Name: Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Impara a modificare le superfici virali tramite chimica click bioortogonale utilizzando adenovirus. Questo metodo consente di legare sonde fluorescenti per migliorare il targeting specifico nella terapia genica.

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Fare riferimento alla Tabella 1 per la preparazione di tutti i media, tamponi e soluzioni di riferimento in questo protocollo. 1. Produzione di Aha-etichetta Adenovirus <ol><li> Preparare undici da 100 mm piatti di coltura di tessuto di cellule umane embrionali di rene (HEK 293) mantenuti in HEK 293 mezzo di crescita delle cellule (vedi Tabella 1) a 37 ° C fino a quando non hanno raggiunto l&#39;80 - 90% confluenza. (Nota:. Culture confluenza con oltre il 90% possono essere difficili da infettare e non può produrre virus come desiderato) </li><li> Allentare le cellule in uno dei piatti rimuovendo prima il mezzo di crescita, risciacquo una volta con 5 ml di tampone TD, quindi incubando le cellule per un minuto in 1 ml di tripsina-EDTA (1 ×). </li><li> Aggiungere 9 ml di HEK 293 mezzo di crescita cellulare, e utilizza un emocitometro per contare il numero di espianti di cellule HEK 293 da questo piatto. Utilizzare questo numero per calcolare la quantità di adenovirus di tipo 5 (Ad5) richiesto per infezione con un multiplicity di infezione (MOI) valore di 10 PFU / cell. Conto del fatto che per la normale Ad5, l&#39;indice di infettività (rapporto di particelle infettive al numero totale di particelle) è tipicamente 1:20. </li><li> Preparare 10 ml di tampone infezione. </li><li> Rimuovere lentamente il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule provenienti dai dieci capsule di Petri rimanenti, quindi lavare con 5 ml di tampone TD. Aggiungere 1 ml di tampone di infezione per ogni piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora. Durante questo periodo di infezione, far oscillare delicatamente ogni lato piatto di coltura a lato a intervalli di 15 min. </li><li> Dopo l&#39;infezione, aggiungere 9 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare e incubare a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Preparare 100 ml di terreno Aha etichettatura (Met o mezzo di controllo per il controllo). Assicurati di filtrare le soluzioni stock concentrate con un 0,2 micron filtro per siringa sterile prima di preparare i mezzi di comunicazione di etichettatura. </li><li> Cautela (per non lavare via le cellule infette) rimuovere il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule dopo 18 ore unond lavare ogni piatto cultura con 5 ml di tampone TD. </li><li> Rimuovere il TD soluzione tampone di lavaggio e aggiungere 10 ml di mezzo di etichettatura Aha ad ogni piatto cultura. Per un controllo, metionina mezzo di controllo deve essere usato al posto del mezzo di etichettatura Aha in questa fase. </li><li> Incubare le cellule infettate in etichettatura mezzo a 37 ° C per 6 h. L&#39;etichettatura possono essere effettuate in qualsiasi momento tra 12-24 ore post-infezione, ma non dovrebbe essere più lungo di 6 ore di durata. Questo intervallo è stato determinato per massimizzare la sovrapposizione con la traduzione delle proteine ​​virali strutturali, mentre l&#39;infettività garantendo non è significativamente diminuita. 7 </li><li> Rimuovere con cura il mezzo di etichettatura in modo da non interferire con le cellule. Aggiungere 10 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare per ogni piatto e incubare le cellule a 37 ° C per un&#39;altra ora 18. Per minimizzare la perdita di cellule infette durante questa fase, non è necessario rimuovere completamente la soluzione di etichettatura. Il HEK 293 mezzo di crescita cellulare contiene un eccesso di Met che competere con qualsiasi residuo di Aha. </li><li> Passare al punto 3 per la purificazione. </li></ol> 2. Produzione di Adenovirus azido-Sugar-etichetta <ol><li> Seguire la procedura dal titolo Produzione di Adenovirus Aha marcato fino al punto 1.5. </li><li> Preparare 100 ml di zucchero azido-media etichettatura. </li><li> Coprire le cellule con 10 ml di fresco azido-zucchero mezzo etichettatura e incubare a 37 ° C per 44 h. </li></ol> 3. Purificazione di Azide marcati con particelle adenovirali <ol><li> Rimuovere i supporti con le cellule infette da ogni piatto la cultura e il trasferimento ai tubi conici. Centrifugare a 2000 