Name: Riparazione di un critico di dimensioni modello Difetto cranica Usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da Lipoaspirate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri come isolare cellule stromali da tessuto adiposo per rigenerazione ossea in vivo. Questo metodo utilizza un modello murino con difetto calvarico critico di 4 mm per valutare la differenziazione osteogenica.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Commons George e il Dr. Dean Vistnes per il loro sostegno e la collaborazione della nostra ricerca. Questo lavoro è supportato dal National Institute of Dental Research e borse di craniofacciale 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 e RC2 DE020771-02, la Fondazione di quercia e Hagey Laboratorio di Medicina Rigenerativa di Pediatric MTL Dr. Hyun è supportato dal San Giuseppe Mercy Hospital GME .

1. Cella di isolamento e di espansione <ol><li> Tutti consenso del paziente e protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla Stanford University Institutional Review Board (protocollo # 2188 e # 9999). </li><li> Ottenere umano tessuto adiposo sottocutaneo di procedure elettive di cui lipoaspirazione locale / anestesia generale. </li><li> Ci saranno due strati nella lipoaspirate (Figura 1A). Il surnatante contiene la maggior parte del materiale trattato cellulare. Lo strato inferiore è principalmente iniettato salina. Adiposo cellule stromali può essere raccolta da uno strato, ma la resa è molto maggiore dal supernatante. </li><li> Per isolare la frazione stromale vascolare (SVF), lavare il lipoaspirate ampiamente con uguali volumi di 1X tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,5% betadine (x2), seguita da volume uguale di PBS 1X (x1) senza betadine. Lasciare che il lavaggio a precipitare. </li><li> Fate attenzione a mantenere sterile technique tutto il processo, come contaminazione con tessuti umani trasformati può accadere. </li><li> Aspirare lo strato inferiore e gettare dopo ogni lavaggio. </li><li> Dispensare 15 ml di tessuto adiposo in 50 ml BD Falcon tubi conici. </li><li> Digerire il tessuto adiposo con un volume uguale (15 ml) di filtrato 0,075% collagenasi di tipo II in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 ° C a bagnomaria per 60 minuti con agitazione costante (circa 180 scuote / min) - ventilare ogni tubo ogni 15 min. </li><li> Neutralizzare l&#39;attività enzimatica con 15 ml di PBS contenente 10% (Fetal Bovine Serum) FBS, e centrifugare a 1000 rpm per 5 min a 4 ° C per ottenere una alta densità SVF pellet. Il pellet sarà un mix di derivate da tessuto adiposo cellule stromali ed eritrociti. </li><li> Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di crescita tradizionali (Eagle modificato da Dulbecco Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% di penicillina-streptomicina soluzione). </li><li> Filtro sospensione<html> sione attraverso un filtro 100 micron cella in nylon per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Combina 3 tubi in uno pulito da 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min a 4 ° C. </li><li> Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di mezzo di crescita tradizionali </li><li> Combina due conicals 50 ml per un 10 cm Piatto o cinque conicals 50 ml per una piastra di 15 cm. </li><li> Stabilire colture primarie notte a 37 ° C/21% di O 2, 5% di CO 2. </li><li> Dopo l&#39;incubazione per una notte, lavare i piatti estesamente con PBS per rimuovere residui non aderenti globuli rossi. Le popolazioni di cellule risultanti sono derivate da tessuto adiposo cellule stromali. </li><li> Mantenere le cellule a livello sub-confluenti livelli per evitare differenziazione spontanea a 37 ° C/21% O 2, 5% di CO 2 in terreni di coltura. Le cellule generalmente necessario dividere ogni tre o quattro giorni in terreni di crescita regolari quando piastrate al 50% di confluenza. