Colmare il Bio-Electronic Interface con Biofabrication

L'obiettivo generale del seguente esperimento è depositare elettricamente film biopolimerici e funzionalizzarli con componenti biologici come proteine e cellule. Il deposito elettrochimico si ottiene sfruttando la variazione di pH che avviene localmente a un elettrodo polarizzato in combinazione con una soluzione di polisaccaride sensibile al pH. Scegliendo una strategia di deposizione catodica o anodica, l'elettrodo viene polarizzato per innescare una transizione sol-gel, che genera un film sottile con un modello definito dalla geometria elettrodica.

Inoltre, componenti biologici come proteine e cellule possono essere introdotti durante l'intero processo di deposizione dell'elettrodo. Per funzionalizzare biologicamente il film, si ottengono risultati che mostrano come i componenti biologici siano localizzati nei film sulla base dell'immagine di fluorescenza. In aggiunta, i componenti risultano funzionali e in grado di interagire con l'ambiente circostante, come dimostrato dal rilevamento elettrochimico dell'attività enzimatica e dall'uso della risposta cellulare come sistema di segnalazione.

La biofabbricazione fornisce un insieme innovativo di strumenti per costruire l'interfaccia tra biologia ed elettronica. Riteniamo che i suoi principali vantaggi siano la semplicità e la capacità di assemblarsi in condizioni prossime a quelle fisiologiche. La biologia è esperta nella fabbricazione a scala nanometrica attraverso processi di autoassemblaggio e meccanismi enzimatici. Sfruttando queste capacità, evitiamo metodi di sintesi complessi, pericolosi e dispendiosi in termini di tempo, utilizzati da altre tecniche di assemblaggio.

Il nostro team collaborativo ha avuto l'idea di costruire l'interfaccia del dispositivo BioD utilizzando materiali e meccanismi biologici quando abbiamo osservato che i loro aquiloni potevano essere depositati sugli elettrodi. Il kitan è un polisaccaride che forma un film in risposta al pH e che può riconoscere i segnali elettrici imposti dal dispositivo e depositarsi come un sottile strato. Una volta constatato che il kitan poteva essere depositato sull'elettrodo, abbiamo capito che avremmo potuto accedere a un insieme più ampio di strumenti provenienti dalla biochimica e dalla biologia molecolare per costruire un'interfaccia per il dispositivo BioD.

L'applicazione di tale tecnica si estende ai sistemi di tipo "lab-on-chip" in cui sono richiesti componenti biologici funzionali, poiché offrono un modo economico e semplice per localizzare tali componenti su un elettrodo dove possono rimanere vitali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché un film biologicamente fabbricato può essere delicato e facilmente danneggiabile. Pertanto, è necessario fare attenzione a non essere troppo energici durante il lavaggio o l'irrorazione del film.

Dato che il film potrebbe essere facilmente disturbato, potrebbe risultare instabile. Tuttavia, come vantaggio, gli elettrodi possono essere riutilizzati poiché il film viene rimosso con facilità. Per iniziare questo protocollo, collegare un alimentatore agli elettrodi su misura mediante cavetti di collegamento con clip a coccodrillo.

Un vetrino di vetro ricoperto di ossido di indio e stagno, o ITO, fungerà da anodo o elettrodo di lavoro; una lamina di platino servirà da catodo o elettrodo di controparte. Posizionare gli elettrodi in modo che la superficie dell'ITO da funzionalizzare sia opposta all'elettrodo di controparte, disponendo la superficie dell'ITO in posizione verticale per essere immersa nella soluzione oppure in posizione orizzontale, in modo che la soluzione possa essere contenuta sulla superficie. Successivamente, preparare una soluzione di deposizione di alginato mescolando alginato al 1% e carbonato di calcio allo 0,5% in acqua distillata e sottoponendo la miscela ad autoclave. Quindi, etichettare l'alginato con fluorescenza utilizzando Fluor spheres, mescolando e vortexando.

