High Throughput sequenziale ELISA per la convalida dei biomarcatori di acuta Graft-versus-host disease

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare l'Elisa ad alto rendimento sequenziale per analizzare in modo efficiente un elevato numero di nuovi biomarcatori scoperti mediante proteomica. Ciò si ottiene innanzitutto aggiungendo i campioni a una piastra sorgente, utilizzata per creare le diluizioni di ciascun biomarcatore e per conservare il plasma recuperato tra un test e l'altro. Successivamente, vengono eseguite le Elisa per ciascuna proteina al fine di determinarne le concentrazioni nei campioni dei pazienti.

In definitiva, è possibile valutare l'aumento dei livelli proteici di questi biomarcatori all'insorgenza delle manifestazioni cliniche della malattia del trapianto contro l'ospite acuta. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che gli analizzatori sequenziali possono analizzare molteplici proteine nuove che non sono sempre disponibili con piattaforme di multiplexing elevato. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della malattia del trapianto contro l'ospite acuta.

Poiché i biomarcatori validati mediante questo metodo sono attualmente oggetto di indagine per l'assistenza clinica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle complicanze successive al trapianto di cellule staminali post-traumatico, può essere applicato anche alla scoperta e validazione di biomarcatori per altre malattie, come il trapianto polmonare, le complicanze, il cancro del polmone o potenzialmente qualsiasi altra malattia per la quale un test diagnostico del sangue possa risultare utile.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è essenziale che le diverse fasi vengano eseguite in modo costante per garantire riproducibilità e una bassa variabilità tra i lotti. Il giorno precedente l'esperimento, centrifugare i campioni di aliquote di plasma per 10 minuti a 15.300 RCF e a quattro gradi Celsius per separare i coaguli sul fondo e i lipidi in superficie dal plasma. Successivamente, distribuire 150 microlitri di plasma non diluito di ciascun campione in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V, utilizzando una pipetta manuale secondo mappe predefinite. Avvolgere la piastra con Parafilm e collocarla in una camera umida a quattro gradi Celsius per un massimo di 72 ore.

Successivamente, dopo aver ricostituito e diluito l'IL-2 receptor alpha e il fattore di crescita umano, o HGF, secondo le specifiche del produttore, distribuire 50 microlitri di ciascun anticorpo in ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti half well ad alta capacità di legame. Quindi sigillare le piastre con un sigillante per piastre e incubarle tutta la notte a quattro gradi Celsius. Ora diluire il reg three alpha con il buffer di rivestimento fornito dal produttore secondo il protocollo indicato e distribuire 25 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti no maxor.

Quindi conservare questa piastra sigillata a quattro gradi Celsius anche il primo giorno dell'esperimento. Iniziare lavando la piastra del test per il recettore IL-2 alfa e bloccandola con blotto in TBS. Dopo la ricostituzione dello standard, allestire una curva standard a otto punti seguendo il protocollo del produttore.

Successivamente, trasferire 50 microlitri di plasma non diluito e 50 microlitri di ciascuno standard in duplicato dalla piastra sorgente alla piastra da test ELISA. Quindi, incubare la piastra sigillata a temperatura ambiente su un agitatore rotante impostato a 300 giri al minuto. Dopo due ore, recuperare il plasma dalla piastra da test ELISA del recettore alfa IL-2 e riposizionarlo nella piastra sorgente di plasma non diluito.

Successivamente, al termine del test EIA secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ogni pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato su 450-570 nanometri per il saggio Eliza per il rich three alpha. Trasferire innanzitutto 10 microlitri di plasma non diluito in una piastra sorgente separata con fondo trasparente, quindi aggiungere 90 microlitri del tampone di diluizione fornito dal produttore in ciascun pozzetto per ottenere una piastra sorgente diluita 1:10. Dopo aver completato il saggio Reg three alpha Eliza secondo il protocollo del produttore, aggiungere la soluzione di arresto alla piastra da 384 pozzetti e leggere la densità ottica di ogni pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato su 450-620 nanometri. Dopo la ricostituzione e la diluizione degli anticorpi capture per elephant e tn FFR uno secondo le specifiche del produttore, codificare ogni pozzetto delle rispettive piastre half-well da 96 pozzetti ad alto legame con 50 microlitri degli anticorpi capture.

