato un modello per la funzione delle cellule progenitrici o staminali. Anche se molto si è imparato a conoscere la formazione di zigoti e sebbene zigoti sono stati utilizzati per studiare cellule molecolari questioni di interesse generale signiicance, quasi tutti gli studi hanno fatto uso di miscele di accoppiamento in cui sono mescolati con una popolazione zigoti maggioranza di cellule aploidi 3-8. Molti aspetti della biochimica della formazione dello zigote e la vita continua dello zigote restano pertanto non indagato. Rapporti di purificazione di zigoti lievito descrivere i protocolli base alle loro proprietà di sedimentazione 9, tuttavia, questa procedura sedimentazione basata non cede quasi il 90% di purezza nelle nostre mani. Inoltre, ha lo svantaggio che le cellule sono esposte a sorbitolo ipertonica. Abbiamo quindi messo a punto un procedimento di purificazione versatile. A questo scopo, coppie di cellule aploidi esprimono proteine ​​fluorescenti verdi o rossi sono stati co-incubate per permettere la formazione zigote, raccolte in tempi diversi, e gli zigoti risultanti sono stati purificati utilizzando un protocollo basato citometria di flusso ordinamento. Questa tecnica fornisce una valutazione conveniente visiva di purezza e di maturazione. La purezza mediadella frazione è circa il 90%. Secondo i tempi di raccolta, zigoti diversi gradi di maturità possono essere recuperati. I campioni purificati forniscono un comodo punto di partenza per &quot;-omiche&quot; studi, per il recupero della progenie iniziale, e per lo studio sistematico di questa cellula progenitrice.

Per purificare zigoti di<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Cellule aploidi di tipo opposto accoppiamento sono stati progettati per esprimere proteine ​​fluorescenti rossi o verdi, co-incubate per permettere la formazione dello zigote, e frazionati con un protocollo basato citometria a flusso. Il altamente arricchito frazione consente la successiva &quot;-omiche&quot; studi, il recupero della progenie iniziale, e la ricerca sistematica della morfogenesi zigote.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Le zigoti sono intermedi essenziali tra gli stati aploidi e diploidi nel ciclo vitale di molti organismi, incluso il lievito (Figura 1) 1. S. cerevisiae ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare una popolazione purificata di zigoti di lievito. Questo risultato si ottiene innanzitutto esprimendo GFP citoplasmatico o polizone etichettate con M cherry. In cellule aploidi di tipo di accoppiamento opposto, le cellule vengono fatte crescere fino alla fase logaritmica, quindi combinate e incubate insieme per consentire la formazione dei zigoti.La miscela di accoppiamento viene quindi raccolta e separata mediante citometria a flusso in modalità di recupero, al fine di isolare le cellule doppio positive per il rosso e il verde. Questa sottopopolazione comprende sia entità pre zigotiche che zigotiche. Per ulteriore purificazione del campione, la popolazione doppio positiva per il rosso e il verde viene sottoposta a un secondo giro di ordinamento mediante citometria a flusso.Utilizzo della modalità di purezza. Questa procedura consente di ottenere una purezza media del 90% di zigoti, basata sull'esame visivo e sulla quantificazione delle cellule mediante microscopia fluorescente. I vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione basata sulla sedimentazione, sono i seguenti.Prima di tutto, questa tecnica fornisce una valutazione visiva pratica della purezza e della maturazione dello zigote. In secondo luogo, secondo le nostre osservazioni, la purezza media della frazione zigotica è di circa il 90%, molto più elevata rispetto ai metodi esistenti. Il nostro metodo di purificazione può contribuire a rispondere a importanti domande biologiche relative alla transizione da haploide a diploide nelle cellule eucariotiche a livello molecolare, poiché esiste una notevole conservazione tra eucarioti inferiori e superiori.Pertanto, lo studio dei zigoti di lievito dovrebbe favorire una comprensione generale della biologia degli zigoti. In modo discutibile, gli zigoti possono anche essere considerati un modello per la funzione delle cellule progenitrici o staminali. Coltivare s. cerevisiae, ceppo MATa e ceppo MATα BY4741. Seminare le cellule effettuando delle righe da ceppi congelati di lievito su un mezzo di crescita solido in agar e incubare le piastre a temperatura ambiente oppure a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie, il giorno precedente alla purificazione degli zigoti. Etichettare due provette coniche da 50 millilitri per la coltivazione dei tabulati trasformati come GFP solubile e RPL25-MCherry. Inoculare una coltura con tabulati trasformati che esprimono GFP solubile nel citoplasma e un’altra con tabulati trasformati che esprimono una singola proteina ribosomiale.RPL 25 fuso con m cherry. Far crescere le colture in agitazione durante la notte a 23 gradi Celsius per raggiungere un A 600, senza superare 1,0. Successivamente, per