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Scaffold Preparazione <ol><li> Impalcature sono state fatte dal Dr. Min Lee presso l&#39;Università di California, Los Angeles - Scuola di Odontoiatria. </li><li> Ponteggi PLGA sono state fabbricate da 85/15 poli (lattico-co-glicolico) (viscosità intrinseca = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) mediante colata solvente ed un processo di lisciviazione particolato. </li><li> PLGA / cloroformio soluzioni sono state miscelate con saccarosio diametro 200-300 micron per ottenere 92% di porosità (frazione di volume), e compressi in fogli sottili in uno stampo Teflon. </li><li> Dopo liofilizzazione overnight, ponteggi sono stati immersi in tre cambi di bidistillata (dd) H 2 O per sciogliere il saccarosio, e delicatamente rimosso dalla piastra Teflon con un fine-punta di spatola. </li><li> Dopo la percolazione particolato, tutti scaffold stati disinfettati per immersione nel 50%, 60% e 70% di etanolo per 30 minuti ciascuno, seguiti da tre risciacqui di DDH 2 O. </li><li> Tutti i ponteggi sono stati essiccati sotto una cappa a flusso laminare. </li><li> Dopo ponteggio fabbricazione, scaffolds stati rivestiti con apatite. <ol class="ualpha"><li> SBF (fluido corporeo simulato) soluzione è stata preparata con concentrazioni di ioni che erano 5 volte quello del plasma umano. Tutte le soluzioni sono sterili filtrata attraverso una membrana da 0,22 micron PES (Nalgene). Immediatamente prima del processo di rivestimento, essiccato ponteggi PLGA sono stati sottoposti a scarica a bagliore, argon-plasma etching (Harrick scientifico) per migliorare la bagnatura e l&#39;uniformità di rivestimento. </li><li> Etched ponteggi PLGA sono state poi incubate in SBF a 37 ° C all&#39;interno di una camicia d&#39;acqua incubatore per 12 ore, seguita da Mg 2 + e HCO 3 - libera SBF 2 per un&#39;altra hr 12 a 37 ° C sotto leggera agitazione. </li><li> Rivestite ponteggi PLGA stati sciacquati delicatamente con sterile DDH 2 O per lavare via l&#39;eccesso di soluzione di cloruro di sodio, essiccati in una cappa a flusso laminare e disinfettati con etanolo al 70%. </li><li> Integrità del rivestimento di apatite è stata analizzata con un microscopio elettronico a scansione (SEM). Apatite rivestito scaffolds sono stati montati su stubs SEM (Ted Pella) e ricoperti di carbonio per migliorare la conducibilità. La modalità di elettroni secondari è stata applicata durante la SEM (FEI / Phillips XL-30) osservazione. Dispersione di energia dei raggi X dello spettro è stato ottenuto per confermare la composizione elementare delle strutture apatite. </li></ol></li></ol> 3. Semina cellulare <ol><li> Giunti sub-confluenza livelli, lavare le cellule con PBS (x2) e Tripsinizzare. </li><li> Contare le cellule di quantificare per la semina </li><li> Seme sul pre-tagliati scaffold mm di diametro 4,0 con 1,5 x 10 5 cellule. <ol class="ualpha"><li> Luogo individuale impalcatura in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti </li><li> Risospendere le cellule in terreno di crescita regolari con una concentrazione di circa 1,5 x 10 5 cellule per 20 l di supporti </li><li> Dispensare 20 pl direttamente sul patibolo e il luogo in incubatore per colture cellulare per 30 minuti. </li><li> Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di media e permettere alle cellule di incubaresul patibolo notte prima dell&#39;intervento </li><li> Non è necessario per assicurare l&#39;adesione delle cellule sull&#39;impalcatura come seminare un numero sufficiente di cellule garantirà che la maggioranza si attaccherà sul ponteggio. Questo è stato validato nel nostro laboratorio in vivo con bioluminescenza e l&#39;analisi istologica. </li></ol></li></ol> 4. Creazione di difetti cranica e impianto in vivo <ol><li> Anesthetize adulti (60 giorni di età) CD-1 topi nudi con cocktail anestetico. (Ketamina / xilazina / acepromazina) al 50% di concentrazione (diluizione 1:1 con 0,9% NaCl) o per raccomandata regime anestetico per i protocolli delle istituzioni. Questi topi sono atimico in modo che i hASCs non provocare una reazione immunitaria. <ol class="lalpha"><li> Dosaggio: ketamina cloridrato (80 mg / kg), xilazina (2,5 mg / kg) Acepromazine (2,5 mg / kg) </li><li> Durata di entrata in vigore: circa 30 min </li></ol></li><li> Chirurgicamente drappo l&#39;animale e sterilizzare l&#39;chirurgicasito con Betadine e alcool (x3) e coprire gli occhi di topo con unguento prima di fare una incisione mediana sagittale nel cuoio capelluto dell&#39;animale per esporre l&#39;osso parietale destra. Rimuovere il pericranium dal parietale destro con raschiatura smussato (Figura 1B). </li><li> Creare un unilaterale da 4 mm a tutto spessore difetto il diritto non sutura parietale associata utilizzando una sterile diamantata punta trapano. Estrema cautela deve essere presa per non disturbare la sottostante dura mater (Figura 1B), come lo spessore del mouse cranica è &lt;0,3 millimetri. </li><li> Prima dell&#39;impianto, risciacquare scaffold con PBS sterile per impedire il trasferimento di medie fattori di crescita derivati. </li><li> Posizionare il patibolo nel difetto. </li><li> Infine, suturare la pelle chiusa e monitorare l&#39;animale per stabiliti protocolli post-operatorie. </li><li> Utilizzare analgesia stabilito come indicato dai protocolli animali vostra cura, se necessario dopo l&#39;intervento-per esempio. buprenorfina 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Quantificazione di Formazione osteoide <ol><li> Dopo microCT stata eseguita sul mouse, l&#39;immagine tridimensionale è stata ricostruita utilizzando software MicroView come descritto in precedenza 1. </li><li> Utilizzo di Adobe Photoshop, le immagini erano dimensionati per una altezza standard. </li><li> Utilizzando la funzione di bacchetta magica, i pixel sono stati misurati del difetto cranica. </li><li> Guarigione percentuale del difetto è stata determinata mediante successive scansioni CT misurare la superficie cranica difetto e determinare il numero di pixel e dividendolo per il numero di pixel del difetto originale </li><li> Di conseguenza, se il microCT non è disponibile, in alternativa si utilizza Adobe Photoshop e raccogliendo il calvaria a tempi determinati per istologia. </li><li> Utilizzando le macchie istologiche come anilina blu e Pentachrome che denotano la formazione osteoide, più sezioni lungo l&#39;arco del difetto deve essere macchiato </li><li> Utilizzo di Adobe Photoshop, ritagliare tutte le aree che non sononel difetto cranica </li><li> Utilizzare la funzione di bacchetta magica e determinare il numero di pixel di formazione ossea de novo nella zona del difetto e confrontare ai controlli o altre variabili. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Il tessuto adiposo è in grado di servire un ruolo fondamentale nella generazione di cellule progenitrici per l&#39;applicazione clinica. Tessuto adiposo ha un vantaggio unico in quanto vi è una fornitura prontamente disponibile che può essere raccolta in una procedura relativamente semplice che coinvolge minima morbilità e mortalità. Una volta che il tessuto è raccolto e raccolto, il nostro protocollo è descritto nella Figura 2. Adipose cellule stromali sono isolate attraverso una serie di fasi di lavaggio, digestione con collagenasi e centrifugazione. Una volta che le cellule vengono piastrate in coltura, possono essere espansi, inseriti in vari protocolli di differenziazione in vitro, oppure direttamente in vivo. Il cREAZIONE DI 4 mm critico-dimensione dei difetti cranica fornisce una facilmente accessibile e riproducibile nel modello in vivo per testare la capacità osteogenico differenziazione dei nostri derivate da tessuto adiposo cellule stromali. Attraverso l&#39;uso di microCT, siamo in grado di seguire la formazione di tessuto scheletrico in vivo e monitorare l&#39;avanzamento dei nostri interventi (Figura 3). Il critico-dimensione dei difetti cranica non guarirà entro la durata di vita degli animali e si vede circa il 90% del difetto rimane brevetto circa 8 settimane. Lo stesso ponteggio (vedi la discussione) ha osteogeniche proprietà induttivi e ha dimostrato la capacità di