Name: Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in un modello murino fetale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri una tecnica chirurgica innovativa per la somministrazione endotracheale di agenti bioattivi nei feti di topo. Questo metodo migliora il targeting polmonare evitando la diluizione tipica delle iniezioni intra-amniotiche.

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MC e avdp dottorandi sono supportati da finanziamenti dell&#39;Istituto per la promozione dell&#39;innovazione attraverso la scienza e la tecnologia nelle Fiandre (IWT-Vlaanderen). JT ha una part-time Clinical Research Fellowship (KOOR) da UZ Leuven. DV è un collega di dottorato sostenuto da una borsa di KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC è un collega di dottorato sostenuto da una borsa di studio Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) ed Erasmus Mundus. La ricerca è stata finanziata da IWT-Vlaanderen, tramite la concessione CE DIMI (LSHB-CT-2005-512146) e dal vivo in Molecular Imaging Research Group (IMIR) dalla KU Leuven. Vorremmo riconoscere il Nucleo UPenn Vector fondata da James M. Wilson per la loro gentile dono della confezione AAV6.2 plasmide per la produzione di vettori rAAV.

<ol><li>Willson, D. F., Notter, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+exogenous+surfactant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Care%22%5BJournal%5D)">The future of exogenous surfactant therapy.</a> Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).</li>
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<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+phenotypic+correction+of+hemophilia+B+in+immunocompetent+mice+by+prenatal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy.</a> Blood. 104, 2714-2721 (2004).</li>
<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici <ul><li> Il ceppo di topi che abbiamo scelto di lavorare con i topi è NMRI perché hanno un numero abbondante di cuccioli (dimensione della cucciolata media 14,4 ± 1,8, dati personali), tollerano bene gli interventi e hanno buone caratteristiche materne. </li><li> Posizionare la stringa borsa attraverso la parete uterina e delle membrane fetali è un passaggio fondamentale, come si desidera solo esporre la testa fetale e non le spalle, altrimenti riposizionamento è quasi impossibile senza causare traumi....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> NMRI topi </td><td> Janvier, Le St Genest Isle, Francia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Regno Unito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prolene 6-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 5-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 microlitri Hamilton Vetro Siringa, modello 1710,5 TLLX SYR </td><td> Hamilton, Reno, NV, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 5495-20 </td><td></td></tr><tr><td> 30G ago appuntito </td><td> Hamilton, Reno, NV, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> 2% Xylocaine </td><td> AstraZeneca, Zoetermeer, Paesi Bassi </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatale somministrazione polmonare di cellule, geni o agenti farmacologici potrebbe fornire la base per nuove strategie terapeutiche per una varietà di malattie genetiche e acquisite. Oltre anomalie congenite o ereditaria con il requisito di lungo termine espressione del gene espresso, parecchi non-ereditate condizioni perinatali, dove a breve termine espressione genica o intervento farmacologico è sufficiente per ottenere effetti terapeutici, sono considerati potenziali indicazioni future per questo tipo di approccio. Malattie candidati per l&#39;applicazione della terapia a breve termine prenatale potrebbe essere la carenza transitoria neonatale di B surfattante neonatale proteina che causa la sindrome da distress respiratorio 1,2 o lesioni hyperoxic del polmone neonatale 3. Malattie candidati per la correzione permanente terapeutica sono la fibrosi cistica (CF) 4, varianti genetiche di carenze tensioattivi 5 e α1-antitripsina 6. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In generale, un importante vantaggio della terapia genica prenatale è la capacità di avviare l&#39;intervento terapeutico precoce in sviluppo, o addirittura a prima manifestazioni cliniche della paziente, evitando così danni irreparabili alla persona. Inoltre, gli organi fetali hanno un aumentato tasso di proliferazione cellulare rispetto ad organi adulti, che potrebbe consentire un gene più efficiente o cellule staminali trasferimento nel feto. Inoltre, in gene delivery utero viene eseguita quando il sistema immunitario dell&#39;individuo non è completamente maturo. Pertanto, il trapianto di cellule eterologhe o integrazione di una proteina non funzionale o assente con una versione corretta non dovrebbe causare sensibilizzazione immune alla cella, vettore o prodotto transgene, che è stato recentemente dimostrato di essere il caso con terapie sia cellulari e genetici 7 . In questo studio, abbiamo studiato la possibilità di indirizzare direttamente la trachea fetale in un m topoodello. Questa procedura è in uso in modelli animali più grandi come conigli e pecore e 8, anche in un ambiente clinico 9, ma ha per il momento non sono state realizzate prima in un modello murino. Quando si studia il potenziale della terapia genica fetale per malattie genetiche come la fibrosi cistica, il modello di mouse è molto utile come primo proof-of-concept per l&#39;ampia disponibilità di diversi ceppi di topi transgenici, l&#39;embriogenesi ben documentato e lo sviluppo del feto, meno rigorosi norme etiche, gestazione breve e la prole di grandi dimensioni. Diverse vie di accesso sono stati descritti per indirizzare il polmone fetale roditore, anche intra-amniotico iniezione 10-12, (eco-guidata) intrapolmonare iniezione 13,14 e somministrazione per via endovenosa nei vasi sacco vitellino 15,16 o vena ombelicale 17. La nostra nuova procedura chirurgica consente ai ricercatori di iniettare il farmaco di scelta direttamente nella trachea del mouse fetale che consenteper una consegna più efficiente per le vie respiratorie rispetto alle tecniche esistenti 18.