Quindi incubare le piastre di prova sigillate durante la notte a temperatura ambiente per la piastra elephant e a quattro gradi Celsius per la piastra TN FFR. Al termine del trasferimento del recettore IL due alfa mediante saggio Eliza, trasferire 60 microlitri di plasma non diluito in una nuova piastra sorgente. Quindi aggiungere 60 microlitri di BSA all'1% in PBS in ciascun pozzetto per ottenere una piastra sorgente di plasma diluita uno a due.

Successivamente lavare e bloccare la piastra del test per HGF con BLOTTO in TBS, quindi preparare la diluizione della curva standard ad otto punti. Dopo aver lavato la piastra, aggiungere 50 microlitri, in aliquote duplicate, di plasma diluito uno a due e di ciascuno standard sulla piastra del test EISA, a seguito del passaggio di bloccaggio. Incubare quindi la piastra sigillata tutta la notte a temperatura ambiente su un agitatore per piastre impostato a 300 RPM.

La mattina successiva, recuperare dal piatto del test HGF Eliza il plasma diluito uno a due e riposizionarlo nel piatto sorgente del plasma diluito uno a due. Al termine dell'EIA, secondo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ogni pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato su 450 a 570 nanometri nel secondo giorno dell'esperimento. Trasferire innanzitutto 10 microlitri di plasma non diluito in un nuovo piatto sorgente e quindi aggiungere 190 microlitri di BSA al 1% in PBS per ottenere 200 microlitri di plasma diluito uno a 20.

Successivamente al completamento del saggio per elefante, Eliza ha letto la densità ottica utilizzando un lettore di piastre impostato su 450-570 nanometri, secondo il protocollo del produttore. Per il saggio TN FFR uno, Eliza ha aggiunto innanzitutto 25 microlitri di BSA all'1% in PBS alla piastra madre uno a 20, ottenendo 125 microlitri di plasma diluito uno a 25 per pozzetto. Dopo aver completato il saggio TN FFR uno EIA secondo il protocollo del produttore, è stata letta la densità ottica di ogni pozzetto mediante un lettore di piastre impostato su 450-570 nanometri; per il trasferimento iniziale dell'I-L-H-E-I-A, sono stati trasferiti 60 microlitri di plasma diluito uno a due in una nuova piastra madre, quindi sono stati aggiunti 180 microlitri di diluente per IL-otto in ogni pozzetto per ottenere una piastra madre di plasma diluito uno a sei.

Quindi, dopo aver completato l'ILH Eliza seguendo il protocollo del produttore, leggere la densità ottica di ogni pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato su 450-570 nanometri. Infine, una volta completati tutti gli Eliza, reinserire il plasma inutilizzato nell'Eloqua e congelarlo per un uso futuro. In questo grafico, vengono mostrate le densità ottiche della curva standard di sette piastre ELIZA diverse, che misurano le concentrazioni di reg three alpha corrispondenti ai 1084 pazienti testati per il rapporto iniziale sul biomarcatore della malattia da trapianto contro l'ospite a livello gastrointestinale. Le densità ottiche costanti tra le piastre garantiscono misurazioni coerenti delle concentrazioni proteiche tra esperimenti diversi.

Le concentrazioni delle proteine nei campioni di plasma sono state calcolate confrontando le densità ottiche dei campioni con quelle della curva standard. Una piattaforma robotica per la manipolazione in condizioni sterili può essere utilizzata per aumentare ulteriormente la riproducibilità, riducendo al contempo il volume di plasma impiegato, eseguendo ELISA in piastre multipozzetto. Nella pianificazione di questa procedura, è importante eseguire prima gli EIS utilizzando plasma non diluito, in modo che possa essere recuperato e riutilizzato in esperimenti successivi dopo lo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare biomarcatori candidati in qualsiasi malattia di interesse attraverso l'uso universale di Eliza sequenziali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come validare più biomarcatori utilizzando E sequenziali, impiegando piccoli volumi di plasma e minimizzando i cicli liberi.