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tampone TD (con 8 ml di tampone TD per 10 piatti). </li><li> Lisare le cellule infettate dai ripetuti (3 o più) cicli gelo-disgelo con un Dewar di azoto liquido e di un bagno di acqua a 37 ° C. Centrifugare a 2000 g per 10 mina 4 ° C per separare i detriti cellulari dal supernatante. </li><li> Preparare un gradiente di CsCl tubo di densità centrifuga prima pipettando 2,5 ml di 1,25 g / ml soluzione di CsCl in un tubo di centrifuga Ultra Clear. Successivamente, utilizzare una pipetta con la sua punta posizionato sul fondo del tubo di aggiungere lentamente 2,0 ml di 1,4 g / ml soluzione di CsCl, facendo attenzione a non disturbare l&#39;interfaccia di gradiente. </li><li> Pipettare il surnatante da 3,2 gradino sulla parte superiore del tubo gradiente di densità CsCl, e se necessario aggiungere tampone TD per riempire il tubo. Centrifugare i campioni in un rotore oscillante a 125.000 g per 1 ora a 15 ° C in un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Dopo il completamento di ultracentrifugazione, le particelle del virus dovrebbe essere visibile come una banda bianca spessa in corrispondenza dell&#39;interfaccia dei due soluzioni CsCl. Effettuare una piccola perforazione sul fondo del tubo con un ago sterile per consentire alla soluzione di scendere goccia a goccia. </li><li> Raccogliere la banda bianca e spessa, che dovrebbe contenere i etichettati Ad5 particelle, taking cura di escludere eccesso di soluzione CsCl. Evitare di raccogliere le proteine ​​cellulari che banda sopra lo strato di virus. Inoltre escludere capsidi virioni vuoti che formano uno strato leggero leggermente sopra la banda di spessore virus bianco. </li><li> Facoltativamente, eseguire una purificazione finale sulle particelle etichettati Ad5. Aggiungere la frazione raccolta dal passaggio a 3,6 a 4 ml tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con 1,35 g / ml soluzione di CsCl. Centrifugare a 125.000 g per 18 ore a 15 ° C e raccogliere la banda spessa bianco che forma al centro del tubo come descritto ai punti 3.5 e 3.6. (Si noti che se il titolo virale è bassa, una banda bianca può non essere visibile dopo la seconda centrifugazione, e non sarà possibile recuperare il virus etichetta). </li><li> Per la conservazione delle particelle virali per lunghi periodi di tempo, dialisi dell&#39;estratto virus raccolto deve essere eseguita contro tampone di stoccaggio virus. Conservare i campioni di virus dializzati a -80 ° C. </li></ol> 4. Lipropagazione di particelle adenovirali modificati con sonde alchino Utilizzo Strain-Promosso Azide-acetilenici cicloaddizione (SPAAC) <ol><li> Ad una soluzione di 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone virus stoccaggio, aggiungere 0,25 pl di soluzione di etichettatura SPAAC. (Fare riferimento alla tabella di reagenti per una lista di venditori di alchini tesi disponibili in commercio). </li><li> Lasciare il ceppo-promosso reazione di cicloaddizione procedere notte a temperatura ambiente. Se un sensibile alla luce sonda (ad esempio TAMRA) viene utilizzato, coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. </li><li> Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6. </li></ol> 5. Legatura delle particelle adenovirali modificati con sonde alchino in rame (I)-catalizzata Azide-acetilenici cicloaddizione (CuAAC) in Atmosfera deossigenato <ol><li> Luogo 7,2 mg di rame (I) bromuro (CuBr) in polvere in un tubo Eppendorf, coperto da un foglio di alluminio. </li><li> Pipettare 1 ml di DMSO in un secondo tubo Eppendorf. </li><li> Preparare50 pl di soluzione di etichettatura CuAAC in un terzo tubo Eppendorf. Coprire con un foglio di alluminio se la sonda alchino è sensibile alla luce (ad esempio TAMRA-alchini). </li><li> Mettere i tre tubi Eppendorf, senza cappuccio, in un sacchetto guanto deossigenato per 6 ore. Tutti i campioni devono rimanere all&#39;interno della borsa guanto fino al completamento della reazione CuAAC. </li><li> Preparare una soluzione stock 50 × di CuBr aggiungendo 1 ml di DMSO a 7,2 mg di polvere di CuBr, entrambi dei quali sono stati deossigenata secondo la fase 5,4. </li><li> Iniziare la reazione CuAAC pipettando 1 ml di questa soluzione stock CuBr a 50 pl della soluzione di etichettatura CuAAC, che è stata deossigenata secondo la fase 5,4. Lasciare la reazione per 12 hr all&#39;interno del sacchetto guanto. </li><li> Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6. </li></ol> 