Name: Drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Scopri il drenaggio manuale del liquido cerebrospinale embrionale nei ventricoli cerebrali di zebrafish per studiare il ruolo del LCS nello sviluppo cerebrale e analizzarne la composizione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute for Mental Health, e la National Science Foundation. Un ringraziamento particolare al Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson e altri membri di laboratorio esclusivo per molte utili discussioni e critiche costruttive, e di Olivier Paugois per l&#39;allevamento dei pesci di esperti.

1. Preparazione Aghi microiniezione e tram cellulare <ol><li> Riempire Eppendorf CellTram olio apparato microiniettore con olio minerale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare aghi microiniezione tirando tubi capillari con Sutter estrattore ago strumenti. </li><li> Montare ago su micromanipolatore collegato a Eppendorf CellTram. </li><li> Attentamente rompere la punta dell&#39;ago. Per le dimensioni della punta uniforme, misurare con un micrometro, o confrontare ad un ago di riferimento. </li><li> Riempire la lunghezza dell&#39;ago con olio, utilizzando il CellTram per spingere l&#39;olio per tutta la lunghezza, facendo attenzione ad evitare eventuali bolle. </li></ol> 2. Preparazione dei Embrioni <ol><li> Colpire i fori in un piatto rivestito di agarosio 1% con una punta 1-200 microlitri pipetta, e rimuovere i tappi di agarosio. Riempire piatto con i media di embrioni (in conformità con le Westerfield 25). </li><li> Utilizzando pinze, embrioni dechorionate sotto stereomicroscopio. </li><li> Trasferimento embrioni dechorionatedin un piatto rivestito di agarosio. </li><li> Per anestetizzare embrioni, aggiungere Tricaine (0,1 mg / ml) al piatto agarosio fino embrioni interrompe il movimento (in conformità con le Westerfield 25). </li></ol> 3. Svuotamento del eCSF <ol><li> Orientare gli embrioni con le code nei fori di agarosio e loro parti posteriori più vicini al micromanipolatore, permettendo la visualizzazione del lato dorsale del cervello. </li><li> Posizionare l&#39;ago al rhombomere 0/1 cerniera-punto o punto più largo del romboencefalo ventricolo (Figura 1A). </li><li> Attenzione forare lamiera del tetto del ventricolo romboencefalo assicurandosi di non passare attraverso la profondità del cervello nel tuorlo. </li><li> Svuotare il eCSF utilizzando il CellTram e raccogliere il fluido in ago microiniezione. Fate attenzione a non tutte le cellule. </li></ol> 4. Raccolta la eCSF per l&#39;Analisi Composizione <ol><li> Una volta che il eCSF viene raccolta in dell&#39;ago, accuratamente arrestare aspirazione dal CellTram. </li><li> Momentove il piatto da sotto l&#39;ago e accuratamente posizionare l&#39;ago in una provetta contenente il tampone desiderato. </li><li> Utilizzando il CellTram, drenare la eCSF fuori l&#39;ago nel buffer cercando di evitare di contaminare la soluzione con olio. </li><li> Al fine di rimuovere le cellule che si sono aspirati insieme, eCSF eCSF centrifuga a 10000 x g. Raccogliere incontaminata eCSF (surnatante) e conservare a -80 ° C fino al momento per ulteriori analisi. </li></ol> 5. Reintroduzione dei fattori selezionati <ol><li> Scolate la eCSF ogni 2 ore durante l&#39;intervallo di tempo desiderato, dal momento che il fluido viene reintegrati entro tale periodo di tempo. Tra il drenaggio punti temporali, rimuovere l&#39;ago e conservare gli embrioni a 28.5 ° C o la temperatura desiderata. </li><li> Caricare secondo ago micropipetta con fattore di controllo. </li><li> Inserire l&#39;ago in micromanipolatore collegato microiniettore. </li><li> Regolare il volume di iniezione a 1 nl misurando la dimensione della goccia in tempo di iniezione di olio e di regolazione e di pressione. </li><li> Iniettare 1-2 nl in ventricoli cerebrali, come descritto in precedenza 26. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso di questa tecnica per drenare manualmente eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish sarà utile per determinare la necessità di eCSF durante lo sviluppo. Inoltre, questa tecnica consente descrizione del profilo proteico eCSF nel corso dello sviluppo embrionale. Identificazione di proteine ​​differenti durante questo periodo consentirà ulteriori indagini sul funzionamento del CSF e il suo ruolo potenziale durante lo sviluppo del cervello. In amnioti, alcuni fattori di cui eCSF (IGF2, FGF2, acido retinoico, e apoli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Eppendorf CellTram olio </td><td> Eppendorf </td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaine polvere </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Tubi capillari </td><td> FHC Inc. </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Liquido cerebrospinale (CSF) è un fluido ricco di proteine ​​contenute nei ventricoli cerebrali. E &#39;presente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei vertebrati e persiste per tutta la vita. Adulto CSF è pensato per attutire il cervello, rimuovere i rifiuti, e portare secreta 1,2 molecole. Nell&#39;embrione adulti e anziani, la maggior parte di CSF è fatta dal plesso coroide, una serie di regioni altamente vascolarizzati secretori adiacenti al cervello ventricoli 3-5. In zebrafish, la coroide plesso è completamente formato a 144 dopo la fecondazione ore (HPF) 6. Prima di questo, negli embrioni dei vertebrati sia zebrafish e altre cui mouse, una quantità significativa di embrionale CSF (eCSF) è presente. Questi dati e studi suggeriscono che il pulcino è neuroepitelio secretoria presto nello sviluppo e può essere la principale fonte di eCSF prima del plesso coroide sviluppo 7. eCSF contiene circa tre volte più proteine ​​than adulto CSF, suggerendo che essa può avere un ruolo importante durante lo sviluppo 8,9. Studi in pulcino e topo dimostrano che i fattori secreti nel eCSF, pressione del fluido, o una combinazione di questi, sono importanti per la neurogenesi, sopravvivenza espressione genica, la proliferazione cellulare, e nella cella neuroepitelio 10-20. Analisi proteomica di umano, ratto, topo, e pulcino eCSF hanno identificato molte proteine ​​che potrebbero essere necessari per la funzione LCR. Questi includono componenti della matrice extracellulare, apolipoproteine, proteine ​​che regolano la pressione osmotica, e proteine ​​coinvolte nella morte cellulare e proliferazione 21-24. Tuttavia, le funzioni complesse del eCSF sono largamente sconosciuti. Abbiamo sviluppato un metodo per la rimozione eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish, consentendo così l&#39;identificazione dei componenti eCSF e per l&#39;analisi del fabbisogno eCSF durante lo sviluppo. Anche se più eCSF possono essere raccolti da altri vertebrati sistemi with embrioni più grandi, eCSF possono essere raccolti fin dalle prime fasi di sviluppo zebrafish, e in condizioni genetiche o ambientali che portano a volume anormale ventricolo del cervello o la morfologia. La rimozione e la raccolta di eCSF permette l&#39;analisi di spettrometria di massa, l&#39;indagine della funzione eCSF, e la reintroduzione di elementi selezionati nei ventricoli di test la loro funzione. Così l&#39;accessibilità del zebrafish precoce consente un&#39;analisi dettagliata della funzione eCSF durante lo sviluppo.