indurre un po &#39;di rigenerazione ossea. I risultati tipici di posizionamento scaffold senza cellule mostra che circa un terzo del difetto avrà de novo formazione ossea a 8 settimane. Con l&#39;aumento della adipose cellule stromali, completamente due terzi o più del difetto mostrerà la rigenerazione ossea a circa 8 settimane anche se vi è Variability tra ogni animale e chirurgia. La formazione di tessuto scheletrico può essere quantificata mediante istologia e risultati tipici mostrano una eccessiva formazione di osteoide in campioni con ASC in blu di anilina e la colorazione Pentachrome (Figura 3C). Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule impiantate umani contribuiscono alla sottostante de novo formazione ossea attraverso l&#39;uso di hASCs GFP-marcati che mostrano colorazione in vivo dopo 2 settimane vicino alla zona di formazione ossea de novo nel difetto cranica (Figura 3D) . Inoltre, utilizziamo immunoistochimica con anticorpo umano specifico per dimostrare la sopravvivenza delle cellule umane e contributo nella zona del difetto (Figura 3E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Figura 1 A -. La lipoaspirate ha due strati. Lo strato superiore contiene gli adipociti e la maggior parte del prprocessa materiale cellulare, mentre lo strato inferiore contiene la soluzione salina utilizzata durante la procedura di lipoaspirazione. B - la creazione del difetto cranica attraverso una incisione sulla linea mediana pericranium per isolare l&#39;osso parietale destro, successiva creazione di un 4 mm critica difetto imprese cranica senza interruzioni della dura sottostante dura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Figura 2. Panoramica della raccolta e applicazione lipoaspirate dall&#39;isolamento del adipose cellule stromali alla loro espansione, la differenziazione e l&#39;uso in vitro e in vivo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Figura 3. A-microCT che mostra in vivo la guarigione del difetto dimensione critica cranica con l&#39;applicazione di ASC attraverso un hydroxyapatitie ponteggio (riga in basso). I controlli includono nessuna impalcatura e difetti (riga in alto) e il difetto con il posizionamento del ponteggio senza celle (riga centrale) B - Quantificazione di guarigione ossea dal microCT mostra guarigione significativamente aumentata nel gruppo ASC. C - Istologia mostrando una eccessiva formazione di osteoide del gruppo ASC (riga in basso) con blu di anilina e colorazione Pentachrome. Per anilina blu, le macchie osteoidi blu scuro e per Pentachrome, le macchie osteoidi giallo. D - hASCS marcate con GFP sono state seminate su un ponteggio e posta in un difetto cranica e sacrificati dopo 2 settimane. La colorazione è stata eseguita con un GFP anticorpo marcato per mostrare le cellule umane che contribuiscono alla rigenerazione nella zona del difetto. E -. Umano immunoistochimica dell&#39;antigene nucleare che mostra la prevalenza di cellule umane nella zona del difetto a 2 settimane <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Poiché l&#39;isolamento di adiposo cellule stromali 2 da lipoaspirate, queste cellule sono state differenziate in una varietà di linee cellulari. Il tessuto adiposo è di origine mesodermica e, quindi, cellule stromali multipotenti derivate da tessuto adiposo sarà probabilmente più efficace con l&#39;applicazione nei confronti di un lignaggio mesodermica. La capacità di generare tessuto scheletrico è particolarmente importante data la carenza di siti donatori per un innesto di osso autologo e le limitazioni in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente: </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate Harvest </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Cellgro </td><td> 21-023-CV </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C6885-500mg </td><td></td></tr><tr><td> Cella Filtro 100 micron </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-top 500 ml 0,22 micron filtro </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Difetto cranica </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Circolare Knife 4,0 millimetri </td><td> Xemax chirurgico </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

