Name: Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Scopri il metodo CoMPP per caratterizzare i glicani della parete cellulare vegetale usando microarray e anticorpi monoclonali. Questa tecnica consente analisi ad alto rendimento della composizione polimerica in diverse specie e tessuti.

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IEM desidera ringraziare il Danish Research Council (FTP e FNU) per il finanziamento. ERL riconosce il sostegno di un DP ARC sovvenzione. AB riconosce il sostegno del Centro di Eccellenza in ARC Plant Cell sovvenzione Mura.

1. Raccolta e preparazione dei tessuti <ol><li> Raccogliere 100 mg di peso fresco tessuti vegetali (almeno 10 mg di peso secco) almeno in triplicato per ogni tessuto di interesse. I passaggi seguenti descrivono la preparazione di materiale della parete cellulare nei tessuti vegetali. Nel caso di tessuti di stoccaggio, un-wanted amido viene enzimaticamente rimosso prima di procedere con l&#39;estrazione di polimeri della parete cellulare come descritto in precedenza 13. </li><li> Omogeneizzare i campioni ad una polvere fine con azoto liquido utilizzando un Qiagen TissueLyser II, con 24 set di tubi adattatori e 3 millimetri perline carburo di tungsteno (30 Hz, 2 x 30 sec). In alternativa, se solo pochi campioni vengono elaborati, un mortaio e pestello viene utilizzato. </li><li> Trasferire gli omogenati in 10 ml provette coniche di plastica. </li><li> Preparare parete materiale cellulare lavando i omogenati in 10 ml di 80% v / v di etanolo a temperatura ambiente e vortexando energicamente per 2 minuti. </li><li> Centrifugare i campioni a 3.500 xg ed eliminare il surnatante. Ripetere l&#39;etanolo 70% lava almeno tre volte o finché il supernatante è chiara, particolarmente per tessuti contenenti clorofilla. </li><li> Eseguire un lavaggio finale con il 100% di acetone e lasciare le palline contenenti residui di alcool insolubili (AIR) per asciugare durante la notte. </li><li> Sieve i campioni AIR con a mm 0,4 2 maglie per ottenere una polvere fine, omogenea e di togliere più grande, mal particelle di terra che a volte rimangono nel omogeneizzato. </li><li> Pesare 10 mg di campione di aria in microprovette, ognuna contenente 3 mm perle di vetro per facilitare la miscelazione dei campioni. </li></ol> 2. Estrazione di glicani parete cellulare <ol><li> Pectine, e polimeri associati pectine sono estratti dai campioni aggiungendo 500 pl di 50 mM CDTA (pH 7,5) per ogni campione. </li><li> Brevemente vortex le provette per assicurare il solvente è in contatto con il campione e quindi miscelare con il TissueLyser per 3 ore a 8 Hz. </li><li> Centrifugare i campioni a 12.000 xg, accuratamente rTogliete il surnatante e conservare a 4 ° C. </li><li> Lavare pellet in 1 ml di acqua deionizzata per diluire e rimuovere qualsiasi residuo di solvente, vortex e centrifugare a 13.000 x g. Ripetere questo passo senza disturbare il pellet e rimuovere il liquido da tutte le provette prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Reticolanti glicani sono sequenzialmente estratte dal rimanente parete cellulare pellet con 500 ml di NaOH 4M con 0,1% w / v NaBH4, utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4 per l&#39;estrazione CDTA. NaBH 4 viene aggiunto per ridurre l&#39;aldeide (o cheto) gruppo alla fine ridurre i polisaccaridi ad un alcool impedendo così di base di polisaccaridi peeling. </li><li> Dopo centrifugazione, supernatanti vengono nuovamente rimosso, conservato a 4 ° C, e il pellet lavato due volte in acqua deionizzata prima di procedere alla prossima estrazione. </li><li> Come passaggio facoltativo, polimeri residui, quali cellulosa sono estratte con 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane con 0,78 M CdO), utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4. In alternativa, assoluta contenuto cellulosico in pellet rimanenti può essere determinato mediante saggi acetico / nitrico (vedi la discussione). </li></ol> 3. Stampa Microarrays <ol><li> Surnatanti centrifuga contenente estratto polimeri della parete cellulare a 13.000 xg per rimuovere particelle. </li><li> Carico 50 pl di ciascun campione in un polipropilene 384 ben micropiastra utilizzando un