eseguire un incrocio, iniziare regolando la densità ottica di ogni campione a 1,0 in mezzo fresco, corrispondente approssimativamente a tre volte 10 alla settima cellule per millilitro.Successivamente, mescolare volumi uguali delle due colture in mezzo fresco, in un tubo conico da 50 millilitri. Vortexare brevemente per tre volte, quindi vortexare per 10 secondi. Posizionare una volta la punta di una pipetta a un centimetro sopra la superficie di una stanza.Piastra di glucosio CSM a temperatura controllata. Avviare un timer per un conteggio alla rovescia di 30 minuti e distribuire immediatamente gocce da 40 microlitri delle colture miste lungo la periferia della piastra, coprendo tutta la circonferenza. Lasciare asciugare le piastre sul banco con il coperchio rimosso per circa 30 minuti.Una volta che il liquido è stato assorbito, coprire le piastre e lasciarle indisturbate a temperatura ambiente per 1,75-2,5 ore. Il processo di crescita polarizzata determina la caratteristica morfologia simile a uno schmo. Durante la fase di schmo, le due cellule haid continuano a crescere l'una verso l'altra fino al contatto tra cellula e cellula.La successiva fusione tra cellule porta alla formazione dello zigote. Lo zigote nascente quindi reingressa nel ciclo cellulare mitotico, dando origine al suo primo gemmulo diploide. Al termine dell'incubazione, posizionare le piastre sul ghiaccio e raccogliere i campioni lavando singole aree di gocce essiccate da 10 a 20 volte con 150 microlitri di CSM glucosio freddo.Raccogliere la soluzione di lavaggio in provette coniche da 15 millilitri su ghiaccio. Successivamente, mantenendo i campioni sul ghiaccio, sottoporre ciascuna provetta a sonicazione con sonda per 10 volte al 60% di ampiezza. Dopo la sonicazione, verificare al microscopio a contrasto di fase che siano rimasti pochi o nessun aggregato; si prevede che dal 15 al 50% delle cellule abbia formato zigoti. A questo punto, lasciare la provetta con le cellule in posizione verticale, senza disturbarla, sul ghiaccio per 10 minuti come precauzione, in modo da permettere a eventuali aggregati rimanenti di sedimentare.Recuperare la parte superiore corrispondente al 90% del volume e filtrarla attraverso un tubo in polipropilene con maglia in nylon e tappo filtrante. In un esperimento tipico, si recuperano 10 alla settima potenza di cellule da una piastra e quattro millilitri di CSM. Il frazionamento cellulare in base al glucosio viene eseguito utilizzando un citometro a flusso modello Sony Eyesight Reflection con un HAPS dotato di punta da 100 micron.Cominciare selezionando i laser di eccitazione nel software win list 3D per l'eccitazione di GFP. Utilizzare il laser blu Argonne ion da 500 milliwatt a 488 nanometri per l'eccitazione di M cherry. Utilizzare il laser da 100 milliwatt a 561 nanometri nel software di controllo HAPS.Assicurarsi che sia selezionata la modalità di recupero e che la pressione del flusso di guida per l'ordinamento sia impostata a 21,5 libbre per pollice quadrato, con una frequenza di gocciolamento di 43.400 gocce al secondo e una pressione del campione di 20,5 libbre per pollice quadrato. Impostare i parametri di ordinamento basandosi su un grafico di scattering anteriore contro scattering posteriore al fine di selezionare le cellule vitali. Si noti che la macchina Sony Iysight utilizzata in questo caso indica in modo univoco il grafico di scattering laterale come scattering posteriore, ma questo scattering posteriore è funzionalmente equivalente allo scattering laterale. Stabilire un grafico di emissione di M cherry contro GFP per suddividere gli eventi in quattro quadranti.Rosso, verde positivo, rosso negativo, verde positivo, rosso positivo, verde negativo e rosso negativo, verde positivo. Utilizzare cellule non fluorescenti come standard per la determinazione del quadrante rosso negativo verde negativo. Per la separazione iniziale.Selezionare la modalità di recupero e raccogliere i campioni in provette da microcentrifuga refrigerate contenenti 250 millilitri di glucosio CSM freddo. Dopo il campionamento, sedimentare le cellule per 10 secondi alla velocità massima in una microcentrifuga refrigerata; al termine della centrifugazione, aspirare la soluzione di scarto e risospendere le cellule in 500 microlitri di glucosio CSM freddo.Poiché un elevato arricchimento non viene ottenuto con un singolo sorting, sottoporre brevemente a sonica il campione parzialmente purificato due volte al 60% di ampiezza. Eseguire nuovamente il sorting delle cellule, questa volta utilizzando l'opzione di gating in modalità purezza sulle cellule vitali e creare un grafico di emissione di M cherry versus GFP del sedimento, delle cellule purificate e risospendere i pellet in 0,5-1,0 millilitri di CSM glucosio. Dopo la centrifugazione, trasferire 0,5 millilitri in ciascun pozzetto di piastre a 24 pozzetti, quindi agitare le cellule per 15 minuti.In piastre da 24 pozzetti a 23 gradi Celsius per consentire il recupero metabolico. Per preparare i cuscinetti di