Questo permetterà l'acquisizione di immagini a fluorescenza del film risultante. Dopo l'autoclavatura, immergere entrambi gli elettrodi nella soluzione di deposizione preparata ed applicare una densità di corrente costante di tre ampere per metro quadrato per due minuti. La tensione varierà nell'intervallo da due a tre volt. Trascorsi due minuti, scollegare l'elettrodo e rimuovere la soluzione con i depositi non desiderati. Risciacquare delicatamente il film con cloruro di sodio per rimuovere l'alginato in eccesso.

Incubare brevemente il film in cloruro di calcio 0,1 M per rafforzare il gel. Successivamente, il film viene incubato nella soluzione di conservazione desiderata. Procedere quindi all'acquisizione dell'immagine del film mediante microscopia a fluorescenza prima della co-deposizione.

Coltivare una coltura cellulare donatrice del segnale e una coltura cellulare ricevente del segnale seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato a questo video. Successivamente, preparare una soluzione di deposizione contenente alginato e carbonato di calcio. Mescolare la soluzione con ciascuna coltura cellulare in rapporto uno a uno, ottenendo una concentrazione finale di 1% alginato e 0,5% carbonato di calcio, con le cellule diluite a circa metà della densità di coltura.

Utilizzare un vetrino in vetro con due elettrodi in ITO racchiusi da una camera in poli dimetil silano e un elettrodo contro in platino. Collegare un elettrodo in ITO e l'elettrodo in platino a un alimentatore. Come in precedenza, immergere gli elettrodi nella soluzione di deposizione contenente le cellule riceventi.

Impostare l'alimentatore a corrente costante con una densità di tre ampere per metro quadrato, dove la dimensione dell'area superficiale è definita dal singolo elettrodo su cui avverrà la deposizione. Applicare la corrente per due minuti per consentire la codeposizione delle cellule nella matrice di alginato. Risciacquare il film con cloruro di sodio come in precedenza, quindi invertire la connessione antic sull'elettrodo ITO adiacente.

Ripetere la procedura di deposizione, ma questa volta introducendo la soluzione contenente le cellule donatrici. Incubare il chip con due elettrodi contenente le cellule co-depositate e l'arginato di calcio durante la notte a 37 gradi Celsius in soluzione salina tampone al fosfato.

Supplementato con terreno LB al 10% e cloruro di calcio uno millimolare. Dopo l'incubazione, acquisire un'immagine del chip mediante microscopio a fluorescenza per iniziare il deposito dell'elettrodo di chitosano. Collegare l'alimentatore agli elettrodi.

Montare le pinze a coccodrillo. Un chip di silicio rivestito d'oro fungerà da catodo e una lamina di platino da anodo. Posizionare la superficie dell'elettrodo d'oro in modo che deponga l'elettrodo contatore come in precedenza.

Preparare una soluzione di sabbia Kato mescolando fiocchi di sabbia Kato in acqua e aggiungendo lentamente acido cloridrico due molare per sciogliere i polisaccaridi. Seguendo la procedura indicata nel testo, la soluzione di sabbia Kato può essere marcativa con fluorescenza al fine di visualizzare il film depositato sull'elettrodo mediante microscopia a fluorescenza. Successivamente, immergere completamente gli elettrodi nella soluzione di kaizan, coprendo interamente l'area desiderata per il deposito.

Applicare per due minuti una corrente costante calcolata a una densità di quattro ampere per metro quadrato in base all'area superficiale dell'elettrodo di lavoro. In questo caso, una corrente di 16 microampere viene applicata a un elettrodo d'oro di quattro millimetri quadrati; il voltaggio si sposterà nell'intervallo di due-tre volt dopo il risciacquo dell'elettrodo con acqua deionizzata per rimuovere l'eccesso di chitosano. Procedere quindi all'acquisizione dell'immagine del film mediante microscopio a fluorescenza, depositando chitosano e glucosio ossidasi da una soluzione a una densità di corrente di quattro ampere per metro quadrato su un elettrodo strutturato.

