High Throughput sequenziale ELISA per la convalida dei biomarcatori di acuta Graft-versus-host disease

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare Eliza sequenziale ad alto rendimento per analizzare in modo efficiente un gran numero di nuovi biomarcatori scoperti dalla proteomica. Ciò si ottiene aggiungendo prima i campioni a una piastra di origine, che viene utilizzata per creare la diluizione per ciascun biomarcatore e per conservare il plasma recuperato tra i test. Successivamente, le Eliza vengono analizzate per ogni proteina al fine di determinare le loro concentrazioni nei campioni dei pazienti.

In definitiva, è possibile valutare l'aumento dei livelli proteici di questi biomarcatori all'inizio delle manifestazioni cliniche della malattia acuta del trapianto contro l'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che gli analizzatori sequenziali possono analizzare più nuove proteine che non sono sempre disponibili con le piattaforme di multiplexing. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della malattia acuta del trapianto contro l'ospite.

Poiché i biomarcatori convalidati attraverso questo metodo sono ora oggetto di studio per l'assistenza clinica. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle complicanze nel trapianto di cellule staminali poetiche post-traumatiche. Può anche essere applicato alla scoperta e alla convalida di biomarcatori per altre malattie come il trapianto di polmone, le complicanze, il cancro ai polmoni o potenzialmente qualsiasi malattia per la quale sarà utile un esame del sangue diagnostico.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto è importante che le fasi multiple siano eseguite in modo coerente per garantire la riproducibilità e la bassa variabilità del lotto Il giorno prima dell'esperimento, centrifugare i campioni di aliquote di plasma per 10 minuti a 15, 300 RCF e quattro gradi Celsius per separare i coaguli nella parte inferiore e i lipidi nella parte superiore dal plasma. Quindi piastra 150 microlitri di plasma non diluito da ciascun campione su una piastra inferiore a V da 96 pozzetti mediante pipettaggio manuale secondo mappe predefinite. Avvolgi la piastra in Paraform e mettila in una camera umana a quattro gradi Celsius per un massimo di 72 ore.

Successivamente, dopo aver ricostituito e diluito l'IL due recettori alfa e il fattore di crescita umano, o anticorpi di cattura HGF, secondo le specifiche del produttore, piastra aliquote di 50 microlitri di ciascun anticorpo in ciascun pozzetto delle rispettive piastre a mezzo pozzetto ad alto legame da 96 pozzetti. Quindi sigillare queste piastre con un sigillante per piastre e incubarle per una notte a quattro gradi Celsius. Ora diluire reg tre alfa con il tampone di rivestimento del produttore secondo il protocollo del produttore e piastra 25 microlitri di soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 3 84 pozzetti no maxor.

Quindi conservare questa piastra sigillata a quattro gradi Celsius il primo giorno dell'esperimento. Iniziare lavando la piastra di test alfa a due recettori IL e bloccandola con blotto in TBS. Dopo aver ricostituito lo standard, impostare una curva standard a otto punti secondo il protocollo del produttore.

Piastra successiva, 50 microlitri di plasma non diluito e 50 microlitri di ogni standard in duplicato dalla piastra di origine alla piastra di prova ELIZA. Quindi incubare la piastra sigillata a temperatura ambiente su un rotatore per piastre impostato a 300 giri/min. Dopo due ore, recuperare il plasma dalla piastra di prova alfa ELIZA del secondo recettore IL e riposizionarlo nella piastra sorgente di plasma non diluita.

Quindi, dopo aver completato l'EIA secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 570 nanometri per i ricchi tre alfa Eliza trasferire prima 10 microlitri di plasma non diluito a una piastra sorgente inferiore con vista separata, quindi aggiungere 90 microlitri del tampone di diluizione fornito dal produttore a ciascun pozzetto per creare una piastra sorgente di diluizione da uno a 10. Dopo aver completato il Reg three alpha Eliza, come da protocollo del produttore, aggiungere la soluzione di arresto alla piastra da 384 pozzetti e leggere la densità ottica di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 620 nanometri. Dopo la ricostituzione e la diluizione dell'elefante e del tn FFR, gli anticorpi di cattura uno, secondo le specifiche del produttore, codificano ciascun pozzetto delle rispettive piastre a mezzo pozzetto ad alto legame da 96 pozzetti con 50 microlitri di anticorpi di cattura.

