Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo flessibile per riprogettare le superfici virali mediante chimica click. Nel primo passaggio di questa procedura, cellule renali embrionali umane vengono infettate con adenovirus di tipo cinque e incubate in presenza dell'amminoacido non naturale azido-omoalanina o del carboidrato N-acetoacetilglucosammina. Dopo due giorni, le particelle di adenovirus marcate con azide vengono raccolte e purificate.

Successivamente, la cicloaddizione azide-ino specifica per chimica viene utilizzata per legare sonde fluorescenti alla superficie di queste particelle. Come spiegato nel protocollo scritto, questo viene eseguito utilizzando uno dei due possibili metodi di legatura, promossa da tensione o catalizzata dal rame. Una cicloaddizione azide-ino catalizzata.

In applicazioni terapeutiche, questi legami possono includere polimeri di polipeptidi o molecole di piccole dimensioni. In questo esperimento, viene utilizzata una sonda fluorescente in modo che la legatura della sonda sulle proteine del capside possa essere dimostrata mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE. Esiste un notevole interesse nello sviluppo di virus come agenti di trasferimento genico, in particolare nel contesto di terapie, consegna genica, terapia oncologica e tecnologia dei vaccini.

In tale contesto, regolare l'interfaccia virus-ospite è particolarmente importante per ottenere le proprietà adeguate al targeting terapeutico del tessuto e alla stimolazione immunitaria. Una serie di altri fattori rivestono importanza nella modulazione dell'interfaccia virus-ospite. A tal fine, abbiamo sviluppato un protocollo di marcatura in due passaggi.

Il primo passaggio consiste nell'introduzione metabolica di un aminoacido non naturale o di uno zucchero non naturale. Questo inserisce un punto d'ancoraggio che può successivamente essere ulteriormente elaborato mediante chimiche estremamente selettive, permettendo di aggiungere ai virus praticamente qualsiasi funzionalità desiderata senza alterare significativamente il virus, la sua infettività o la fitness complessiva, un ostacolo importante e difficile da superare. Dopo aver sterilizzato la cappa e l'attrezzatura di laboratorio, preparare 11 piastre di coltura da 100 millimetri contenenti cellule HEK 293 mantenute in mezzo di crescita per HEK a 37 gradi Celsius.

Quando la coltura cellulare raggiunge una confluenza dell'80-90%, rimuovere il mezzo di crescita da una delle piastre e lavare una volta con tampone TD. Staccare le cellule con un millilitro di tripsina EDTA e incubare per un minuto. Aggiungere nove millilitri di mezzo di crescita e contare il numero di cellule raccolte in questa piastra.

Utilizzando un citometro per emazie, calcolare il numero di particelle di adenovirus necessarie per l'infezione per ciascuna delle 10 piastre di coltura rimanenti. Rimuovere lentamente il mezzo di crescita, quindi lavare con cinque millilitri di tampone TD. Aggiungere un millilitro di tampone per l'infezione e incubare per un'ora durante questo periodo.

Agitare delicatamente le piastre da un lato all'altro ogni 15 minuti dopo l'infezione. Aggiungere con attenzione nove millilitri di mezzo di crescita per le cellule HEK a ciascuna piastra e incubare per ulteriori 18 ore. Da soluzioni concentrate di un HA in Sistine.

Preparare un mezzo di etichettatura HA seguendo il protocollo scritto. Assicurarsi di filtrare prima le soluzioni stock con un filtro per siringa da 0,2 micrometri. Sterilizzare la soluzione stock di metionina per il controllo nello stesso modo, quindi rimuovere con cura il mezzo di crescita e lavare ogni piastra di coltura con cinque millilitri di tampone TD.

Sostituire con 10 millilitri di un mezzo di marcatura HA e incubare le cellule infette per ulteriori sei ore. Le proteine del capside virale verranno ora tradotte in presenza di azo homo alanina e in assenza di metionina. Sostituire con attenzione il mezzo di marcatura con 10 millilitri di mezzo di crescita fresco e incubare per altre 18 ore.

Al termine di questo passaggio, procedere con la procedura di purificazione al punto tre del video. In alternativa, i tag azi possono essere introdotti mediante zuccheri contenenti azi invece dell'amminoacido non naturale a HA. In questo protocollo, il precursore metabolico parassita N-acetoacetil galattosio a precursore del UDPN-acetoacetil glucosamina viene utilizzato, coltivato in presenza di questo zucchero acetico.

L'adenovirus di tipo cinque presenterà gruppi azi solo sulla fibra per eseguire l'etichettatura degli zuccheri. Seguire prima il passaggio uno del video fino al messaggio a schermo. Questo corrisponde al passaggio 1.5 del protocollo scritto.