riparazione di un critico di dimensioni modello difetto cranica usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da lipoaspirate

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofacciale scheletrica riparazione e rigenerazione offre la promessa di formazione de novo tessuto attraverso una cella approccio che utilizza cellule staminali. Derivate da tessuto adiposo cellule stromali (CSA) hanno dimostrato di essere una fonte abbondante di cellule staminali multipotenti in grado di subire osteogenico, differenziazione condrogenico, adipogenico e miogenico. Molti studi hanno esplorato il potenziale osteogenico di queste cellule in vivo con l&#39;uso di biomateriali impalcature varie consegna cellulare. È stato dimostrato che utilizzando un osteoconduttiva, rivestimento in idrossiapatite poli (lattico-co-glicolico) (HA-PLGA) scaffold seminati con ASC, un difetto critico dimensioni cranica, un difetto che è definita dalla sua incapacità di subire spontanea guarigione sulla durata di vita dell&#39;animale, può essere efficacemente mostrare robusta rigenerazione ossea. Questo modello in vivo dimostra la base di approcci translazionale volta la rigenerazione del tessuto osseo - il cellularecomponente e matrice biologica. Questo metodo serve da modello per l&#39;applicazione clinico finale di una cellula progenitrice verso la riparazione di un difetto specifico tessuto.

Questo protocollo descrive l&#39;isolamento di adiposo cellule stromali di lipoaspirate e la creazione di un millimetro 4 critico imprese difetto cranica per valutare rigenerazione scheletrico.

Riparazione di un critico di dimensioni modello Difetto cranica Usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da Lipoaspirate

La riparazione e la rigenerazione dello scheletro craniofacciale offrono la promessa di una formazione tissutale de novo attraverso un approccio basato sulle cellule che utilizza le cellule staminali.

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule stromali multipotenti dal tessuto adiposo al fine di indurre la differenziazione osteogenica, utilizzando un modello di difetto calvarico in vivo in un topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando le cellule progenitrici dallo strato vascolare stromale del tessuto adiposo, che può essere ottenuto a seguito di una procedura di liposuzione. Il passaggio successivo consiste nel preparare un'impalcatura tridimensionale e quindi seminare le cellule su tale scaffold.L'ultimo passaggio consiste nella creazione di un difetto calvarico di dimensioni critiche in un modello murino, all'interno del quale vengono posizionati lo scaffold e le cellule. Alla fine, i risultati dimostrano che le cellule stromali multipotenti isolate dal tessuto adiposo possiedono il potenziale per la rigenerazione scheletrica in vivo. Le applicazioni di questa tecnica coprono un ampio spettro di possibili utilizzi clinici a causa della scarsità di tessuto disponibile per la rigenerazione scheletrica.Mentre gli innesti ossei autologhi rappresentano lo standard di riferimento, la mancanza di siti donatori e la morbosità del sito donatore limitano questa opzione. Gli innesti omologhi e i materiali estranei possono essere utilizzati, ma sono limitati da costi elevati, scarsa integrazione e rischio di infezione.L'utilizzo del tessuto adiposo o grasso per l'isolamento di cellule progenitrici nell'ingegneria dei tessuti scheletrici è un'opportunità entusiasmante. A illustrare la procedura sarò io stesso e Michael Chung del laboratorio Long Anchor. In primo luogo, ottenere tessuto adiposo sottocutaneo umano da procedure elettive di liposuzione.E osservare i due strati nel lipoaspirato. Il sopranatante contiene la stragrande maggioranza del materiale cellulare derivante dal processo. Lo strato inferiore è costituito principalmente