Quindi incubare le piastre di prova sigillate per una notte a temperatura ambiente per la piastra dell'elefante e a quattro gradi Celsius per la piastra TN FFR a uno. Dopo aver completato l'IL, due recettori alfa Eliza trasferisce 60 microlitri di plasma non diluito su una nuova piastra sorgente. Quindi a 60 microlitri di 1% BSA in PBS in ciascun pozzetto per creare una piastra sorgente di plasma diluita da uno a due.

Successivamente lavare e bloccare la piastra di prova HGF con BLOTTO in TBS e quindi impostare la diluizione della curva standard a otto punti. Dopo aver lavato la piastra, seguendo il passo di blocco della piastra da 50 microlitri, duplicare le aliquote di uno o due plasma diluito e di ogni standard sulla piastra di prova EISA. Quindi incubare la piastra sigillata per una notte a temperatura ambiente su un rotatore per piastre impostato a 300 giri/min.

La mattina successiva, recuperare il plasma diluito da uno a due dalla piastra di prova HGF Eliza e riposizionarlo nella piastra sorgente di plasma diluito da uno a due. Dopo aver completato l'EIA, secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 570 nanometri il secondo giorno dell'esperimento. Trasferire prima 10 microlitri di plasma non diluito in una nuova piastra sorgente, quindi 190 microlitri di BSA all'1% in PBS per ottenere 200 microlitri di plasma diluito da uno a 20

Quindi, dopo aver completato l'elefante, Eliza, secondo il protocollo del produttore, ha letto la densità ottica utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 570 nanometri. Per quello TN FFR, Eliza aggiunge prima 25 microlitri di BSA all'1% e PBS alla piastra sorgente da uno a 20, ottenendo 125 microlitri di plasma diluito da uno a 25 per pozzetto. Quindi, dopo aver completato il TN FFR un EIA secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 570 nanometri per il primo trasferimento I-L-H-E-I-A, 60 microlitri di plasma diluito da uno a due su una nuova piastra sorgente, quindi aggiungere 180 microlitri di diluente IL otto a ciascun pozzetto per ottenere una piastra sorgente di plasma diluita da uno a sei.

Quindi, dopo aver completato l'ILH Eliza secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato da 450 a 570 nanometri. Infine, una volta che tutte le Eliza sono state completate, sostituisci il plasma parlante inutilizzato nell'Eloqua del pensiero e congelalo per un uso futuro. In questo grafico, le densità ottiche per la curva standard di sette diverse piastre ELIZA che misurano le concentrazioni di alfa reg tre corrispondenti ai 1084 pazienti testati per il rapporto iniziale del biomarcatore del trapianto gastrointestinale alfa reg tre contro il biomarcatore della malattia dell'ospite sono mostrate densità ottiche coerenti tra le piastre assicurano misurazioni coerenti della concentrazione proteica tra gli esperimenti.

Le concentrazioni delle proteine nei campioni di plasma sono state calcolate confrontando le densità ottiche del campione con le densità ottiche della curva standard. Una piattaforma di movimentazione robotica può essere utilizzata per aumentare ulteriormente la riproducibilità e ridurre al contempo il volume di plasma utilizzato per l'esecuzione di Eliza e le piastre a pozzetti creative. Durante la pianificazione di questa procedura, è importante eseguire prima EIS, ovvero plasma non diluito, in modo che possa essere recuperato e utilizzato negli esperimenti successivi dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare biomarcatori candidati in qualsiasi malattia di interesse attraverso l'uso universale di Eliza sequenziale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come convalidare più biomarcatori utilizzando E sequenziale utilizzando piccoli volumi di plasma e riducendo al minimo i cicli liberi.