Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

Presentiamo un metodo per stabilire un modello ortotopico di tumore della vescica in topi immunocompromessi. Trattiamo questi tumori con RNA a doppio filamento di piccole dimensioni somministrato per via intravascolare e monitoriamo i tumori mediante ecografia della vescica e imaging bioluminescente. L'anestesia generale viene indotta con isof, fluoro in forma vaporizzata, e viene applicato un unguento oftalmico sterile.

Il topo viene quindi posizionato in posizione supina e l'anestesia viene mantenuta con isoflurano mediante cono nasale. Successivamente, è necessario cateterizzare il topo. Utilizziamo un catetere endovenoso da 24 gauge, dal quale è stato rimosso l'ago guida.

La cateterizzazione è spesso il passaggio più difficile e imprevedibile del protocollo. Un'abbondante lubrificazione con gel KY e una tecnica corretta sono fondamentali per una cateterizzazione di successo. Nell'immagine è mostrata l'area della vulva del topo.

L'uretra si trova appena sotto le pieghe vulvari. Dopo la lubrificazione, le pinze per catetere vengono utilizzate per afferrare delicatamente e stabilizzare la vulva e l'uretra. Inizialmente, si utilizza un angolo più ripido di 45 gradi per canulare l'uretra, ma una volta all'interno dell'uretra, si adotta un angolo più basso per entrare agevolmente nella vescica.

Mostreremo questo processo qui. Ancora una volta, una pressione pelvica delicata per raddrizzare l'uretra può spesso essere d'aiuto, ed è necessario fare attenzione a non spingere troppo contro una resistenza, poiché ciò potrebbe provocare la perforazione dell'uretra o della vescica. La presenza di urina visibile all'interno del catetere conferma la corretta posizione all'interno della cavità vescicale.

L'urina all'interno del catetere viene quindi rimossa con l'ago guida e il catetere viene lasciato in sede. Dovrebbero rimanere visibili all'esterno dell'uretra circa cinque millimetri di catetere, in modo che la punta del catetere resti all'interno della cavità vescicale e non aderisca alla parete della vescica. Se il catetere viene inserito troppo in profondità, la sua estremità potrebbe conficcarsi nella parete vescicale e impedire le iniezioni.

Per tutte le iniezioni successive. Una siringa caricata sull'ago guida viene inserita attraverso il catetere. Questo consente l'iniezione di volumi precisi eliminando lo spazio morto all'interno del catetere e rende inutili cateterizzazioni ripetute per creare una lesione da ustione alla parete della vescica.

Viene iniettato 10 microlitri di nitrato d'argento 0,5 molare e lasciato in stasi per 10 secondi. Il nitrato d'argento può formare un precipitato bianco con l'urina residua all'interno della vescica. Questo precipitato e qualsiasi soluzione rimanente vengono rimossi dal catetere.

Procediamo quindi a lavare la vescica con 100 microlitri di acqua sterile, ripetendo l'operazione quattro volte, rimuovendo ogni volta il liquido dal lume del catetere. Dopo il primo lavaggio, il precipitato bianco è ancora visibile all'interno del catetere, ma con ogni lavaggio il liquido diventerà sempre più limpido. Viene utilizzato un filo di seta 4-0 per occludere l'uretra e siamo ora pronti per iniettare le cellule tumorali.

Le cellule vengono caricate in una siringa collegata a un ago stiletto e iniettate nella vescica. Il catetere viene rimosso e l'uretra rimarrà legata con il topo sotto anestesia per due ore. A intervalli prestabiliti, si monitora la progressione del tumore.

Utilizzando l'immagine bioluminescente in vivo, i topi vengono iniettati prima con Lucifer e substrato mediante iniezione intraperitoneale. Dopo che l'anestesia generale è stata indotta con isoflurano vaporizzato, i topi vengono posizionati in posizione supina all'interno della macchina ivus. La bioluminescenza viene misurata in unità di fotoni al secondo.

La presenza di sette cellule KU all'interno della vescica dei topi è facilmente evidente e l'intensità della bioluminescenza può essere monitorata nel tempo. La presenza e la progressione dei tumori vescicali possono inoltre essere valutate mediante imaging ecografico. Dopo l'induzione dell'anestesia generale con isoflurano inalatorio, viene applicato un unguento oftalmico sterile.

Il topo viene posizionato in posizione supina sul tavolo ecografico. L'anestesia di mantenimento viene ottenuta con isoflurano mediante cono nasale. Le zampe posteriori del topo possono essere fissate al tavolo per evitare movimenti eccessivi del corpo durante la manipolazione della sonda ecografica.

Una volta completata questa fase, viene applicato del gel ecografico sulla porzione mediana del bacino dell'animale. Dopo aver applicato il gel, una sonda da 40 megahertz viene fissata al dispositivo di sostegno e abbassata lentamente sul corpo dell'animale. La vescica è chiaramente visibile come una struttura ipoechogena rotonda situata sulla linea mediana.

Se l'animale non ha subito un'irritazione significativa prima dell'anestesia, la vescica è tipicamente già distesa e abbiamo riscontrato che non è necessario cateterizzare il topo per ottenere la distensione della vescica. È possibile ottenere sia immagini trasversali che longitudinali. Un tumore è facilmente visibile all'interno della lume della vescica.

Se viene rilevato un tumore, le immagini possono essere salvate per misurarne le dimensioni. Dopo l'induzione del tumore vescicale, i topi vengono trattati per via intravesicale con piccole RNA a doppio filamento formulate in nanoparticelle lipidiche. Viene indotta l'anestesia generale e nuovamente applicato un unguento oftalmico.

Il mouse viene quindi posizionato in posizione supina e viene eseguita la cateterizzazione uretrale. Come descritto in precedenza, un filo di seta da quattro-oh viene utilizzato per occludere l'uretra intorno al catetere. Tipicamente, vengono fatti due nodi come mostrato qui.

Una siringa vuota montata su un ago con stiletto viene utilizzata per svuotare completamente la vescica. Vengono instillati per via intravesicale 50 microlitri di piccole RNA a doppio filamento per un dosaggio totale di tre milligrammi per chilogrammo. Successivamente, l'ago e il catetere vengono rimossi.

Il topo rimarrà anestetizzato con l'uretra occlusa per un totale di due ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di un metodo per creare un modello ortotopico di tumore della vescica nel topo, monitorando il tumore mediante imaging a bioluminescenza e ultrasuoni, e trattando il tumore con piccole RNA somministrate per via intravesicale. Esistono alcune sfumature nella tecnica, che richiede un po' di pratica, in particolare per quanto riguarda la cateterizzazione, ma nel complesso si tratta di un protocollo facilmente riproducibile.

Abbiamo ottenuto buoni risultati nell'innesto di tumori della vescica nei topi, e gli effetti del trattamento con l'RNA a piccole dimensioni sono molto promettenti. Tuttavia, ciò che rende particolarmente entusiasmante questo protocollo è che, sebbene abbiamo trattato i topi con RNA a piccole dimensioni, la stessa tecnica può essere utilizzata per testare qualsiasi terapia intravesicale per il cancro della vescica.I.