Secondo la procedura di deposizione dell'elettrodo al chitosano, verrà generato un film di kaizan incapsulato con glucosio ossidasi. Collegare l'elettrodo trattato a un sistema a tre elettrodi utilizzando l'elettrodo lavoratore, un filo di platino come elettrodo ausiliario e argento, cloruro di argento come elettrodo di riferimento; immergere quindi gli elettrodi in una soluzione tampone al fosfato contenente cloruro di sodio. Coniugare elettrochimicamente la proteina al film di Kazam applicando una tensione costante per 60 secondi mediante cronopiramentria, seguendo il coniugamento.

Posizionare il chip in tampone fosfato e lavare per 10 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere qualsiasi cloruro di sodio non reagito e la glucosio ossidasi non coniugata. Riattaccare il sistema a tre elettrodi e immergere in una soluzione di cinque millimolari di glucosio. Impostare quindi i parametri desiderati per la voltammetria ciclica per scansionare il potenziale in direzione positiva fino a 0,7 volt.

Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di glucosio e risciacquare con tampone fosfato. Quindi posizionare gli elettrodi in un becher da 10 millilitri contenente otto millilitri di tampone fosfato su una piastra agitatrice magnetica. Applicare al chip funzionalizzato con GOX un potenziale di 0,6 volt in modo che funga da elettrodo di lavoro.

Dopo aver impostato i parametri desiderati, acquisire una registrazione di base. Aggiungere aliquote di glucosio al tampone per aumentare la concentrazione di glucosio di quattro millimoli per litro per ogni aliquota. In questo esperimento, vengono aggiunte al tampone aliquote di 400 microlitri di glucosio 80 millimolare. Correlare l'output di corrente a ciascuna concentrazione di glucosio per generare una curva standard. Per eseguire la funzionalizzazione della proteina, utilizzare un vetrino di vetro con un elettrodo in oro e uno in ITO adiacenti, contenuti all'interno di A-P-D-M-S.

Polarizzare negativamente l'elettrodo d'oro con un potenziale catodico per depositare elettrochimicamente il tizen come mostrato in precedenza. Dopo aver risciacquato il film, aggiungere una soluzione di sintetasi dell'autoinduttore due marcati con un fluoroforo blu, integrata con tirosinasi. Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.

Risciacquare il film con PBS come in precedenza, applicare un potenziale anodico all'elettrodo di ITO immerso in una soluzione di deposizione di alginato contenente le cellule riceventi. Proseguire con gli stessi passaggi descritti nella codeposizione di popolazioni cellulari in alginato per generare il segnale trasmesso in modo enzimatico. Dopo aver risciacquato i film, aggiungere una soluzione di cinque micromolar, SAH e PBS integrata con mezzo LB al 10% e un millimolare.

Il cloruro di calcio ricopre gli elettrodi per prevenire l'evaporazione della soluzione e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Questo permetterà una risposta delle cellule riceventi generando una proteina fluorescente rossa DS red; gli elettrodi adiacenti possono essere osservati mediante microscopia a fluorescenza regolando i filtri per catturare la fluorescenza blu del sintetizzatore induttore e la fluorescenza rossa espressa dalle cellule riceventi riutilizzate. I segnali elettrici applicati possono creare microambienti localizzati in prossimità della superficie di un elettrodo e questi stimoli possono innescare l'autoassemblaggio di polisaccaridi come l'alginato e il razan, che si depositano come un film di idrogel sulla superficie dell'elettrodo.

Poiché questa transizione sol-gel avviene sulla superficie dell'elettrodo, il film risultante viene elettrodepositato con una geometria che corrisponde al disegno dell'elettrodo. Utilizzando l'alginato, popolazioni cellulari distinte sono state codiposte in indirizzi separati. L'evidenza del loro indirizzamento elettrodico si osserva in seguito all'interazione tra la popolazione cellulare donatrice e quella ricevente.