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi nel feto mouse. Il percorso di consegna è più efficiente in termini di orientamento dei polmoni fetali del mouse rispetto al comunemente usato intra-amniotico iniezione. Questa procedura deve momento non è stata descritta in un modello murino.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

La somministrazione polmonare prenatale di cellule, geni o agenti farmacologici potrebbe fornire la base per nuove strategie terapeutiche per una varietà di patologie genetiche e...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di iniettare un agente a scelta direttamente nella trachea del topo fetale, consentendo una somministrazione più efficiente alle vie aeree rispetto alle tecniche esistenti. Questo risultato si ottiene esteriorizzando la testa del feto mediante un'isterotomia e accedendo alla trachea fetale. Successivamente, si pratica un'incisione verticale del collo per visualizzare la trachea e si inserisce un ago con guida visiva.Successivamente, perle fluorescenti o un vettore virale vengono iniettati nella trachea per consegnare in modo efficiente la sostanza scelta alle vie aeree fetali. L'analisi microscopica di sezioni di tessuto provenienti da polmoni trattati mostra che l'iniezione intratracheale determina un rilascio più efficiente di molecole fluorescenti o vettori virali alle vie aeree fetali rispetto alla più comune via di somministrazione intra-amniotica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione fetale intra-amniotica, è che si evita la diluizione della sostanza iniettata nel liquido amniotico.Questo massimizza l'effetto delle particelle presenti nel polmone del topo fetale. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnologia troveranno estremamente difficile eseguire un'iniezione endotracheale perfetta. Questo perché la trachea fetale è estremamente fragile e, come tale, può essere facilmente perforata.Quando si esegue questa procedura, si effettua un'iniezione per tracheale e, di conseguenza, non si riesce a indirizzare il polmone fetale. Tuttavia, come sempre, la pratica rende perfetti. In preparazione all'iniezione intra-tracheale o iniezione it, si utilizzano topi gravidi sottoposti a risonanza magnetica. Pertanto, al momento dell'intervento chirurgico, e prima e dopo di esso, i topi sono gravidi da 18 giorni.Sono ospitati in gabbie con coperchio filtrante a temperatura ambiente normale e con luce naturale, con libero accesso ad acqua e cibo. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano, posizionarlo su un tappetino riscaldato a 37 gradi Celsius per mantenere la temperatura corporea e verificare il livello di anestesia eseguendo un pizzicotto al dito del piede. Disinfettare l'addome con iodopovidone ed eseguire una laparotomia mediana per esporre l'utero gravido, esteriorizzare i due corni uterini e contare il numero di sacche gestazionali.Viene operato un feto per corno in base alla posizione ottimale per l'esternalizzazione della testa fetale. Per fissare il feto all'interno dell'utero a livello delle spalle, si passa una sutura a punto stellato con sei punti di prolene per ogni filo, di circa un centimetro di diametro, attraverso la parete uterina e le membrane fetali nella zona in cui verrà esposta la testa fetale. Successivamente, praticare un'incisione nella parete uterina all'interno del punto stellato di circa 0,8 centimetri utilizzando forbici piccole con punta affilata.Successivamente, estrarre delicatamente la testa e il collo del feto attraverso l'isterotomia. Quindi tirare delicatamente il punto a sacco, suturando in modo stretto attorno al collo e utilizzando due pinzette micro mosca. Per fissarlo in posizione, utilizzare cinque o poliattina.Utilizzare un filo 10 da nove su due pinze posizionate nella bocca intorno alla mascella superiore per mantenere la testa fetale in iperestensione sotto un microscopio stereoscopico. Visualizzare la trachea mediante dissezione affilata e smussata, praticare un'incisione verticale nel collo ed ulteriormente dissezionare il tessuto sottostante fino a raggiungere la trachea. Utilizzando una siringa in vetro Hamilton da 50 microlitri con un ago affilato da 30 gauge, iniettare un volume totale di 30 microlitri di sostanza.Un afflusso minimo del liquido iniettato al momento della rimozione dell'ago garantisce che l'iniezione sia stata eseguita correttamente. Per reinserire la testa nell'utero, applicare una leggera pressione sul naso. Prima il collo rientra nell'utero, seguito successivamente dalla testa.E infine, il naso. Inserire un ago contenente soluzione salina nell'incisione all'interno del punto a sacco. Chiudere l'isterotomia stringendo il punto a sacco e iniettare