Colmare il Bio-Electronic Interface con Biofabrication

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di depositare elettricamente film biopolimerici e funzionalizzarli con componenti biologici come proteine e cellule. L'elettrodeposizione si ottiene sfruttando la variazione di pH che si verifica localmente su un elettrodo polarizzato in combinazione con una soluzione polisaccaridica sensibile al pH. Dopo aver scelto una strategia di deposizione catartica o anodica, l'elettrodo viene polarizzato per innescare una transizione in gel dell'anima, che genera un film sottile con un modello definito dall'elettrogeometria.

Inoltre, componenti biologici come proteine e cellule possono essere introdotti durante il processo di deposizione degli elettrodi. Al fine di funzionalizzare biologicamente il film si ottengono risultati che mostrano che i componenti biologici sono localizzati nei film sulla base dell'imaging a fluorescenza. Inoltre, i componenti sono funzionali e in grado di interagire con il loro ambiente, come dimostrato dal rilevamento elettrochimico dell'attività enzimatica e dall'uso della risposta della cellula reporter.

La biofabbricazione fornisce una nuova cassetta degli attrezzi per costruire l'interfaccia tra biologia ed elettronica. Riteniamo che i suoi principali vantaggi siano la sua semplicità e la sua capacità di assemblarsi in condizioni quasi fisiologiche. La biologia è esperta nella fabbricazione su scala nanometrica attraverso l'autoassemblaggio e i mezzi enzimatici Arruolando queste capacità, eludiamo i metodi di sintesi complessi, pericolosi e dispendiosi in termini di tempo utilizzati da altre tecniche di assemblaggio.

Il nostro team collaborativo ha avuto l'idea di costruire l'interfaccia del dispositivo BioD utilizzando materiali e meccanismi biologici quando abbiamo osservato che i loro aquiloni potevano essere depositati con elettrodi. Kitan è un polisaccaride filmogeno sensibile al pH in grado di riconoscere i segnali elettrici imposti dal dispositivo e di depositarsi sotto forma di film sottile. Una volta visto che il kitan poteva essere depositato con un elettrodo, ci siamo resi conto che potevamo accedere a una suite più ampia di strumenti di biochimica e biologia molecolare per costruire un'interfaccia per dispositivi BioD.

L'applicazione di tale tecnica si estende alle impostazioni del chip di labon in cui sono richiesti componenti biologici funzionali in quanto forniscono un modo economico e semplice per localizzare tali componenti su un elettrodo dove possono rimanere vitali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto un film biofabbricato può essere dedicato e facilmente danneggiato. Pertanto, bisogna fare attenzione a non essere troppo aggressivi durante il lavaggio o le riprese del film.

Come il film potrebbe essere definito facilmente disturbato. Tuttavia, come vantaggio, gli elettroni possono essere riutilizzati perché la pellicola è facilmente rimovibile. Per iniziare questo protocollo, collegare un alimentatore agli elettrodi fabbricati su misura tramite cavi patch utilizzando clip a coccodrillo.

Un vetrino rivestito di ossido di indio-stagno o ITO fungerà da anodo o elettrodo di lavoro, la lamina di platino fungerà da catodo o controelettrodo, posizionare l'elettrodo in modo che la superficie dell'IT o da funzionalizzare si opponga al controelettrodo in modo che la superficie dell'IT O sia posizionata verticalmente per essere immersa nella soluzione o orizzontalmente, in modo che la soluzione possa essere contenuta sulla superficie. Successivamente, preparare una soluzione di deposizione di alginato mescolando l'1% di alginato e lo 0,5% di carbonato di calcio in acqua distillata e sterilizzando in autoclave la miscela. Quindi etichettare in modo fluorescente l'alginato con sfere di fluorazione mediante miscelazione e vorticizzazione.

Ciò consentirà l'imaging a fluorescenza del film risultante Dopo la sterilizzazione in autoclave, la soluzione immerge entrambi gli elettrodi nella soluzione di deposizione preparata e applica una densità di corrente costante di tre ampere per metro quadrato per due minuti. La tensione si sposterà nell'intervallo da due a tre volt Dopo due minuti, scollegare l'elettrodo e rimuovere la soluzione senza depositi. Sciacquare delicatamente la pellicola con cloruro di sodio per rimuovere l'alginato superfluo.

Incubare brevemente la pellicola in cloruro di calcio 0,1 molare per rafforzare il gel. Il film viene quindi incubato nella soluzione di conservazione desiderata. Procedere all'imaging del film utilizzando la microscopia a fluorescenza prima della co-deposizione.

Coltiva una coltura cellulare con trasmettitore di segnale e una coltura cellulare con ricevitore di segnale come indicato nel protocollo scritto che accompagna questo video. Successivamente, preparare una soluzione di deposizione di alginato e carbonato di calcio. Miscelare la soluzione con ciascuna coltura cellulare in un rapporto uno a uno fino a una concentrazione finale di alginato all'1% e carbonato di calcio allo 0,5% con le cellule diluite a circa la metà della densità di coltura.

