Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare la composizione dei polimeri della parete cellulare in un'ampia gamma di piante o tipi di tessuti mediante l'utilizzo di microarray di glicani. In primo luogo, raccogliere i tessuti vegetali di interesse. Dopo l'omogeneizzazione, preparare i residui insolubili nell'alcol.

Estrai quindi i glicani della parete cellulare in modo sequenziale utilizzando CDTA e idrossido di sodio. Successivamente, stampa gli estratti di glicani della parete cellulare su un microarray mediante un robot. Prova i microarray con anticorpi monoclonali diretti contro i glicani della parete cellulare e quantifica i segnali dei punti sui microarray.

In definitiva, i risultati possono essere utilizzati per determinare l'abbondanza relativa di epitopi glicanici in un insieme di campioni di interesse. Abbiamo sviluppato questo metodo di microarray quando abbiamo riconosciuto la necessità di ottenere una visione globale della presenza di glicani della parete cellulare in diversi tipi di tessuti vegetali simultaneamente e di rilevare differenze composizionali. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali, come l'analisi dei monosaccaridi, è che si tratta di una piattaforma basata su microarray in cui centinaia di campioni possono essere analizzati contemporaneamente. Si tratta di un metodo rapido e completo per profilare la composizione della parete cellulare. Per ogni tessuto di interesse, iniziare con campioni triplicati di 100 milligrammi di peso fresco di tessuti vegetali utilizzando azoto liquido.

Omogeneizzare i campioni fino a ottenere una polvere fine, quindi trasferire l'omogenato in provette coniche di plastica da 10 millilitri per preparare il materiale della parete cellulare. Risospendere l'omogenato in 10 millilitri di etanolo al 80% a temperatura ambiente e vortexare vigorosamente per due minuti. Centrifugare i campioni a 3.500 ×g e scartare il soprannatante.

Ripetere i lavaggi con etanolo al 70% almeno tre volte o fino a quando il soprannatante non diventa limpido. Eseguire quindi un lavaggio finale con acetone al 100%. Raccogliere i residui insolubili nell'alcol e lasciarli essiccare all'aria durante la notte per ottenere una polvere fine e omogenea; setacciare i campioni di residuo insolubile nell'alcol con una maglia da 0,4 millimetri quadrati.

Successivamente pesare 10 milligrammi di campioni di residuo insolubile in alcol in microtubi che contengono ciascuno un’otturazione di vetro da tre millimetri per la miscelazione. Per l’estrazione di pectine e polimeri associati alle pectine, aggiungere 500 microlitri di CDTA 50 millimolari a ciascun campione, vortexare brevemente i tubi e quindi miscelare utilizzando il tissue izer per tre ore a otto hertz. Centrifugare i campioni a 12.000 volte.

Rimuovere con attenzione i soprannatanti e conservarli a quattro gradi Celsius. Lavare i pellet due volte con un millilitro di acqua deionizzata. Rimuovere tutto il liquido dai tubi dal pellet rimanente di parete cellulare.

Procedere all'estrazione dei glicani di cross-linking con 500 microlitri di idrossido di sodio quattro molare con lo 0,1% di idruro di sodio. Utilizzando il processo di estrazione descritto in precedenza, conservare i soprannatanti contenenti i glicani di cross-linking a quattro gradi Celsius. Lavare i pellet due volte con acqua deionizzata.

Quindi, utilizzando 500 microlitri di Cain, estrarre i polimeri residui come la cellulosa mediante centrifugazione, raccogliendo i soprannatanti contenenti i polimeri della parete cellulare per rimuovere qualsiasi materiale particolato. Successivamente, caricare 50 microlitri di ogni campione in una piastra microtitolatrice polipropilenica da 384 pozzetti, seguendo un layout personalizzato predefinito in cui i campioni sono disposti in base al tipo di tessuto e al tipo di estrazione.

Successivamente, diluire i campioni di polimeri della parete cellulare con acqua deionizzata per preparare diluizioni seriali uno a cinque e uno a 25. Impostare parametri come l'altezza della pinza, il tempo di raccolta e di permanenza, e i passaggi di lavaggio per il microarray. Controllare l'umidità della camera di stampa al 60% per prevenire l'evaporazione del campione.

Ora avviare la stampa. Il robot utilizza pin con canale capillare per stampare le soluzioni dalla piastra campione su una membrana di nitrocellulosa fissata a una piastra piatta all'interno della macchina. Ogni spot dell'array contiene 15 nanolitri di soluzione ed è stampato in triplice copia.

Stampare microarray identici l'uno accanto all'altro sulla membrana e tagliarli in array individuali. Per ridurre il legame non specifico, bloccare ogni microarray in una soluzione al 5% di latte in polvere scremato a temperatura ambiente per due ore.