6. Purificazione e lo stoccaggio delle particelle virali con etichetta <ol><li> Purificare i campioni di virus etichettati con Centri-Sep gel filtrazione di spin columns equilibrata con tampone Virus Storage, secondo le linee guida del produttore. </li><li> In alternativa, la purificazione può essere effettuata da dialisi contro tampone Virus stoccaggio. </li><li> Le particelle virali etichetta deve essere conservato a -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE di Adenovirus etichetta Scanning &amp; Gel fluorescente <ol><li> Aggiungere 20 l tampone campione Laemmli (2 ×) a 20 microlitri di virus purificato etichettati e far bollire per 10 min. Centrifugare i campioni per 30 secondi per eliminare eventuali precipitati insolubili. Se il rame è presente residuo dopo purificazione, ebollizione il campione può risultare in strisce spessore di proteine ​​sul gel SDS-PAGE, causando difficoltà durante la visualizzazione. In questo caso, rinunciare ebollizione del campione in questa fase. </li><li> Fissare la cassetta gel elettroforesi alla cella e aggiungere tampone di corsa. Caricare il numero richiesto di pozzetti con i campioni di proteine ​​virali. Utilizzare un pozzetto per caricare pre-STAImarcatori di peso molecolare niti. Eseguire il gel per 1 ora a 200 V. Mantenere la cella elettroforesi coperto con un foglio di alluminio durante l&#39;intero periodo di ridurre fotodegradazione dell&#39;etichetta fluoroforo. </li><li> Per una migliore risoluzione e di rimuovere tutti fluoroforo libero, permettono il colorante tracking per esaurimento del gel durante l&#39;elettroforesi. Fermare il elettroforesi e trasferire rapidamente il gel ad un gel fluorescente e scanner eseguire la scansione del gel per l&#39;emissione di fluorescenza alla lunghezza d&#39;onda appropriata (574 nm per TAMRA). </li><li> Il numero di molecole di colorante coniugati a ciascuna particella virale può essere quantificato misurando la fluorescenza di diverse concentrazioni Tamra standard e confronto con il campione dal passaggio 7,3. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi I risultati osservati di SDS-PAGE e la scansione di gel fluorescente TAMRA-coniugati Ad5 sono mostrati nella Figura 3. Sebbene queste scansioni gel fluorescenti sono state eseguite su campioni modicato via CuAAC, i risultati dovrebbero essere comparabili, quando le sonde vengono legati via SPAAC. Queste scansioni gel indicano che i risultati in materia di etichettatura Aha nella modificazione dei tre Ad5 proteine ​​del capside (esone, Penton, e fibra), mentre l&#39;etichettatura di zucchero modifica solo la proteina del capside Fiber. Inoltre, un aumento della concentrazione di Aha (4 mm vs 32 mm) si traduce in un maggior grado di incorporazione Aha, ma ha anche dimostrato di ridurre l&#39;infettività. 7 risultati precedenti indicano che, per Ad5 prodotta in 4mM Aha, circa il 5% dei siti esposti metionina TAMRA sono modificati, con questo numero crescente al 10% quando 32 mm Aha viene utilizzato. Ciò corrisponde a circa 280 e 510, rispettivamente, coloranti marcati siti per Ad5 particelle. Analisi di zucchero-etichettatura 1 ha indicato che circa 22 dei 36 siti di glicosilazione su Ad5 sono occupati da uno zucchero azido e successivamente etichettati con TAMRA. Se dieci piastre di coltura tissutale sono utilizzati per produrre azide-modificato come descritto Ad5<html> in questo protocollo, 200-300 pl di azide virus-modified dovrebbe essere ottenuta dalla banda bianca raccolto nella fase 3,6, con un titolo di circa 1,5 × 10 12 particelle / ml. Una difficoltà comune di questa procedura è l&#39;assenza di una banda virale in questa fase di purificazione, che può essere attribuita a basso titolo virale. Questo è generalmente il risultato di infettare le cellule che sono o sovra-o sotto-confluenti, o lavando via le cellule - che diventano allentato dalla piastra dopo l&#39;infezione - durante il risciacquo durante la fase 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Protocollo panoramica. Azide contenente Aha o GalNAz viene dapprima inserito in particelle di adenovirus. Legatura con una sonda fluorescente alchino viene quindi eseguita mediante chimica &quot;click&quot;. Infine, SDS-PAGE è usato per dimostrare legatura della sonda fluorescente. IGURA 2 &quot;/&gt; Figura 2. Legatura di sonda alchino su azide-virus modificato tramite (a) SPAAC, (b) CuAAC sotto de-ossigenazione e (c) atmosfera ossigenata. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Scansioni fluorescenti di SDS-PAGE di azide-marcato adenovirus di tipo 5 (Ad5) dopo coniugazione con CuAAC TAMRA-acetilenici. (A) Aha-marcato Ad5, usando due concentrazioni di Aha. Etichettatura sembra verificarsi il esone adenovirus, Penton e fibra proteine ​​del capside, con l&#39;estensione dell&#39;etichettatura crescente con maggiore concentrazione di Aha. (B) Ac 4 adenovirus GalNAz-marcato sembra essere etichettati solo la proteina del capside fibra. <table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Preparazione </td><td> Note </td></tr><tr><td> Ad5 di accumulo </td><td> 5 mM Tris-HCl (pH 8,0) contenente 0,5 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glicerolo, e 0,05% (w / v) albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 infezione tampone </td><td> 2% (v / v) di siero di vitello bovino, 1 × soluzione TC, Ad5 in tampone di conservazione (volume determinato utilizzando un MOI di 10 PFU / cella e un indice di infettività 1:20). Portare la soluzione al volume finale utilizzando TD tampone </td><td> Ad5 concentrazione può essere determinata attraverso l&#39;assorbimento UV. </td></tr><tr><td> TC soluzione (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl 2, 100 mM MgCl 2 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> TD tampone </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4, e 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 cellule mezzo di crescita </td><td> Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% (v / v) siero di vitello bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Soluzione madre di Cys (100 ×) </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 200 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Aha soluzione stock (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) integrato con 100 mM L-Azidohomoalanine </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Aha etichettatura media </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Aha soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco prima dell&#39;uso. Ciò corrisponde a un mM 4 concentration di Aha, ma le concentrazioni possono essere utilizzati diversi (vedi risultati rappresentativi). </td></tr><tr><td> Met soluzione stock (25 ×) </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 100 mM L-metionina </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Met controllo del mezzo </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Met soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Ac 4 GalNAz soluzione stock (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) in metanolo </td><td> Conservare a 4 ° C. Ac 4 GalNAz è un precursore metabolico GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido di zucchero etichettatura media </td><td> 100 pl Ac 4 GalNAz soluzione madre, 100 ml HEK 293 la crescita delle cellule medie </td><td> Lasciare metanolo evaporare prima di aggiungere HEK 293 mezzo di crescita cellulare. </td></tr><tr><td> Soluzioni di cloruro di cesio </td><td> CsCl sciolto in tampone TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O) </td><td> Gradienti di densità per ultracentrifugazione </td></tr><tr><td> Virus di accumulo </td><td> Soluzione salina tamponata (PBS), pH 7,2, contenente 0,5 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2, e 10% (v / v) glicerolo </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) soluzione di etichettatura </td><td> TAMRA-BCN in DMSO: <ol><li> Utilizzare UV absorbance (OD 260 Assay) per determinare il titolo della soluzione di virus nella fase 4,1 </li><li> Determinare il numero totale di particelle virali in aliquota 50 microlitri (N Ad5) </li><li> Il TAMRA-BCN molarità (in M) è determinato utilizzando: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) Avo N = 6,022 × 10 23 (In modo che la miscela di reazione preparata al punto 4 contiene 100 sonde alchino per virione) </li></ol></td><td> Strain-promosso sonda alkyne Per SDS-PAGE, un titolo virale di circa 10 12 particelle / ml viene suggerito </td></tr><tr><td> TAMRA-alchini (CuAAC) soluzione di etichettatura </td><td> 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone di virus di memorizzazione (N Ad5 determinato come sopra), 1,5 mM Batho<html> fenantrolina disolfonato (cioè 1,5 × concentrazione CuBr finale), TAMRA-acetilenici. TAMRA-alchini molarità (in M) è determinato utilizzando: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (In modo che la miscela di reazione preparata al punto 5 contiene 100 sonde alchino per virione) </td><td> Tampone Tris è noto per essere un ligando competitiva e inibitoria di rame. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli tampone campione (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glicerolo, 10% (v / v) 2-mercaptoetanolo, e 0,004% (w / v) blu di bromofenolo </td><td></td></tr><tr><td> Il tampone di corsa </td><td> 187 mM glicina, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H 2 O </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabella 1. Preparazione dei tamponi e le soluzioni richieste dal presente protocollo.

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Lo sviluppo di reazioni click chemoselective e bioorthogonal, compresi quelli di azidi, è un settore in rapida evoluzione della ricerca, e successivamente vi è un numero crescente di queste reazioni da scegliere per le applicazioni bioconiugazione. Abbiamo ristretto il campo di applicazione di questo protocollo per includere solo due metodi che sono stati scelti per la loro utilità nel nostro laboratorio proprio e la disponibilità commerciale di tutti i reagenti. Nel primo percorso tale - st...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Adenovirus di tipo 5 (Ad5) contenente un transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Rene umano embrionale (HEK 293) cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM), Glucosio alto </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium, no metionina, cisteina no (DMEM-Met /-Cys), Glucosio alto </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Bovine di siero di vitello </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicillina - streptomicina 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% tripsina-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 millimetri Culture Dish cellula, tessuto-cultura polistirene trattata </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Coltura cellulare CO 2 incubatore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosicurezza cabinet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sterile filtro a siringa (0,2 um, acetato di cellulosa) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Provette coniche (50 ml, sterile) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, pareti sottili, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga dotato di un 41 SW e SW 60 rOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Biopur Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifugare 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep gel filtrazione di spin colonne </td><td> Princeton separazioni </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Ago sterile, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borsa azoto guanto (se CuAAC deossigenata deve essere eseguito) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar pallone </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoto liquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elettroforesi delle cellule </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel fluorescente all&#39;interno dello scanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pronta Gel Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disolfonico (BDA) sale disodico </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris base (tris (idrossimetil) amminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disodico fosfato (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecil solfato di sodio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di cesio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Di rame (I), bromuro (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alchino sonda per * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA acetilenici </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Strained Sonda alchino per * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Dibo acetilenici </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * I venditori notevoli di reagenti chimici clic e kit includono Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Fare clic su Strumenti Chimica e Baseclick. Una varietà di coloranti alchino e ligandi di targeting possono essere trovati nei cataloghi di questi venditori.

