Name: Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Impara a tracciare circuiti neurali geneticamente definiti usando un virus trans-sinaptico e il recettore TVA. Questo metodo ad alto rendimento permette di analizzare microcircuiti neuronali nel sistema nervoso centrale.

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Si desidera ringraziare Sean Whelan per l&#39;assistenza con il salvataggio varianti VSV ricombinanti, e Didem Goz e Ryan Chrenek per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da HHMI (CLC), e # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Usando virus per studiare circuiti neurali è un metodo relativamente elevata velocità di analizzare neuroni collegati. Tuttavia, generando sia VSV e virioni RABV non è banale. Anche se il protocollo di cui sopra per il salvataggio virus dal cDNA è fornito, è ancora una bassa probabilità dell&#39;evento. I livelli di ciascuna delle N, P, L e plasmidi bisogno di essere regolato con precisione, e molte prove e repliche deve essere fatto per garantire soccorso virale. La formazione della particella ribonucleotide incorpora ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cultura dei tessuti&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellule di rene di criceto neonato (BSRT7)</td><td>disponibili su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>disponibili su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmidi pN, pP, pl</td><td>disponibili su richiesta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 60 mm trattato per colture cellulari (TC)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Flacone rettangolare inclinato da 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; con tappo ventilato</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per trasfezione Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Siringa: siringa da 5 ml con attacco Luer-Lock</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringa</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: PEI lineare ad alta potenza</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Centrifugazione virale&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema per filtrazione a vuoto con tubo da 150 ml Corning, poro 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Provette sottili, ultra-trasparenti, da 38,5 ml, 25 x 89 mm per ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotore SW28 per ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Iniezione nei topi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Micropipette capillari</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotasso</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrollore a quattro canali</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Motore da banco M.TXB con controllo rotante C.EMX-1, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>Manopola H.10, cambio rapido</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Trapano a gradini, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Portaelettrodo micr&amp;#8211;do</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Chetamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Ago per iniezione da 30 gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico protettivo</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Strumenti per chirurgia e dissezione&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Materiali per sutura</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissezione e colorazione con anticorpi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Siero di asino</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Anticorpi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montaggio del tessuto&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Vetrini microscopici Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Vetrocopri da 22 x 22, spessore 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Elastomero di silicone</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Smalto trasparente per unghie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antiossidante Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

viral tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

I metodi classici per studiare i circuiti neuronali sono velocità piuttosto bassa. Transsynaptic virus, in particolare la pseudorabbia (PRV) e del virus della rabbia (RABV), e più recentemente virus della stomatite vescicolare (VSV), per lo studio di circuiti, sta diventando sempre più popolare. Questi metodi di throughput superiori usare virus che trasmettono tra neuroni sia in direzione anterograda o retrograda. Recentemente, un RABV modificato per monosinaptico retrograda traccia è stata sviluppata. (Figura 1A). In questo metodo, la (G) gene glicoproteina viene eliminato dal genoma virale, e fornita solo in neuroni mirati. Specificità infezione si ottiene sostituendo un G chimerico, composto del dominio extracellulare del ASLV A-glicoproteina e il dominio citoplasmatico del RABV-G (A / RG), per il normale RABV-G 1. Questo G chimerico infetta specificamente le cellule che esprimono il recettore TVA 1. Il gene che codifica TVA può essere delivered con vari metodi 2-8. Dopo RABV-G infezione di un TVA che esprimono neurone, il RABV può trasmettere ad altri neuroni, sinapticamente collegate in senso retrogrado di natura della sua G privato, che era co-espresso con il recettore TVA. Questa tecnica etichetta un numero relativamente elevato di ingressi (5-10%) 2 su un tipo di cellula definito, fornendo un campione di tutti gli ingressi su un tipo di avviamento definito cella. Recentemente abbiamo modificato questa tecnica da utilizzare VSV come transsynaptic tracciante 9. VSV ha diversi vantaggi, tra cui la rapidità di espressione genica. Qui i dettagli di un nuovo sistema di tracciamento virale utilizzando utile per sondare microcircuiti con risoluzione maggiore VSV. Mentre le strategie originali pubblicati da Wickersham et al. 4 e Beier et al. 9 etichettatura permesso di eventuali neuroni che sul progetto inizialmente-infetti TVA esprimono cellule, qui VSV è stato progettato per trasmettere solo alla TVA-cellule esprimenti (Figura 1B). Il virus viene prima pseudotyped con RABV-G per consentire infezione di neuroni a valle di TVA-neuroni che esprimono. Dopo aver infettato questa prima popolazione di cellule, il virus rilasciato può infettare solo TVA-esprimenti cellule. Perché la diffusione transsynaptic virale è limitata a TVA-esprimenti cellule, presenza di assenza di connettività di tipi cellulari definiti può essere esplorato con alta risoluzione. Un diagramma di flusso sperimentale di questi esperimenti è mostrata in Figura 2. Qui mostriamo un modello di circuito, che di direzione selettività nella retina di topo. Esaminiamo la connettività di starburst cellule amacrine (ZSC) a cellule gangliari della retina (RGC).

