Riparazione di un critico di dimensioni modello Difetto cranica Usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da Lipoaspirate

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule stromali multipotenti dal tessuto adiposo ai fini della differenziazione osteogenica, utilizzando un modello di difetto calvarico in vivo in un topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando le cellule progenitrici dallo strato vascolare stromale del tessuto adiposo, che può essere ottenuto a seguito di una procedura di liposuzione. Il passaggio successivo consiste nel preparare un'impalcatura tridimensionale e quindi seminare le cellule su tale scaffold.

L'ultimo passaggio consiste nella creazione di un difetto calvarico di dimensioni critiche in un modello murino, all'interno del quale vengono posizionati lo scaffold e le cellule. Alla fine, i risultati dimostrano che le cellule stromali multipotenti isolate dal tessuto adiposo possiedono il potenziale per la rigenerazione scheletrica in vivo. Le applicazioni di questa tecnica coprono un ampio spettro di possibili utilizzi clinici a causa della carenza di tessuto disponibile per la rigenerazione scheletrica.

Mentre gli innesti ossei autologhi rappresentano lo standard di riferimento, la mancanza di siti donatori e la morbidità associata al sito donatore limitano questa opzione. Gli innesti omologhi e i materiali estranei possono essere utilizzati, ma sono limitati da costi elevati, scarsa integrazione e rischio di infezione.

L'utilizzo di tessuto adiposo o grasso per l'isolamento di cellule progenitrici nell'ingegneria dei tessuti scheletrici è un'opportunità entusiasmante. A illustrare la procedura sarò io stesso e Michael Chung del laboratorio Long Anchor. In primo luogo, ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da procedure elettive di liposuzione.

E osservare i due strati nel lipoaspirato. Il sopranatante contiene la stragrande maggioranza del materiale cellulare derivante dal processo. Lo strato inferiore è costituito principalmente dalla soluzione salina iniettata.

Le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo possono essere ottenute da entrambi gli strati, ma il rendimento è molto maggiore nel sopranatante. Per isolare la frazione vascolare stromale o il lavaggio SVF, lavare ampiamente l'aspirato lipidico con volumi uguali di soluzione salina fosfato al 1x o PBS contenente Betadine al 2,5%, quindi aspirare un volume uguale di PBS 1x senza Betadine. Lasciare sedimentare il lavaggio.

Assicurarsi di mantenere una tecnica sterile per tutto il processo al fine di evitare contaminazioni con tessuto umano processato. Successivamente, aspirare lo strato inferiore e scartarlo dopo ogni lavaggio, quindi trasferire 15 millilitri di tessuto adiposo in provette coniche Falcon da 50 millilitri. Quindi digerire il tessuto adiposo in 15 millilitri di soluzione filtrata al 0,075% filtrata.

Incubare la collagenasi di tipo due in soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS a 37 gradi Celsius in bagnomaria per 60 minuti sotto agitazione costante, assicurandosi di aerare i tubi ogni 15 minuti. Neutralizzare quindi l'attività enzimatica con 15 millilitri di PBS contenente 10% di siero fetale bovino o FBS e centrifugare. Per ottenere un pellet denso di SVF, il pellet sarà una miscela di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo e di eritrociti.

Eliminare prima lo strato di grasso sovrannatante, quindi rimuovere lo strato liquido sovrannatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di crescita tradizionale. Successivamente, unire tre provette in un'unica provetta conica da 50 millilitri pulita attraverso un filtro da 100 micron e centrifugare.

Eliminare il soprannatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere il pellet. In cinque millilitri di terreno di crescita tradizionale, combinare due provette coniche da 50 millilitri per ogni piastra da 10 centimetri, oppure cinque provette coniche da cinque millilitri per ogni piastra da 15 centimetri. Stabilire le colture primarie durante la notte a 37 gradi Celsius con il 21% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.

Dopo un'incubazione notturna, lavare le piastre con PBS per rimuovere i globuli rossi non aderenti residui. Le popolazioni cellulari ottenute sono cellule stromali derivate dal tessuto adiposo. Mantenere le cellule a livelli subconfluenti per prevenire la differenziazione spontanea.

A 37 gradi Celsius, 21% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Nel mezzo di crescita, le cellule devono generalmente essere suddivise ogni tre o quattro giorni nel mezzo di crescita normale. Quando vengono seminate a una confluenza del 50%, preparare l'impalcatura come spiegato nel manoscritto allegato.

Quando le cellule raggiungono livelli di subconfluenza, lavare le cellule due volte con PBS e con tripsina. Contare le cellule per quantificarle. Per la semina, prepararsi a seminare le cellule su scaffold precisi di quattro millimetri di diametro con 1,5 × 10⁵ cellule.