Utilizzare un vetrino modellato con due elettrodi ITO contenuti in un pozzetto di polidimetilsilano e un controelettrodo in platino. Collegare un elettrodo ITO e l'elettrodo di platino a un alimentatore. Come in precedenza, immergere gli elettrodi nella soluzione di deposizione contenente le celle riceventi.

Impostare l'alimentazione su una corrente costante ad una densità di tre ampere per metro quadrato, dove la dimensione dell'area superficiale è definita dal singolo elettrodo su cui avverrà la deposizione. Applicare la corrente per due minuti per consentire la codeposizione delle cellule nella matrice di alginato. Sciacquare la pellicola con cloruro di sodio come prima, commutare il collegamento antic sull'elettrodo ITO adiacente.

Ripetere la procedura di deposizione, ma questa volta. Presentazione della soluzione contenente le celle del mittente. Incubare il chip a due elettrodi contenente le cellule co-depositate e l'argenato di calcio per una notte a 37 gradi Celsius in soluzione salina tamponata con fosfato.

Integrato con il 10% di terreno in libbra di terreno e un millimolare di cloruro di calcio. Dopo l'incubazione, l'immagine del chip utilizza un microscopio a fluorescenza per iniziare la deposizione dell'elettrodo di chitosano. Collegare l'alimentatore agli elettrodi.

Spara clip a coccodrillo. Un chip di silicio rivestito d'oro fungerà da catodo e una lamina di platino fungerà da anodo. Posizionare la superficie dell'elettrodo d'oro in modo che deponga il controelettrodo come prima.

Prepara una soluzione di sabbia Kato mescolando scaglie di sabbia Kato in acqua e aggiungendo lentamente due molari di acido cloridrico per sciogliere i polisaccaridi. Seguendo la procedura a cui si fa riferimento nel testo, la soluzione di sabbia di Kato può essere marcata in fluorescenza per visualizzare la pellicola depositata con l'elettrodo mediante microscopia a fluorescenza Prossimo posto. Gli elettrodi nella soluzione kaizan immergono completamente l'area desiderata per la deposizione.

Per due minuti applicare una corrente costante calcolata alla densità di quattro ampere per metro quadrato in base alla superficie degli elettrodi di lavoro. In questo caso, una corrente di 16 microampere viene applicata a un elettrodo d'oro quadrato di quattro millimetri, la tensione si sposterà nell'intervallo da due a tre volt dopo il risciacquo dell'elettrodo con acqua deionizzata per rimuovere il chitosano superfluo. Procedere all'imaging del film utilizzando un microscopio a fluorescenza, copos chitosano e glucosio ossidasi da una soluzione a una densità di corrente di quattro rampe per metro quadrato su un elettrodo modellato.

Secondo la procedura di deposizione dell'elettrodo di chitosano, verrà generato un film kaizan intrappolato con glucosio ossidasi. Collegare l'elettrodo trattato a un sistema a tre elettrodi come elettrodo di lavoro, un filo di platino come controelettrodo e argento, cloruro d'argento come elettrodo di riferimento, immergere gli elettrodi in una soluzione tampone fosfato contenente cloruro di sodio. Coniugare elettrochimicamente la proteina al film di Kazam applicando una tensione costante per 60 secondi utilizzando la cronopirometria dopo la coniugazione.

Mettere il chip in un tampone fosfato e lavare per 10 minuti su uno shaker orbitale per rimuovere il cloruro di sodio non reattivo e la glucosio ossidasi non coniugata. Ricollegare il sistema a tre elettrodi e immergere una soluzione di glucosio a cinque millimolari. Quindi impostare i parametri di desiderio per la telemetria vol ciclica per spazzare il potenziale in una direzione positiva a 0,7 volt.

Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di glucosio e risciacquare con tampone fosfato. Quindi posizionare gli elettrodi in un becher da 10 millilitri contenente otto millilitri di tampone fosfato su una piastra di agitazione magnetica. Il chip GOX ha funzionalizzato a 0,6 volt per fungere da elettrodo di lavoro.

Dopo aver impostato i parametri desiderati, raccogli una registrazione di base. Aggiungere aliquote di glucosio al tampone per aumentare la concentrazione di glucosio di quattro millimolari per ogni aliquota In questo esperimento, vengono aggiunte al tampone aliquote di 400 microlitri di glucosio da 80 millimolari. Correlare l'uscita di corrente a ciascuna concentrazione di glucosio Per generare una curva standard per eseguire la funzionalizzazione delle proteine, utilizzare un vetrino modellato con un elettrodo adiacente in oro e ITO contenuto all'interno di A-P-D-M-S.

Polarizzare bene l'elettrodo d'oro con un potenziale catartico per il deposito dell'elettrodo come mostrato in precedenza. Dopo aver risciacquato la pellicola, aggiungere una soluzione di autoinduttore blu fluorescente a due sintasi integrata con tirosinasi. Segue un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.

Sciacquare la pellicola con PBS come prima, applicare un potenziale anodico all'elettrodo ITO immerso in una soluzione di deposizione di alginato contenente celle riceventi Continuare con gli stessi passaggi descritti nella co-deposizione di popolazioni cellulari in alginato per generare enzimaticamente il segnale trasmesso. Dopo aver risciacquato le pellicole, aggiungere una soluzione di cinque micromolari, SAH e PBS integrati con il 10% di terreno di coltura e un millimolare.