La molecola autoinduttrice due diffonde dalle cellule mittenti ed è assorbita dalle cellule riceventi, portando all'espressione della proteina fluorescente DS red. Qui, la fluorescenza rossa è osservata soltanto all'elettrodo in cui le cellule riceventi sono indirizzate. Al contrario, l'enzima biosensore glucosio ossidasi conferisce la capacità di rilevare il glucosio attraverso una reazione enzimatica che produce perossido di idrogeno, il quale può successivamente essere ossidato elettrochimicamente per generare una corrente in uscita.

In questo modo, un segnale chimico può essere trasdotto in un segnale elettrico. Questo grafico mostra che i film nei quali Geo X è chimicamente coniugato producono un forte segnale elettrico in presenza di glucosio, a differenza dei film che non contengono Geo X. Questi risultati indicano che Geo X può essere assemblato su un film di zam depositato e può mantenere l'attività catalitica. Inoltre, un incremento a gradino della corrente otica è prodotto in risposta a concentrazioni crescenti di glucosio.

La curva standard mostrata evidenzia inoltre che gli incrementi procedono in modo pressoché lineare in funzione della quantità di glucosio aggiunta. Questi risultati dimostrano che l'enzima mantiene anche la sua sensibilità dopo la coniugazione al film Razza; come illustrato qui, la I due sintetasi include un marcatore Penta tirosina. La tirosinasi agisce sul marcatore tirosina ossidando i gruppi fenolici dei residui a o-quinoni, che successivamente si legano covalentemente alle ammine di Kazam. Un'evidenza della funzionalizzazione del film Kazam da parte della I due sintetasi mediante assemblaggio della tirosinasi è osservabile in questa immagine a fluorescenza, che mostra un film kaza su oro in cui la I due sintetasi funzionalizzata è stata marcata fluorescentemente in blu. Poiché la I due sintetasi genera I due dal substrato SAH nello stesso modo delle cellule trasmettitrici, la sua vicinanza a cellule riceventi ingaggiate in presenza di SAH induce anche alle cellule riceventi di rispondere fluorescentemente esprimendo ds.

La fluorescenza rossa delle cellule riceventi dimostra nuovamente l'interazione tra gli indirizzi dovuta alla diffusione dell'AI-2 dall'una all'altra cellula, e indica inoltre che le 10 enzimi immobilizzate sul tizene mantengono l'attività una volta legate covalentemente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come depositare elettrochimicamente film di polisaccaridi e di come funzionalizzarli utilizzando diverse tecniche. Abbiamo dimostrato la versatilità di questi passaggi di funzionalizzazione, che ci permette di lavorare con una molteplicità di componenti biologici in ulteriori test.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena pochi minuti per generare schemi di film ben definiti sui quali componenti biologici possono essere innestati con precisione. In questo modo, siamo in grado di generare molto facilmente superfici biologicamente strutturate e attive su elettrodi specifici, tutto in modo organizzato e tuttavia in grado di ottenere interazioni biologiche complesse. Dopo aver seguito questa procedura, la creatività può essere applicata sia nella progettazione dell'array elettrochimico sia nella scelta dei componenti biologici al fine di ottenere l'interazione desiderata.

Il nostro obiettivo è che gli strumenti di biofabbricazione possano fungere da ponte tra due campi diversi, la biotecnologia e la microelettronica, entrambi in grado di rivoluzionare in modo significativo la nostra vita. Collegando questi due settori, riteniamo di poter creare nuove soluzioni per alcune delle sfide più urgenti della società. Ad esempio, prevediamo che la biofabbricazione possa offrire metodi semplici e versatili per nuove modalità di rilevamento, utili per la diagnosi immediata, il monitoraggio delle malattie e il riconoscimento di minacce biologiche e chimiche.

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