modifica chemoselective delle superfici virali tramite chimica click bioorthogonal

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

La modifica di particelle virali ha ricevuto una quantità significativa di attenzione per il suo potenziale impatto enorme per terapia genica, le applicazioni oncolitici e sviluppo di vaccini. 1,2,3 attuali approcci per modificare le superfici virali, che sono prevalentemente a base genetica, spesso soffrono di attenuazione della produzione di virus, l&#39;infettività e cellulari di trasduzione. 4,5 utilizzando la chimica chemoselective click, abbiamo sviluppato un approccio diretto alternativo che evita questi problemi, pur rimanendo allo stesso tempo estremamente flessibile e accessibile. 1,2 L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l&#39;efficacia di utilizzare la chimica bioorthogonal click per modificare la superficie di particelle di adenovirus di tipo 5. Questo processo a due fasi può essere utilizzato sia terapeuticamente 1 o analiticamente, 2,6 quanto consente di ligazione chemoselective di molecole targeting, coloranti o altre molecole di interesse su proteinepre-etichettati con tag azide. I tre principali vantaggi di questo metodo sono che (1) etichettatura metabolica dimostra poco o nessun impatto sulla fitness virale, 1,7 (2) una vasta gamma di leganti effettrici può essere utilizzato, e (3) è notevolmente veloce, affidabile e di facile accesso. 1,2,7 Nella prima fase di questo procedimento, le particelle di adenovirus sono prodotti tenendo sia azidohomoalanine (Ah, un surrogato metionina) o zucchero innaturale O-legato N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), entrambi i quali contengono l&#39;azide (N-3) funzionali gruppo. Dopo purificazione dei azide modificati particelle virali, una sonda alchino contenente la parte fluorescente TAMRA è ligato in modo chemoselective alle proteine ​​pre-marcate o glicoproteine. Infine, un SDS-PAGE analisi viene eseguita per dimostrare la legatura successo della sonda sulle proteine ​​del capside virale. Incorporazione Aha è mostrato per etichettare tutti i capside viraleproteine ​​(esone, Penton e fibra), mentre O-GlcNAz risultati incorporazione di etichettatura di Fiber solo. In questo campo in continua evoluzione, diversi metodi per azide-alchino legatura sono stati sviluppati con successo, ma solo i due che abbiamo trovato per essere più conveniente sono qui dimostrato - strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in atmosfera deossigenata.

Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l&#39;innaturale azidohomoalanine analogo dell&#39;acido amino o lo zucchero azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Il gruppo azide di ciascuno è legato chemoselectively via &quot;scattano&quot; le reazioni di chimica come mezzo di modifica della superficie virale.

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

La modifica delle particelle virali ha ricevuto una notevole attenzione per il suo enorme potenziale di impatto sulla terapia genica, l'oncolisi...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo flessibile per riprogettare le superfici virali mediante chimica click. Nel primo passaggio di questa procedura, cellule renali embrionali umane vengono infettate con adenovirus di tipo cinque e incubate in presenza dell'amminoacido non naturale azido-omoalanina o del carboidrato N-acetoacetilglucosammina. Dopo due giorni, le particelle di adenovirus marcate con azide vengono raccolte e purificate.Successivamente, la cicloaddizione azide-ino specifica per chimica viene utilizzata per legare sonde fluorescenti alla superficie di queste particelle. Come spiegato nel protocollo scritto, questo viene eseguito utilizzando uno dei due possibili metodi di legatura, promossa da tensione o catalizzata dal rame. Una cicloaddizione azide-ino catalizzata.In applicazioni terapeutiche, questi legami possono includere polimeri di polipeptidi o molecole di piccole dimensioni. In questo esperimento, viene utilizzata una sonda fluorescente in modo che la legatura della sonda sulle proteine del capside possa essere dimostrata mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE. Esiste un notevole interesse nello sviluppo di virus come agenti di trasferimento genico, in particolare nel contesto di terapie, consegna genica, terapia oncologica e tecnologia dei vaccini.In tale contesto, regolare l'interfaccia