dalla soluzione salina iniettata.Le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo possono essere ottenute da entrambi gli strati, ma il rendimento è molto maggiore nel sopranatante. Per isolare la frazione vascolare stro­ma­le o SVF, lavare ampiamente l'aspirato lipidico con volumi uguali di soluzione salina fosfato tampone 1x contenente il 2,5% di Betadine; quindi aspirare un volume uguale di PBS 1x senza Betadine. Lasciare decantare il lavaggio.Assicurarsi di mantenere una tecnica sterile per tutto il processo al fine di evitare contaminazioni con tessuto umano processato. Successivamente, aspirare lo strato inferiore e scartarlo dopo ogni lavaggio, quindi trasferire 15 millilitri di tessuto adiposo in provette coniche Falcon da 50 millilitri. Quindi digerire il tessuto adiposo in 15 millilitri di soluzione filtrata al 0,075% filtrata.Incubare la collaghenasi di tipo due in soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS a 37 gradi Celsius in bagnomaria per 60 minuti sotto agitazione costante, assicurandosi di aerare i tubi ogni 15 minuti. Neutralizzare quindi l'attività enzimatica con 15 millilitri di PBS contenente 10% di siero fetale bovino o FBS e centrifugare. Per ottenere un pellet denso di SVF, il pellet sarà una miscela di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo e di eritrociti.Scartare prima lo strato di grasso sovrannatante, quindi eliminare lo strato liquido sovrannatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di crescita tradizionale. Successivamente, unire tre provette in un'unica provetta conica da 50 millilitri pulita attraverso un filtro da 100 micron e centrifugare.Eliminare il soprannatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere il pellet. In cinque millilitri di terreno di crescita tradizionale, combinare due provette coniche da 50 millilitri per ogni piastra da 10 centimetri, oppure cinque provette coniche da cinque millilitri per ogni piastra da 15 centimetri. Stabilire le colture primarie durante la notte a 37 gradi Celsius con il 21% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.Dopo un'incubazione notturna, lavare le piastre con PBS per rimuovere i globuli rossi non aderenti residui. Le popolazioni cellulari ottenute sono cellule stromali derivate dal tessuto adiposo. Mantenere le cellule a livelli subconfluenti per prevenire una differenziazione spontanea.A 37 gradi Celsius, 21% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Nel mezzo di crescita, le cellule devono generalmente essere suddivise ogni tre o quattro giorni in mezzo di crescita normale. Quando vengono seminate a una confluenza del 50%, preparare l'impalcatura come spiegato nel manoscritto allegato.Quando le cellule raggiungono livelli di subconfluenza, lavare le cellule due volte con PBS e con tripsina. Contare le cellule per quantificarle. Per la semina, prepararsi a seminare le cellule su scaffold precisi di quattro millimetri di diametro con 1,5 × 10⁵ cellule.Posizionare un singolo scaffold in una pozzetta di una piastra a 96 pozzetti, quindi sospendere le cellule in mezzo di crescita standard a una concentrazione di circa 1,5 × 10⁵ cellule per 20 microlitri di mezzo. Seminare lo scaffold pipettando direttamente 20 microlitri della soluzione all'interno dello scaffold e collocare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per 30 minuti.Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di mezzo e lasciare che le cellule incubino sullo scaffold per tutta la notte. Prima dell'intervento chirurgico, non è necessario verificare l'adesione delle cellule allo scaffold come fase di semina. Un numero sufficiente di cellule garantirà che la maggioranza si attacchi allo scaffold.Dopo aver anestetizzato un topo nudo CD adulto di 60 giorni, sterilizzare il sito chirurgico con Betadine e alcol per tre volte e applicare un lubrificante sugli occhi dei topi. Successivamente, praticare un'incisione sagittale mediana nel cuoio capelluto del topo per esporre l'osso parietale destro. Rimuovere il perran