Un esempio di un ventricolo cerebrale drenato viene mostrato nella Figura 1B-C. Ventricoli cerebrali sono crollate, poiché non hanno eCSF (Figura 1B vs C). Come visto in immagini dorsali (Figura 1B-C, e la Figura 2A-D) neuroepitelio romboencefalo fa mantenere la sua morfologia caratteristica e sembra essere aperta nonostante la mancanza di eCSF probabilmente dovuto robuste cerniera punti. Tuttavia, viste laterali (Figura 2A&#39;-D &#39;)</strong...

Presentiamo un metodo per raccogliere il fluido cerebrospinale (CSF) e per creare un sistema che manca CSF nel sistema ventricolare cerebrale embrionale zebrafish. Ciò consente un ulteriore esame della composizione CSF e il suo fabbisogno durante lo sviluppo embrionale del cervello.

Drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish

Il liquido cefalorachidiano (CSF) è un fluido ricco di proteine contenuto all'interno dei ventricoli cerebrali. È presente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei vertebrati e...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un sistema privo di liquido cerebrospinale, o LCS, all'interno del sistema ventricolare del cervello embrionale. Questo risultato si ottiene innanzitutto svuotando manualmente il LCS embrionale, o LCS-e, dai ventricoli cerebrali del pesce zebra. Successivamente, il LCS-e viene raccolto per ulteriori analisi del suo contenuto.Successivamente, i potenziali fattori vengono reintrodotti nei ventricoli cerebrali svuotati. Infine, viene analizzata l'efficacia della rimozione dell'ECSF e della reintroductzione dei fattori sullo sviluppo del cervello. In ultima analisi, la funzione dell'ECSF nei zebrafish può essere dimostrata monitorando aspetti dello sviluppo cerebrale, come la divisione cellulare, la morte cellulare e la neurogenesi.Inoltre, il contenuto del liquido cerebro-spinale embrionale può essere determinato mediante spettrometria di massa. Utilizzando questa tecnica, possiamo iniziare a studiarne la funzione durante lo sviluppo. La metodica può essere applicata anche ad altri sistemi per approfondire la comprensione di patologie che alterano la composizione e i volumi del liquido cerebro-spinale, come l'idrocefalo.All'inizio, rie

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In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.

Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Descriviamo un animale vivo misurazione quantitativa per tutta la permeabilità del cervello zebrafish embrionale. La tecnica analizza la capacità di mantenere fluido cerebrospinale e molecole di differenti pesi molecolari all'interno del lume del tubo neurale e quantifica loro movimento fuori dei ventricoli. Questo metodo è utile per determinare differenze di permeabilità epiteliale e maturazione durante lo sviluppo e la malattia.

Un saggio per permeabilità del neuroepitelio Zebrafish embrionali

Questo video descrive la tecnica di microdissezione del cervello da un pesce zebra adulto. Questo metodo aiuta a ottenere neuorosfere derivate dall'intero cervello che possono essere studiate ulteriormente.

Dissezione cerebrale del pesce zebra: una tecnica di neurobiologia dei pesci

Questo video dimostra la generazione e la differenziazione delle neurosfere primarie. Le cellule staminali neurali del pesce zebra, in presenza di fattori di crescita, proliferano in neurosfere fluttuanti con capacità di auto-rinnovamento, che successivamente si differenziano in cellule gliali e neuroni.

Generazione e differenziazione di neurosfere primarie da cellule staminali neurali di pesce zebra

Fonte: Schramm, P. et al. Imaging in vivo di tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish sveglie e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra l'imaging in vivo dei neuroni cerebellari nelle larve transgeniche di zebrafish, che esprimono proteine fluorescenti nei neuroni di Purkinje. Il processo prevede l'anestetizzazione delle larve, l'immobilizzazione in agarosio e la rimozione accurata della pelle pigmentata per migliorare la...

Imaging in vivo del cervello larvale di pesce zebra per la visualizzazione dei neuroni cerebellari

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l'espressione genica in neurosfere zebrafish.

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Scopri il drenaggio manuale del liquido cerebrospinale embrionale nei ventricoli cerebrali di zebrafish per studiare il ruolo del LCS nello sviluppo cerebrale e analizzarne la composizione.

Drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish

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