virus-ospite è particolarmente importante per ottenere le proprietà adeguate al targeting terapeutico del tessuto e alla stimolazione immunitaria. Una serie di altri fattori rivestono importanza nella modulazione dell'interfaccia virus-ospite. A tal fine, abbiamo sviluppato un protocollo di marcatura in due passaggi.Il primo passaggio consiste nell'introduzione metabolica di un aminoacido non naturale o di uno zucchero non naturale. Questo inserisce un punto d'ancoraggio che può successivamente essere ulteriormente elaborato mediante chimiche estremamente selettive, permettendo di aggiungere ai virus praticamente qualsiasi funzionalità desiderata senza alterare significativamente il virus, la sua infettività o la fitness complessiva, un ostacolo importante e difficile da superare. Dopo aver sterilizzato la cappa e l'attrezzatura di laboratorio, preparare 11 piastre di coltura da 100 millimetri contenenti cellule HEK 293 mantenute in mezzo di crescita per HEK a 37 gradi Celsius.Quando la coltura cellulare raggiunge una confluenza dell'80-90%, rimuovere il mezzo di crescita da una delle piastre e lavare una volta con tampone TD. Staccare le cellule con un millilitro di tripsina EDTA e incubare per un minuto. Aggiungere nove millilitri di mezzo di crescita e contare il numero di cellule raccolte in questa piastra.Utilizzando un citometro per emazie, calcolare il numero di particelle di adenovirus necessarie per l'infezione per ciascuna delle 10 piastre di coltura rimanenti. Rimuovere lentamente il mezzo di crescita, quindi lavare con cinque millilitri di tampone TD. Aggiungere un millilitro di tampone per l'infezione e incubare per un'ora durante questo periodo.Agitare delicatamente le piastre da un lato all'altro ogni 15 minuti dopo l'infezione. Aggiungere con attenzione nove millilitri di mezzo di crescita per le cellule HEK a ciascuna piastra e incubare per ulteriori 18 ore. Da soluzioni concentrate di un HA in Sistine.Preparare un mezzo di etichettatura HA seguendo il protocollo scritto. Assicurarsi di filtrare prima le soluzioni stock con un filtro per siringa da 0,2 micrometri. Sterilizzare la soluzione stock di metionina per il controllo nello stesso modo, quindi rimuovere con cura il mezzo di crescita e lavare ogni piastra di coltura con cinque millilitri di tampone TD.Sostituire con 10 millilitri di un mezzo di marcatura HA e incubare le cellule infette per ulteriori sei ore. Le proteine del capside virale verranno ora tradotte in presenza di azo homo alanina e in assenza di metionina. Sostituire con attenzione il mezzo di marcatura con 10 millilitri di mezzo di crescita fresco e incubare per altre 18 ore.Al termine di questo passaggio, procedere con la procedura di purificazione al punto tre del video. In alternativa, i tag azi possono essere introdotti mediante zuccheri contenenti azi invece dell'amminoacido non naturale a HA. In questo protocollo, il precursore metabolico parassita N-acetoacetil galattosio a precursore del UDPN-acetoacetil glucosamina viene utilizzato, coltivato in presenza di questo zucchero acetico.L'adenovirus di tipo cinque presenterà gruppi azi solo sulla fibra per eseguire l'etichettatura degli zuccheri. Seguire prima il passaggio uno del video fino al messaggio a schermo. Questo corrisponde al passaggio 1.5 del protocollo scritto.Preparare la soluzione di marcatura degli zuccheri pipettando prima 100 microlitri di soluzione madre di zuccheri ATO in provette Falcon e lasciando evaporare il metanolo. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di mezzo di crescita per cellule HEK. Coprire le cellule in ogni piastra con 10 millilitri di questo mezzo di marcatura degli zuccheri e incubare a 37 gradi Celsius per 44 ore.Procedere al passaggio tre per la purificazione. Trasferire il mezzo insieme alle cellule infette dalla piastra di coltura in due provette coniche e centrifugare a 2000 G per 10 minuti. A quattro gradi.Rimuovere il soprannatante e risospendere ogni pellet in quattro millilitri di tampone TD utilizzando azoto liquido in un bagno a 37 gradi. Eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule infette. Mescolare la sospensione con un vortice tra ogni ciclo.Centrifugare la sospensione scongelata a 2000 G per 10 minuti per precipitare i detriti cellulari, poiché l'adenovirus utilizzato per l'infezione al passaggio uno conteneva un transgene GFP; l'attività fluorescente a questo