Preparare la soluzione di marcatura degli zuccheri pipettando prima 100 microlitri di soluzione madre di zuccheri ATO in provette Falcon e lasciando evaporare il metanolo. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di mezzo di crescita per cellule HEK. Coprire le cellule in ogni piastra con 10 millilitri di questo mezzo di marcatura degli zuccheri e incubare a 37 gradi Celsius per 44 ore.

Procedere al passaggio tre per la purificazione. Trasferire il mezzo insieme alle cellule infette dalla piastra di coltura in due provette coniche e centrifugare a 2000 G per 10 minuti. A quattro gradi.

Rimuovere il soprannatante e risospendere ogni pellet in quattro millilitri di tampone TD utilizzando azoto liquido in un bagno a 37 gradi. Eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule infette. Mescolare la sospensione con un vortice tra ogni ciclo.

Centrifugare la sospensione scongelata a 2000 G per 10 minuti per precipitare i detriti cellulari, poiché l'adenovirus utilizzato per l'infezione al passaggio uno conteneva un transgene GFP; l'attività fluorescente a questo passaggio conferma la trasduzione e l'espressione del DNA virale. Preparare con attenzione un gradiente di densità al cloruro di cesio da 1,25 grammi per millilitro a 1,4 grammi per millilitro. Applicare il sopranatante delle cellule lisate sul gradiente di densità e centrifugare a 126.000 G per un'ora a 15 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, dovrebbe essere presente una banda spessa e larga nel tubo da centrifuga. Questo è il virus modificato azi. Utilizzando un ago a stella, perforare il fondo del tubo in modo che il contenuto fuoriesca goccia a goccia; raccogliere con attenzione questo virus.

Le due metodiche di legatura hanno dimostrato la presenza della deformazione. La via promossa da deformazione prevede condizioni di reazione più semplici, ma presenta lo svantaggio di una selezione più limitata di sonde disponibili in commercio per eseguire la legatura promossa da deformazione. Mescolare 50 microlitri di virus modificato con azide nel buffer di conservazione del virus con 0,25 microlitri di soluzione di marcatura Tamara BCN, miscelando mediante leggeri colpetti sulla base del tappo del tubo coperto con stagnola, e ruotare tutta la notte a temperatura ambiente.

Purificare il virus click utilizzando la filtrazione su gel con centris. Preparare le colonne centrifughe equilibrandole con il buffer di conservazione del virus. La cicloadizione catalizzata dal rame deossigenato offre una maggiore disponibilità di sonde, ma presenta lo svantaggio di richiedere attrezzature specializzate per mantenere un'atmosfera deossigenata.

Per eseguire la legatura catalizzata dal rame, deossigenare innanzitutto tutti i materiali e le soluzioni di reazione in un guanto a azoto per sei ore. Trascorso questo periodo, preparare nel guanto la soluzione madre del catalizzatore rameico per avviare la reazione. Aggiungere un microlitro di questa soluzione madre di rame a una soluzione da 50 microlitri costituita dalla sonda virale e dall'agente chelante.

Lasciare procedere la reazione di marcatura durante la notte all'interno del glove box. Purificare il campione mediante filtrazione come indicato al passaggio quattro. Dopo ebollizione, campione virale purificato e marcato e buffer campione per 10 minuti.

Caricare i pozzetti con il virus marcato e i controlli ed eseguire l'elettroforesi. Mantenere il serbatoio coperto con pellicola di alluminio per proteggere la sonda fluorescente dalla luce. Dopo un'ora, utilizzare uno scanner per gel fluorescenti per acquisire l'immagine del gel.

Si noti che i virus integri o non etichettati con I non dovrebbero causare un significativo spostamento dell'etichettatura fluorescente per un HA; i virus prodotti a concentrazione più elevata di HA mostrano un'etichettatura fluorescente maggiore a causa di un grado superiore di incorporazione dell'HA. Si osservi inoltre che il virus etichettato con zucchero esprime i marcatori azi soltanto nella proteina capsidica della fibra. A partire da cellule al 80% di confluenza, sono necessari due giorni per l'infezione nell'etichettatura con azi, cinque ore per il raccolto e la purificazione del virus etichettato, una notte per la reazione di tipo click e due ore per l'analisi mediante SDS-PAGE, per un totale di tre giorni e mezzo. In sintesi, sono stati dimostrati due tipi di metodi di etichettatura con azi e due reazioni di chimica click azide-alchino.

La vostra applicazione e le risorse disponibili dovrebbero determinare quale metodo o metodi siano meglio adatti al vostro scopo. Sebbene tutti i materiali descritti in questo protocollo siano disponibili in commercio, abbiamo riscontrato che la sintesi di zuccheri di acetilacido ialuronico e sonde INE è notevolmente più conveniente dal punto di vista economico e offre una maggiore flessibilità nelle modifiche della superficie virale.