Posizionare un singolo scaffold in una pozzetta di una piastra a 96 pozzetti, quindi sospendere le cellule in mezzo di crescita standard a una concentrazione di circa 1,5 × 10⁵ cellule per 20 microlitri di mezzo. Seminare lo scaffold pipettando 20 microlitri della soluzione direttamente all'interno dello scaffold e collocare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di mezzo e lasciare le cellule incubare sullo scaffold per tutta la notte. Prima dell'intervento chirurgico, non è necessario verificare l'adesione delle cellule allo scaffold come fase di semina. Un numero sufficiente di cellule garantirà che la maggioranza si attacchi allo scaffold.

Dopo aver anestetizzato un topo nudo CD adulto di 60 giorni, sterilizzare il sito chirurgico con Betadine e alcol per tre volte e applicare un lubrificante sugli occhi dei topi. Successivamente, praticare un'incisione sagittale mediana nel cuoio capelluto del topo per esporre l'osso parietale destro. Rimuovere il perian dall'osso parietale destro mediante raschiatura ottusa.

Successivamente, creare un difetto unilaterale di quattro millimetri a tutto spessore nel parietale destro non associato a punti di sutura. Utilizzando una punta da trapano rivestita di diamante, prestare la massima attenzione a non disturbare la dura madre sottostante, poiché lo spessore del cranio del topo è inferiore a 0,3 millimetri prima dell'innesto. Risciacquare gli scaffold con PBS sterile per prevenire il trasferimento di fattori di crescita derivati dal mezzo.

Posizionare l'impalcatura nel difetto. Infine, suturare la pelle e monitorare l'animale secondo i protocolli postoperatori stabiliti. Eseguire una micro-TC sul topo e ottenere un'immagine ricostruita in 3D utilizzando il software MicroView.

Utilizzare Adobe Photoshop per ridimensionare le immagini a un'altezza standard. Tipicamente, misuriamo la rigenerazione della calotta cranica ogni due settimane. I topi vengono anestetizzati durante la scansione per il follow-up a lungo termine e infine sottoposti a eutanasia.

Per l'analisi istologica, utilizzare la funzione bacchetta magica per misurare i pixel del difetto cranico. Determinare la percentuale di guarigione del difetto mediante scansioni TC successive. Misurare l'area del difetto cranico, determinare il numero di pixel e dividerlo per il numero di pixel del difetto originale; colorare diverse sezioni lungo l'estensione del difetto utilizzando coloranti istologici come annal in blu e pen aro per indicare la formazione osteo.

Utilizzare Adobe Photoshop per ritagliare tutte le aree che non rientrano nel difetto calvarico e usare lo strumento bacchetta magica per determinare il numero di pixel corrispondenti alla neoformazione ossea all'interno dell'area del difetto, quindi confrontare i risultati con i controlli o altre variabili. Illustrato qui è un panorama del prelievo e dell'applicazione del lipoaspirato, dall'isolamento delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo alla loro espansione, differenziamento e utilizzo in vitro e in vivo. Qui è mostrata una micro-TC che evidenzia la riparazione in vivo di un difetto calvarico di dimensione critica mediante l'applicazione di ASC su un'impalcatura di idrossiapatite, visibile nell'ultima riga.

I controlli, mostrati nella riga superiore, includono l'assenza di scaffold e difetto. La riga centrale mostra il difetto con il posizionamento dello scaffold senza cellule. LS indicato qui rappresenta la quantificazione della guarigione ossea ottenuta dalla micro-TC, che mostra un aumento significativo della guarigione nel gruppo A SC.

Questa è un'immagine istologica che mostra un aumento della formazione ossea nel gruppo A SC mediante andal. In blu e con la colorazione pen AROM per al. In blu, l'osteode appare colorato di blu scuro con la colorazione pen arom.

Le colorazioni gialle dell'osteode mostrate qui sono cellule staminali mesenchimali umane etichettate con GFP, seminate su un'impalcatura e sacrificate dopo due settimane. La colorazione è stata eseguita con un anticorpo marcato con GFP per mostrare il contributo delle cellule umane alla rigenerazione nella zona del difetto. Qui è mostrata l'immunochimica per l'antigene nucleare umano, che evidenzia la prevalenza di cellule umane nella zona del difetto a due settimane.

Una volta acquisita padronanza, l'elaborazione del tessuto adiposo può essere completata entro quattro ore, mentre la procedura chirurgica può richiedere circa 10 minuti per topo. È importante ricordare che l'osso parietale è rotondo mentre la punta del trapano è piatta, pertanto è necessario prestare attenzione a rimuovere completamente l'intera circonferenza del difetto di quattro millimetri. Ricordarsi di procedere lentamente per evitare di danneggiare la dura madre nel cervello.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule progenitrici dal tessuto adiposo. Semina queste cellule su un'impalcatura e posizionale nel topo.