passaggio conferma la trasduzione e l'espressione del DNA virale. Preparare con attenzione un gradiente di densità al cloruro di cesio da 1,25 grammi per millilitro a 1,4 grammi per millilitro. Applicare il sopranatante delle cellule lisate sul gradiente di densità e centrifugare a 126.000 G per un'ora a 15 gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, dovrebbe essere presente una banda spessa e larga nel tubo da centrifuga. Questo è il virus modificato azi. Utilizzando un ago a stella, perforare il fondo del tubo in modo che il contenuto fuoriesca goccia a goccia; raccogliere con attenzione questo virus.Le due metodiche di legatura hanno dimostrato la presenza della deformazione. La via promossa da deformazione prevede condizioni di reazione più semplici, ma presenta lo svantaggio di una selezione più limitata di sonde disponibili in commercio per eseguire la legatura promossa da deformazione. Mescolare 50 microlitri di virus modificato con azide nel buffer di conservazione del virus con 0,25 microlitri di soluzione di marcatura Tamara BCN, miscelando mediante leggeri colpetti sulla base del tappo del tubo coperto con stagnola, e ruotare tutta la notte a temperatura ambiente.Purificare il virus click utilizzando la filtrazione su gel con centris. Preparare le colonne centrifughe equilibrandole con il buffer di conservazione del virus. La cicloadizione catalizzata dal rame deossigenato offre una maggiore disponibilità di sonde, ma presenta lo svantaggio di richiedere attrezzature specializzate per mantenere un'atmosfera deossigenata.Per eseguire la legatura catalizzata dal rame, deossigenare innanzitutto tutti i materiali e le soluzioni di reazione in un guanto a azoto per sei ore. Trascorso questo periodo, preparare nel guanto la soluzione madre del catalizzatore rameico per avviare la reazione. Aggiungere un microlitro di questa soluzione madre di rame a una soluzione da 50 microlitri costituita dalla sonda virale e dall'agente chelante.Lasciare procedere la reazione di marcatura durante la notte all'interno del glove box. Purificare il campione mediante filtrazione come indicato al passaggio quattro. Dopo ebollizione, campione virale purificato e marcato e buffer campione per 10 minuti.Caricare i pozzetti con il virus marcato e i controlli ed eseguire l'elettroforesi. Mantenere il serbatoio coperto con pellicola di alluminio per proteggere la sonda fluorescente dalla luce. Dopo un'ora, utilizzare uno scanner per gel fluorescenti per acquisire l'immagine del gel.Si noti che i virus integri o non etichettati con I non dovrebbero causare un significativo spostamento dell'etichettatura fluorescente per un HA; i virus prodotti a concentrazione più elevata di HA mostrano un'etichettatura fluorescente maggiore a causa di un grado superiore di incorporazione dell'HA. Si osservi inoltre che il virus etichettato con zucchero esprime i marcatori azi soltanto nella proteina capsidica della fibra. A partire da cellule al 80% di confluenza, sono necessari due giorni per l'infezione nell'etichettatura con azi, cinque ore per il raccolto e la purificazione del virus etichettato, una notte per la reazione di tipo click e due ore per l'analisi mediante SDS-PAGE, per un totale di tre giorni e mezzo. In sintesi, sono stati dimostrati due tipi di metodi di etichettatura con azi e due reazioni di chimica click azide-alchino.La vostra applicazione e le risorse disponibili dovrebbero determinare quale metodo o metodi siano meglio adatti al vostro scopo. Sebbene tutti i materiali descritti in questo protocollo siano disponibili in commercio, abbiamo riscontrato che la sintesi di zuccheri di acetilacido ialuronico e sonde INE è notevolmente più conveniente dal punto di vista economico e offre una maggiore flessibilità nelle modifiche della superficie virale.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

Vi presentiamo un metodo rapido, immobilizzazione reversibile di piccole molecole e gruppi di nanoparticelle funzionalizzate per Surface Plasmon Resonance (SPR) studi, utilizzando sequenziale acquisizione on-chip bioorthogonal chimica di cicloaddizione e antigene-anticorpo.

Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor

Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

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Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

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