un totale di circa 500 microlitri di soluzione salina nella cavità amniotica per prevenire l'oligoidramnios.Dopo aver riposizionato l'utero nell'addome, utilizzare una sutura continua in Vicryl 5-0 in due strati separati. Per chiudere la parete addominale materna, infiltrare l'incisione con Xylocaina 0,2% per il sollievo dal dolore postoperatorio. Mantenere il topo su un tappetino riscaldante fino al completo recupero, necessario per eseguire un'iniezione intra-amniotica o IA fetale.Dopo aver anestetizzato il topo gravido, utilizzare iodopovidone per disinfettare l'addome ed eseguire una laparotomia mediana per esporre l'utero gravido, esteriorizzare i due corni uterini e contare il numero di sacchi gestazionali. Utilizzando una siringa in vetro Hamilton da 50 microlitri con un ago sottile da 30 gauge, inserire l'ago nel sacco, vicino alla bocca del feto senza entrare in contatto con esso e iniettare 30 microlitri di soluzione nel liquido amniotico.Dopo aver iniettato tutti i feti, riposizionare l'utero nell'addome e utilizzare un punto di sutura Vicryl 5-0 per chiudere la parete addominale e la cute. Dopo l'eutanasia della madre, 36 ore dopo l'intervento fetale, estrarre i feti mediante taglio cesareo e valutarne la vitalità verificando la presenza di battito cardiaco, colore della pelle roseo e movimenti spontanei. Posizionare i cuccioli vicino a una fonte di ossigeno per stimolare la respirazione e l'assorbimento di ossigeno.Quindi marcare i cuccioli alla base della coda. Utilizzando inchiostro cinese, è possibile valutare l'esito positivo dell'iniezione mediante eutanasia di un feto operato e dissezione dei polmoni per valutare macroscopicamente la presenza del colorante visibile nei polmoni rispetto ai polmoni di controllo non iniettati. Successivamente, coprire i restanti cuccioli che soddisfano i criteri di vitalità.Materiale di lettiera contenente feci e urina di una madre surrogata con cuccioli di un giorno, quindi posizionare i cuccioli insieme alla prole della madre surrogata. Lasciare non più di 10 cuccioli in totale nella nidiata della madre surrogata. Successivamente, posizionare la gabbia in un ambiente tranquillo e indisturbato per 12 ore e valutare la percentuale di sopravvivenza dell'accudimento per determinare il volume ottimale.Sono stati scelti empiricamente volumi di iniezione di 10, 20 e 30 microlitri di molecole rosse fluorescenti da 100 nanometri. Qui sono mostrate immagini al microscopio confocale di sezioni polmonari fissate con colorazione dei nuclei. Sebbene al momento dell'intervento fetale un reflusso sia stato rilevato solo dopo l'iniezione di 30 microlitri, indicando un eccesso di liquido iniettato, l'iniezione di 30 microlitri ha prodotto la quantità maggiore di segnale fluorescente nel parenchima polmonare, come quantificato misurando la fluorescenza relativa, come mostrato qui; tale iniezione ha determinato una somministrazione significativamente maggiore di microsfere fluorescenti al polmone fetale rispetto alla radice IA.Il tratto gastrointestinale è risultato positivo anche negli animali inoculati per via IT e IA. Nessuna fluorescenza rossa è stata osservata in altri tessuti dei feti trattati o negli animali di controllo negativo. Per valutare l'efficacia della trasduzione virale dopo l'iniezione, le iniezioni IT e IA sono state eseguite utilizzando vettori RAAV con rivestimento ENC che esprimono la luciferasi della lucciola sotto il controllo del promotore dell'actina beta di pollo a un'età di una settimana. Il flusso totale di fotoni per il gruppo IT è risultato significativamente più elevato rispetto ai cuccioli IA e al controllo negativo.Per distinguere tra un'iniezione intratecale corretta e una scorretta, è stata eseguita una combinazione di risonanza magnetica o MRI e imaging bioluminescente o BLI per ottenere un'immagine sovrapposta che combina il segnale BLI della superficie con una visualizzazione delle strutture anatomiche più profonde provenienti dall'imaging MR, come mostrato qui. All'età di una settimana, l'imaging BL ha rivelato un segnale proveniente dalla regione del collo e toracica.La co-registrazione di MRI con BLI ha localizzato l'espressione del gene luciferasi nella regione polmonare dopo un'iniezione corretta, ma nella zona del collo e addominale dopo un'iniezione errata. L'analisi istologica mediante colorazione ex-gal ha confermato la co-registrazione in vivo. Una volta padroneggiata l'intera procedura, l'iniezione intratracheale può essere eseguita in mezz'ora, dal taglio fino alla chiusura sull'animale madre.Un tempo di intervento breve si tradurrà in una migliore sopravvivenza fetale e in un numero maggiore di animali che potranno essere studiati dopo la nascita.