Il cloruro di calcio copre gli elettrodi per prevenire l'evaporazione della soluzione e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Ciò consentirà una risposta della cellula ricevente generando una proteina fluorescente rossa DS Gli elettrodi rossi adiacenti possono essere visualizzati con la microscopia a fluorescenza mediante justing. I filtri per catturare la fluorescenza blu dell'induttore anche due sintasi e la fluorescenza rossa espressa dalle celle riceventi cooptate hanno imposto segnali elettrici possono creare microambienti localizzati vicino alla superficie di un elettrodo e questi stimoli possono innescare l'autoassemblaggio di polisaccaridi come l'alginato e il razan per depositarsi come un film di idrogel sulla superficie dell'elettrodo.

Poiché questa transizione del gel dell'anima avviene sulla superficie dell'elettrodo, il film risultante viene indirizzato elettro con la sua geometria che corrisponde al modello dell'elettrodo. Utilizzando l'alginato, popolazioni cellulari uniche sono state co-depositate in indirizzi separati. L'evidenza dei loro indirizzi elettrodici si osserva durante l'interazione tra la popolazione di cellule trasmittenti e ricficatrici.

La molecola autoinduttore due si diffonde dalle cellule trasmittenti e viene assorbita dalle cellule riceventi con conseguente espressione della proteina fluorescente rossa DS. Qui. La fluorescenza rossa si osserva solo in corrispondenza dell'elettrodo in cui sono indirizzati i ricevitori. Al contrario, l'enzima biosensibile glucosio ossidasi fornisce la capacità di rilevare il glucosio attraverso una reazione enzimatica producendo perossido di idrogeno, che può quindi essere ossidato elettrochimicamente per produrre una corrente di uscita.

In questo modo, un segnale chimico può essere trasdotto in elettrico. Questo grafico mostra che i film in cui Geo X è stato coniugato chimicamente producono un forte segnale antico in presenza di glucosio rispetto a quelli che non contengono Geo X. Questi risultati indicano che Geo X può essere assemblato su un film di zam depositato e/o mantenere l'attività catalitica. Inoltre, in risposta all'aumento delle concentrazioni di glucosio si produce un aumento graduale di una corrente otica.

La curva standard presente mostra anche che gli aumenti di passo procedevano in modo quasi lineare a seconda della quantità di glucosio aggiunta. Questi risultati mostrano che l'enzima mantiene la sua sensibilità anche dopo la coniugazione con il film di Razza, come illustrato qui, la I due sintasi include un tag Penta tirosina. La tirosinasi agisce sul tag tirosina ossidando i gruppi fenolici residui a o chinoni, che poi si legano covalentemente all'ammina di Kazan la prova della funzionalizzazione del film di Kazam all'interno della a i due sintasi da parte dell'assemblaggio della tirosinasi si osserva in questa immagine a fluorescenza che mostra un film di kaza sull'oro dove la I due sintasi funzionalizzata è stata marcata fluorescentmente in blu perché una I due sintasi genera un I due dal substrato SAH allo stesso modo come cellule mittenti, la sua vicinanza alle cellule riceventi cooptate in presenza di SAH fa sì che le cellule riceventi rispondano fluorescentemente esprimendo ds.

La fluorescenza rosso rosso delle cellule riceventi dimostra ancora una volta l'interazione tra gli indirizzi dovuta alla diffusione di ai, due da uno all'altro, e indica inoltre che 10 enzimi immobilizzati a tizen mantengono l'attività una volta legati covalentemente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elettrodepositare i film di polisaccaridi e di come funzionalizzarli utilizzando una varietà di tecniche. Abbiamo dimostrato la versatilità di queste fasi di funzionalizzazione, che ci consente di lavorare con una moltitudine di componenti biologici in ulteriori test.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti per generare modelli di film ben definiti su cui è possibile innestare con precisione i componenti biologici. E così, in questo modo, siamo in grado di generare molto facilmente superfici biologicamente modellate e attive su elettrodi designati, il tutto fatto in modo organizzato e tuttavia in grado di ottenere interazioni biologiche complesse. Seguendo questa procedura, la creatività può essere impiegata sia nella progettazione dell'electro array che nella scelta dei componenti biologici al fine di ottenere l'interazione progettuale.

La nostra speranza è che gli strumenti di biofabbricazione facciano da ponte tra due campi disparati, la biotecnologia e la microelettronica, ognuno dei quali ha rivoluzionato individualmente le nostre vite. Interfacciando questi due campi, crediamo che creeremo nuove soluzioni ad alcuni dei problemi più urgenti della società. Ad esempio, immaginiamo che la biofabbricazione possa fornire metodi semplici e versatili per nuovi modi di rilevare, per il punto di cura, la diagnosi di malattie e il rilevamento di minacce biologiche e chimiche.

Un esempio di vasta portata potrebbe essere che il prossimo stent arterioso di nuova generazione sarebbe anche in grado di monitorare il profilo metabolico e di mantenere l'arteria aperta.