agarosio, portare a ebollizione una sospensione di agarosio al 1,5% in CSM glucosio in un tubo conico da 15 millilitri. Vortexare brevemente la soluzione e quindi applicare campioni di 0,3 millilitri della soluzione di agarosio sulla superficie di almeno due o tre vetrini in vetro standard, coprendo immediatamente i vetrini con un secondo vetrino.Non applicare pressione. Lasciare raffreddare le lamelle per 10 minuti. Se i pad aros non verranno utilizzati immediatamente, collocarli in una camera umidificata a temperatura ambiente senza rimuovere la lamella superiore.Questi possono essere conservati fino a un giorno. Rimuovere quindi delicatamente la lamella superiore facendola scivolare in orizzontale, avendo cura di lasciare una superficie liscia e di non disturbare lo strato di aros; entro uno o due minuti, depositare rapidamente aliquote di un microlitro di cellule sedimentate sui cuscinetti di aros senza toccare la superficie.Coprire immediatamente il campione con un coperchio quadrato utilizzando una lama a bordo singolo per tagliare via l'eccesso di agarosio. Usare una siringa per applicare vaselina lungo i bordi del coperchio. Acquisire le immagini utilizzando un sistema Delta Vision con un obiettivo ad immersione in olio da 100x senza binning. Un campo ideale è quello che mostra un singolo strato di cellule con spazio sufficiente tra di esse per distinguere le singole cellule, acquisendo immagini a intervalli di 0,2-0,4 micron. Una volta completata l'acquisizione delle immagini.Elaborare Zacks utilizzando il programma Soft Works 5.0 0.0 ed elaborare minimamente con una deconvoluzione standard di 20 cicli. Regolare l'intensità della fluorescenza rossa rispetto a quella verde per ridurre al minimo qualsiasi segnale di fondo nelle immagini DeVol al fine di valutare l'espressione delle proteine fluorescenti nelle cellule trasformate; le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso prima e dopo aver eseguito un incrocio, prima dell'incrocio. Fondamentalmente, tutti i trasformanti M cherry erano rossi e tutti i trasformanti GFP erano verdi.Si noti che, sebbene il segnale di M cherry fosse meno intenso rispetto al segnale GFP, esso è stato rilevato sia mediante citometria che mediante microscopia a fluorescenza. Le cellule sono state ordinate e le cellule più brillanti, che appaiono nel quadrante R2, sono state selezionate e coltivate con il trasformante GFP per 2,5 ore, come mostrato qui. Il campione positivo per il rosso e il verde ha rappresentato l'8,89% della popolazione totale dopo l'incrocio.Questo valore è stato arricchito fino al 52,4% dopo il primo ordinamento di recupero, quindi ulteriormente arricchito mediante un secondo ordinamento di purezza, esaminando 21 preparazioni simili di cellule rosse positive e verdi positive al microscopio a contrasto di fase. Per valutare il numero di zigoti, la purezza media era del 90%. I contaminanti erano costituiti da singoli gameti (haplos) verdi o rossi, oppure da coppie di haplos a contatto, al fine di determinare la cinetica dell’emergenza iniziale del germoglio zigotico, nonché la frequenza e la distribuzione delle posizioni del germoglio zigotico mediale, laterale e terminale. Gli haplos sono stati incrociati per 1,75 ore o per 2,5 ore, quindi ordinati mediante citometria a flusso ed esaminati al microscopio epifluorescente.Quando le cellule sono state raccolte dopo 1,75 ore, più del 50% erano non germogliate e con gemme mediali. Dopo 2,5 ore, gemme laterali o terminali erano rappresentate in egual misura. Tuttavia, vi erano approssimativamente numeri uguali di zigoti in ciascuna delle quattro categorie: non germogliati con gemme mediali, laterali o terminali.La struttura dei zigoti sembra rimanere invariata durante la purificazione. Si noti che la GFP entra nel nucleo ed è possibile trovarla all'interno del nucleo anche quando i nuclei non si sono ancora fusi. Gli ES si distinguono come sfere nere non fluorescenti.Il prodotto finale della purificazione fornisce una popolazione diversificata in varie fasi di sviluppo. Gli zigoti etichettati come A non hanno subito fusione. Gli zigoti di tipo B non sono fecondati.Il tipo C presenta un piccolo gemmulo, il tipo D un gemmulo più grande, mentre i zigoti di tipo E sono in procinto di subire la citocinesi; si noti inoltre che molti zigoti precedenti mostrano ancora una linea di divisione mediana non fluorescente e che la struttura ereditaria valar spesso appare estendersi dallo zigote verso il gemmulo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale includere sia il sorting di recupero che il successivo sorting di purezza. Abbiamo riscontrato che il secondo sorting è essenziale per aumentare la purezza zigotica del prodotto finale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un incrocio, generare zigoti purificati mediante citometria a flusso, valutare la purezza con metodi microscopici e come montare e fotografare gli zigoti utilizzando microscopia fluorescente a deconvoluzione.

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