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Questo video descrive un approccio intrabronchiale per somministrare selettivamente un agente sperimentale nel polmone destro e sinistro distale. Nel protocollo presentato, somministreremo bleomicina per via intrabronchiale in un topo per ottenere un modello migliore per la fibrosi polmonare.

Consegna intrabronchiale: una tecnica per somministrare selettivamente un agente sperimentale in un polmone di topo

Fonte: Venuprasad, K., et al. Somministrazione intratracheale di Haemophilus influenzae in modelli murini per studiare l'infiammazione delle vie aeree. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la somministrazione intratracheale di un inoculo batterico patogeno polmonare in un topo anestetizzato per modellare l'infezione del tratto respiratorio inferiore.

Esecuzione della somministrazione batterica intratracheale in un modello murino

Questo video dimostra la procedura di occlusione tracheale transuterina di un feto di topo in un topo gravido. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'impatto della trachea occlusa sullo sviluppo polmonare.

Modellazione dell'occlusione tracheale fetale transuterina in modello murino: una procedura chirurgica per la legatura della trachea fetale all'interno di un topo gravido

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

Intubazione endotracheale in Mouse<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia diretta usando un otoscopio

L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali nei topi spesso si traduce in consegna asimmetrica ai polmoni distali.  In questa relazione, descriviamo un approccio intrabronchiale diretto (IB) per cannulare ogni polmone in topi viventi non chirurgici.  Questo approccio può essere utilizzato per somministrare selettivamente gli agenti a un polmone o può essere adattato per migliorare la somministrazione simmetrica dell'agente a entrambi i polmoni.

Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

Questa tecnica di instillare farmaci direttamente nella trachea dei roditori neonatali è importante per studiare l'impatto di farmaci o biologici somministrati localmente sulle malattie polmonari neonatali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per indurre lesioni polmonari in modelli animali.

Un metodo minimamente invasivo per l'instillazione intratracheale di farmaci nei roditori neonatali per il trattamento delle malattie polmonari

Vari modelli animali di ernia diaframmatica congenita e occlusione tracheale fetale presentano vantaggi e svantaggi per quanto riguarda questioni etiche, costi, difficoltà chirurgiche, dimensioni, tassi di sopravvivenza e disponibilità di strumenti genetici. Questo modello fornisce un nuovo strumento per studiare l'impatto sia dell'occlusione tracheale che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.

Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Questo protocollo mostra come il posizionamento ottimale di un topo e l'inserimento transorale di un otoscopio basato su telecamera consentano la visualizzazione della glottide, l'intubazione rapida con un trauma tissutale minimo e l'erogazione costante di liquidi ai polmoni.

Metodologia migliorata per l'erogazione di liquidi al polmone di topo: intubazione con un otoscopio consumer

Scopri una tecnica chirurgica innovativa per la somministrazione endotracheale di agenti bioattivi nei feti di topo. Questo metodo migliora il targeting polmonare evitando la diluizione tipica delle iniezioni intra-amniotiche.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

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