pre-progettati layout personalizzato in cui sono disposti i campioni secondo il tipo di tessuto e del tipo di estrazione. </li><li> Diluire il campione della parete cellulare di polimero in una serie di diluizione × 0, 5 e 25 in serie con acqua deionizzata. </li><li> Parametri come altezza perno, la raccolta e il tempo di permanenza, e fasi di lavaggio sono impostati sul software controllo del micro-distributore. </li><li> L&#39;umidità della camera di stampa è controllata al 60% per evitare l&#39;evaporazione del campione. </li><li> Il lavoro di stampa viene avviato utilizzando LabNEXT Software e un programma che corrisponde al layout microarray. </li><li> Il robot utilizza sugli canali capillari per stampare soluzioni del campione nella piastra 20 x 20 centimetri membrana di nitrocellulosa che è attaccata ad una piastra piana nella macchina. Ogni punto della matrice contiene 15 nl di soluzione ed è stampato in triplice copia. </li><li> Microarrays identiche sono stampate una accanto all&#39;altra sulla membrana e tagliate in singoli array dopo il processo di stampa. </li><li> In ogni esperimento le matrici possono essere modificati per ospitare campioni più o meno, diluizioni o replicati. </li></ol> 4. Probing di Microarrays glicano <ol><li> Dopo la stampa, bloccare i singoli microarray in 5% w / v latte scremato in polvere sciolto in tampone fosfato (MPBS) a temperatura ambiente per 2 ore per ridurre il legame non specifico. </li><li> Microarrays sonda con anticorpi monoclonali specifici per parete cellulare glicano epitopi per 2 ore in MPBS. La maggioranza dei antib monoclonaleodies contro glicani della parete cellulare sono disponibili in commercio da tre società; Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Servizi Carbosource ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> ) e PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> Comprendono un controllo negativo, un microarray incubate con MPBS e non solo anticorpo primario. </li><li> Lavare le microarrays 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico. </li><li> Misurare i microarrays con anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (HRP) in MPBS per 2 hr. La maggior parte di anticorpi monoclonali contro glicani della parete cellulare richiede anti-mouse o anti-topo anticorpi secondari. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio per 3 volte con PBS per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico. </li><li> Sviluppare i microarray utilizzando cromogenico (3,3-diamminobenzidina) o chemiluminecent (luminol) substrati. </li></ol> 5. Quantificazione <ol><li> Dopo lo sviluppo, la scansione dei microarray individuali usando ad alta risoluzione (1.200 dpi) scanner desktop e salvare le immagini come negativi, file a 16 bit TIFF (Figura 3). </li><li> Calcola l&#39;intensità integrale di ogni macchia con Xplore Software Image Processing (LabNEXT) dotato di uno strumento di griglia automatico. L&#39;intensità macchia integrale deriva dalla somma dei pixel nell&#39;area circostante ogni punto della griglia. </li><li> I dati della griglia per ogni microarray viene esportato come un file txt e può essere importato manualmente in un foglio di calcolo Excel per l&#39;analisi. Uno strumento online ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a> ) è stato sviluppato per tradurre automaticamente ed elaborare i dati di singoli file txt. </li><li> L&#39;intensità media integrale è posto in tutta la stampa si replica e le diluizioni per ottenere una &#39;macchia mediaintensità &#39;valore per ciascun campione (Figura 2). In alternativa, i segnali corrispondenti posto ad un solo valore di diluizione sull&#39;array vengono utilizzati per quantificare la relativa abbondanza epitopo glicano per ogni campione. </li><li> Le intensità relative dei posti medi tra diversi campioni sono presentati come una mappa termica (Figura 4) utilizzando la formattazione condizionale in strumenti heatmapper excel o online ( <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a> ). I dati per ciascun tipo di anticorpo è corretta a 100 e un valore del 5% è imposto per rimuovere segnale di fondo e falsi positivi. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