dall'osso parietale destro mediante raschiatura ottusa.Successivamente, creare un difetto unilaterale di quattro millimetri a tutto spessore nel parietale destro non associato alla sutura. Utilizzando una punta da trapano rivestita di diamante, prestare estrema attenzione a non disturbare la dura madre sottostante, poiché lo spessore del cranio del topo è inferiore a 0,3 millimetri prima dell'innesto. Risciacquare gli scaffold con PBS sterile per prevenire il trasferimento di fattori di crescita derivati dal mezzo.Posizionare l'impalcatura nel difetto. Infine, suturare la pelle e monitorare l'animale seguendo i protocolli postoperatori stabiliti. Eseguire una tomografia computerizzata micro su topo e ottenere un'immagine ricostruita in 3D utilizzando il software microview.Utilizzare Adobe Photoshop per ridimensionare le immagini a un'altezza standard. Tipicamente, misuriamo la rigenerazione della calotta cranica ogni due settimane. I topi vengono anestetizzati durante la scansione per il follow-up a lungo termine e, alla fine, soppressi.Per l'analisi istologica, utilizzare la funzione bacchetta magica per misurare i pixel del difetto cranico. Determinare la percentuale di guarigione del difetto mediante scansioni TC successive. Misurare l'area del difetto cranico, determinare il numero di pixel e dividerlo per il numero di pixel del difetto originale; colorare diverse sezioni lungo l'estensione del difetto utilizzando coloranti istologici come annal in blu e pen aro per indicare la formazione osteo.Utilizzare Adobe Photoshop per ritagliare tutte le aree che non rientrano nel difetto calvarico e usare lo strumento bacchetta magica per determinare il numero di pixel corrispondenti alla neoformazione ossea all'interno dell'area del difetto, quindi confrontare i risultati con i controlli o altre variabili. Di seguito è riportata una panoramica sul prelievo e l'applicazione dell'aspirato lipidico, dall'isolamento delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo alla loro espansione, differenziamento e utilizzo in vitro e in vivo. Nella figura si osserva una tomografia micro-CT che mostra la riparazione in vivo di un difetto calvarico di dimensione critica mediante l'applicazione di ASC (cellule staminali adipose) attraverso uno scaffold di idrossiapatite, visibile nell'ultima riga.I controlli, mostrati nella riga superiore, includono l'assenza di scaffold e difetto. La riga centrale mostra il difetto con il posizionamento dello scaffold senza cellule. LS indicato qui rappresenta la quantificazione della guarigione ossea ottenuta dalla micro-tc, che mostra un aumento significativo della guarigione nel gruppo A SC.Questa è un'immagine istologica che mostra un aumento della formazione ossea nel gruppo A SC mediante andal. In blu e penna AROM, colorazione per al. In blu, l'osteode appare colorato di blu scuro con la penna AROM.Le colorazioni gialle dell'osteode mostrate qui sono ASC umane marcate con GFP, che sono state seminate su un'impalcatura e sacrificate dopo due settimane. La colorazione è stata eseguita con un anticorpo marcato con GFP per mostrare il contributo delle cellule umane alla rigenerazione nell'area del difetto. Qui è mostrata l'immunochimica per l'antigene nucleare umano, che evidenzia la prevalenza di cellule umane nell'area del difetto a due settimane. Una volta acquisita padronanza, l'elaborazione del tessuto adiposo può essere completata entro quattro ore e la procedura chirurgica può richiedere circa 10 minuti per topo. È importante ricordare che l'osso parietale è rotondo mentre la punta del trapano è piatta, pertanto è necessario prestare attenzione a rimuovere completamente l'intera circonferenza del difetto di quattro millimetri. Ricordarsi di procedere lentamente per evitare di danneggiare la dura madre nel cervello.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule progenitrici dal tessuto adiposo. Seminare queste cellule su un'impalcatura e inserirle nel topo.

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