Aggiungere gli anticorpi monoclonali specifici per i glicani della parete cellulare e gli epitopi, e incubare per due ore. Per rimuovere il legame non specifico, lavare le microarray tre volte in PBS per cinque minuti. Successivamente, sottoporre le microarray a sonda con un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi del rafano per due ore, dopo tre lavaggi in PBS di cinque minuti ciascuno.

Sviluppare le microarray utilizzando substrati cromogeni o chemiluminescenti. Scansionare le singole microarray mediante uno scanner desktop ad alta risoluzione. Salvare le immagini come file TIFF negativi a 16 bit.

Calcolare l'intensità integrale di ogni spot utilizzando un software di elaborazione delle immagini dotato di uno strumento di griglia automatica. Successivamente, esportare i dati della griglia per ogni microarray come file di testo. Importare manualmente il file di dati in un foglio di calcolo Excel per l'analisi.

Calcolare l'intensità media del segnale integrato mediando i valori ottenuti da replicati di stampa e diluizioni, ottenendo così un valore medio di intensità del spot per ogni campione. Riportare le intensità medie relative dei spot tra diversi campioni sotto forma di mappa termica utilizzando la formattazione condizionale in Excel o un generatore online di mappe termiche. Utilizzare strumenti per rimuovere il segnale di fondo e i falsi positivi per ogni tipo di anticorpo, correggere i dati al valore 100 e applicare una soglia di cutoff del 5%.

È stato utilizzato un profilo polimerico completo mediante microarray per misurare l'abbondanza relativa di glicani in sei tipi di tessuti: filamenti dell'antera, polline, ovari, petali, staples e stigma di nicotiana. Un gran numero di fiori è stato analizzato; il microarray è stato sottoposto a sonda con l'anticorpo monoclonale JIM five, specifico per un epitopo sui polisaccaridi peptici. Si noti che l'epitopo JIM five viene rilevato negli estratti CDTA di tutti i tessuti floreali.

Tuttavia, è più elevato nel polline e più basso nel tessuto dello stigma. In modo interessante, l'epitopo JIM cinque viene rilevato anche negli estratti di idrossido di sodio del polline, ma non di altri tessuti. Informazioni quantitative si ottengono generando curve standard dei diversi polisaccaridi purificati, che sono stati processati come standard interni sul microarray nel tessuto ovarico.

Circa 157 microgrammi di hoog contenente l'epitopo JIM cinque erano presenti in ciascun campione, corrispondenti a circa l'1,5% del residuo totale della parete cellulare, mentre 625 microgrammi di hoog Ronin contenente l'epitopo JIM cinque erano presenti nel tessuto pollinico, corrispondenti a circa il 6,25% del residuo totale della parete cellulare. L'abbondanza relativa di 15 epitopi glicanici in tutti i tipi di tessuto è riassunta in una mappa termica. L'intensità delle barre di colore è proporzionale all'intensità media aggiustata del segnale per ciascun campione.

Una rappresentazione grafica di questi dati permette un'interpretazione rapida delle differenze nella ricorrenza degli epitopi glicanici tra i diversi tessuti floreali. Questi risultati indicano che singoli epitopi glicanici sono distribuiti in modo unico tra molti tipi di fiori. Ad esempio, l'epitopo LM13 è più abbondante nei filamenti anterici e nei tessuti SE L rispetto ad altri tessuti.

Questo schema è in netto contrasto con quello degli epitopi a catena più corta preferenzialmente rilevati dal MAB LM6. I glicani a legame incrociato presentano inoltre schemi di distribuzione distinti in numerosi tipi di fiori. Ad esempio, l'epitopo LM10 è abbondante nel tessuto dello stilo rispetto ad altri tessuti, ma è assente nel tessuto ovarico.

Gli epitopi glicanici LM 15 xog sono più abbondanti nel petalo e nel filamento dell'antera rispetto ad altri tessuti, mentre gli eteromannani sono più abbondanti nei filamenti anterali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come estrarre e determinare l'abbondanza relativa dei glicani della parete cellulare in un'ampia gamma di piante e tipi di tessuti. Una volta padroneggiati i microarray, questa tecnica può essere completata in tre giorni.

È importante ricordare di trattare i campioni e le repliche in modo coerente a ogni passaggio successivo a questa procedura. Possono essere eseguiti altri metodi, come i saggi con acido acetico-nitrico, per indagare ulteriori quesiti. Ad esempio, qual è il contenuto assoluto di cellulosa residuo dopo l'estrazione sequenziale di pectine ed emicellulose mediante CDTA e idrossido di sodio?

Questa tecnica ha un'ampia applicabilità nel campo della biologia cellulare vegetale per confrontare rapidamente la presenza di glicani in piante modello come Arabidopsis e Fisca, Nutella, così come in altre piante quali cotone, frumento, eucalipto e tabacco.