CoMPP è un metodo rapido e sensibile per la profilatura della composizione glicano di centinaia di piante derivate da campioni in una questione di giorni. Questo metodo integra le piattaforme di batteri o mammiferi già disponibili matrice glycan for high-throughput screening di interazioni di carboidrati composti da glicano proteine ​​leganti, come lectine, recettori e anticorpi 16. Con una grande diversità di sonde disponibili per rilevare glicani parete cellulare, è possibile ottenere informazioni dettaglia...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 3 millimetri perline in metallo duro </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> Microprovette Collection (1,2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> Provette da 1,5 ml microcentrifuga può anche essere usato </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 biglie di vetro millimetri </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di cadmio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-diamminoetano </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 03550 </td><td></td></<html> tr&gt; <tr><td> Nitrocellulosa membrana (dimensione dei pori 0,22 um) </td><td> GE-acqua &amp; Process Technologies </td><td> EP2HY00010 </td><td> diverse membrane pori di dimensioni sono adatte per i tipi di pin diversi </td></tr><tr><td> Xact II micro-distributore robot </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> la Xact II robot è stato dotato di un costume 20 x 20 cm Piatto ceramica a cui è attaccata la membrana di nitrocellulosa </td></tr><tr><td> Xtend perni microarray RM </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> perni devono essere idonei per individuare sulle membrane </td></tr><tr><td> 384 micropiastra pozzetti (polipropilene) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi monoclonali anti-glicani </td><td> Sonde vegetali / CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> Siti; PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.carbosource.net) e Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> Anti-IgG Rat (molecola intera) - anticorpi perossidasi prodotto in capra. </td><td> Sigma </td><td> A9037 </td><td> il tipo di anticorpi secondari dipende l&#39;anticorpo primario utilizzato (ad esempio sollevata in ratto, topo, ecc capra). </td></tr><tr><td> SIGMA VELOCE 3,3 &#39;-diaminobenzidina compresse </td><td> Sigma </td><td> D4293 </td><td> il tipo di reagente sviluppo dipende anticorpi secondari utilizzati e il metodo di rilevamento (colorimetrica, o chemiluminecent). </td></tr><tr><td> SuperSignal Ovest Substrato Pico Chemiluminescente </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> vedi sopra </td></tr><tr><td> Xplore Software Image Processing </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> molti tipi di software con gli strumenti automatici di gridding sono disponibiliper misurare il valore di pixel di spot microarray. </td></tr><tr><td> Polisaccaridi vegetali </td><td> Sigma / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profiling glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Pareti delle cellule vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenee che svolgono un ruolo importante nella fisiologia e sviluppo di impianti e di fornire le materie prime per le società umane (ad esempio, industria del legno, della carta, tessile e biocarburanti) 1,2. Tuttavia, la comprensione la biosintesi e la funzione di tali componenti rimane difficile. Glicani parete cellulare sono chimicamente e conformazione diversa a causa della complessità dei loro elementi costitutivi, i residui di glicosil. Questi legami modulo in più posizioni e differiscono in struttura ad anello, configurazione isomerica anomerico, e in aggiunta, sono sostituiti con un array di non-zucchero residui. Glicano composizione varia in cella e / o tipi di tessuto o anche sottodomini di una singola cella parete 3. Inoltre, la composizione è anche modificato durante lo sviluppo 1, o in risposta a stimoli ambientali 4. In excesso di 2.000 geni hanno pareti cellulari vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenei stati previsti di essere coinvolti nella biosintesi della parete cellulare glicano e la modifica in Arabidopsis 5. Tuttavia, relativamente pochi dei geni biosintetici sono stati caratterizzati funzionalmente 4,5. Reverse approcci genetica sono difficili perché i geni sono spesso differenzialmente espressi, spesso a livelli bassi, tra i tipi di cellule 6. Inoltre, gli studi mutanti sono spesso ostacolati da ridondanza genica o meccanismi di compensazione per garantire un&#39;adeguata funzione della parete cellulare è mantenuta 7. Così nuovi approcci sono necessari per caratterizzare rapidamente la vasta gamma di strutture glycan e per facilitare approcci di genomica funzionale per la biosintesi della parete cellulare comprensione e la modifica. Gli anticorpi monoclonali (mAb) 8,9 sono emersi come un importante strumento per definire l&#39;assetto glicano e la distribuzione negli impianti. Questi riconoscono distepitopi inct presenti all&#39;interno di classi principali di glicani delle cellule delle piante da parete, comprese le pectine, xyloglucans, xylans, mannani, glucani e arabinogalactans. Recentemente il loro uso è stato esteso a grandi esperimenti di screening per determinare la quantità relativa di glicani in una vasta gamma di tipi di tessuto vegetale e contemporaneamente 9,10,11. Qui vi presentiamo un microarray basato su metodo di screening glicano chiamato completa Microarray Profiling Polymer (CoMPP) (Figure 1 e 2) 10,11 che consente più campioni (100 sec) per essere schermati con una piattaforma microarray miniaturizzato con il reagente ridotta e volumi di campione. I segnali piatte su microarray può essere formalmente quantificato per dare semi-quantitativi i dati relativi verificarsi glicano epitopo. Questo approccio è adatto per tenere traccia delle modifiche glycan in sistemi biologici complessi 12 e fornendo una visione globale della composizione della parete cellulare in particolare quando prima conoscenza of questo non è disponibile.

La relativa abbondanza di glicani in sei tipi di tessuto (filamenti antera, polline, ovaie, petali, sepali e lo stigma) di Nicotiana alata fiori è stata determinata utilizzando CoMPP. La Figura 3A mostra un microarray rappresentante che è stato sondato con mAb specifico per JIM5 parzialmente (basso) methylesterified homogalacturonan (HG), un epitopo che si verifica su polisaccaridi pectiche 14. Il JIM5 epitopo viene rilevato in estratti CDTA di tutti i tessuti floreali è tuttavia più alta e più bassa...

Una tecnica chiamata<strong&gt; C</strong&gt; Omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strongOlymer&gt; Profiling (CoMPP) per la caratterizzazione dei glicani della parete delle cellule vegetali è descritto. Questo metodo combina la specificità degli anticorpi monoclonali diretti ad epitopi definiti glicano-miniatura con una piattaforma microarray analisi di screening che consente di occorrenza glicano in un&#39;ampia gamma di contesti biologici.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Le pareti cellulari vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenei che svolgono un ruolo importante nella fisiologia e nello sviluppo delle piante e forniscono il...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare la composizione dei polimeri della parete cellulare in un'ampia gamma di piante o tipi di tessuti mediante l'utilizzo di microarray di glicani. In primo luogo, raccogliere i tessuti vegetali di interesse. Dopo l'omogeneizzazione, preparare i residui insolubili nell'alcol.Estrai quindi i glicani della parete cellulare in modo sequenziale utilizzando CDTA e idrossido di sodio. Successivamente, stampa gli estratti di glicani della parete cellulare su un microarray mediante un robot. Prova i microarray con anticorpi monoclonali diretti contro i glicani della parete cellulare e quantifica i segnali dei punti sui microarray.In definitiva, i risultati possono essere utilizzati per determinare l'abbondanza relativa di epitopi glicanici in un insieme di campioni di interesse. Abbiamo sviluppato questo metodo di microarray quando abbiamo riconosciuto la necessità di ottenere una visione globale della presenza di glicani della parete cellulare in diversi tipi di tessuti vegetali simultaneamente e di rilevare differenze composizionali. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali, come l'analisi dei m

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Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione di carboidrati muro derivate.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

Un modo rapido per guadagnare è descritto lo studio della struttura di polisaccaridi in una matrice extracellulare. Il metodo sfrutta la specificità del glycosylhydrolases e la sensibilità della spettrometria di massa permette piccole quantità di materiale da analizzare. Questa tecnica è adattabile per essere utilizzato direttamente sul tessuto stesso.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

La cellulosa cristallina è un importante costituente della parete cellulare delle piante. Tuttavia, la sua quantificazione a una risoluzione cellulare è tecnicamente impegnativa.  Qui, riportiamo l'uso della tecnologia della luce polarizzata e delle sezioni trasversali delle radici per ottenere informazioni sulla composizione della parete cellulare con una risoluzione spazio-temporale.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Questo protocollo descrive le tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale delle sequenze di glicosili dell'estremità riducente (RE) e della regione interna degli eterossilani etichettando il RE con 2 amminobenzammide prima dell'idrolisi enzimatica (endossilanasi) e quindi dell'analisi degli oligosaccaridi risultanti utilizzando la spettrometria di massa (MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

Descriviamo un metodo semplice e veloce per la preparazione e l'analisi di N- glicani da diverse cultivar di ravanello (Raphanus sativus).

Analisi di N- glicani da Raphanus sativus cultivar utilizzando PNGasi H+

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

La profilazione polimerica microarray (MAPP) è una tecnica ad alto rendimento per l'analisi della composizione dei glicani in campioni biologici.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) per l'analisi dei glicani ad alto rendimento

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Scopri il metodo CoMPP per caratterizzare i glicani della parete cellulare vegetale usando microarray e anticorpi monoclonali. Questa tecnica consente analisi ad alto rendimento della composizione polimerica in diverse specie e tessuti.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

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