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

I metodi classici per lo studio dei circuiti neuronali presentano una produttività piuttosto bassa. I virus transsinaptici, in particolare il virus della pseudorabbia (PRV) e il virus della rabbia...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare una nuova tecnica per analizzare la microcircuitazione nel sistema nervoso centrale. Questo risultato si ottiene innanzitutto definendo una popolazione di neuroni per l'infezione mediante l'espressione del recettore TVA. Come secondo passaggio, il virus transsinaptico viene iniettato nel sistema nervoso centrale, infettando i neuroni primari prescelti.Successivamente, il virus si diffonderà in modo tras-sinaptico solo ai neuroni connessi che esprimono il recettore TVA. Per verificare se questi neuroni sono connessi, si ottengono risultati che dimostrano come questa tecnica possa essere utilizzata per analizzare la microcircuitazione, sulla base della validazione dell'etichettatura di microcircuiti noti e connessi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia e la microscopia, è che si tratta di un metodo ad alto rendimento per l'analisi della circuitazione neuronale.L'idea per questo metodo ci è venuta leggendo il primo studio sul tracciamento virale mono-sinaptico limitato condotto da Wickersham e colleghi. Abbiamo ritenuto che i virus potessero essere ulteriormente ingegnerizzati per studiare i neuroni connessi in modi innovativi. Si prega di consultare il protocollo scritto per i dettagli sul recupero del VSV dal DNA cD utilizzando il sistema vaccinia T7 per generare cellule da sottocoltivare.Aspirare prima il mezzo da quattro piastre da 10 centimetri al 80% confluenti di cellule TV8800 seminate il giorno precedente e sostituirlo con cinque millilitri di DMEM non integrato. Trasfettare ogni piastra con cinque microgrammi del plasmide, codificante la glicoproteina di scelta, seguendo le procedure standard. Dopo circa sei ore dal transfezione, sostituire il mezzo con DMEM integrato con il 10% di FBS e incubare le piastre tutta la notte in un incubatore per colture cellulari impostato a 34 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, al fine di permettere l'espressione della glicoproteina e il suo accumulo sulla superficie.Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo e sostituirlo con cinque millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS; quindi infettare ogni piastra con VSV contenente la glicoproteina chimera MA rabies G a una multiplicità di infezione compresa tra 0,01 e 0,1 e incubare a 34 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo 24 ore, verificare il livello di infezione di ogni piastra mediante microscopia a fluorescenza. Se più del 50% delle cellule è stato infettato, raccogliere il mezzo.Sostituire con cinque millilitri di mezzo fresco e quindi congelare il mezzo raccolto a meno 80 gradi Celsius. Ripetere la procedura di raccolta 24 ore dopo per tre giorni, per un totale di quattro giorni di raccolta. Congelare ogni aliquota del mezzo raccolto dopo che l'ultima aliquota si è completamente congelata a meno 80 gradi Celsius, anche se tutti i campioni di mezzo raccolto a questo punto sono a 37 gradi Celsius; si dovrebbero ottenere 80 millilitri di mezzo raccolto, filtrando il mezzo attraverso filtri da 0,45 micron su ghiaccio.Quindi aliquotare 36 millilitri di virus in un tubo da centrifuga Beckman e concentrare il sopranatante mediante ultracentrifugazione a 80.000 ×g per 90 minuti a 4 gradi Celsius. Assicurarsi che il rotore sia correttamente bilanciato; dopo la centrifugazione, contare in un contenitore contenente candeggina al 10% e utilizzare un aspiratore per rimuovere il liquido dalle pareti del tubo. Successivamente, agitare i tubi contenenti il virus a 120 giri al minuto per un'ora a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet virale nel volume più piccolo possibile, solitamente di circa 30 microlitri.Una volta che il virus è stato risospeso, stringere ulteriormente il virus infettando una piastra a 24 pozzetti di cellule 293T con una serie di diluizioni dieci volte uno a un milione e determinandone il titolo circa due giorni dopo l'infezione. Secondo le procedure standard, le cellule infettate dal virus possono essere rilevate mediante fluorescenza. È importante utilizzare la corretta molina per questi esperimenti.L'obiettivo è ottenere l'espressione del recettore TVA nei tipi cellulari che si desidera mappare. Questo risultato può essere raggiunto esprimendo il recettore TVA mediante metodi virali o attraverso un allele transgenico. Questo esperimento utilizza topi tripli transgenici di età compresa tra le sei e le dieci settimane.Topi esprimenti un allele condizionale TVA verranno incrociati con topi esprimenti un allele chat, Cree. Successivamente, questi topi sono stati incrociati con una linea che esprime un allele fluorescente TD tomato. Il topo transgenico finale esprime TVA e un allele condizionale TD tomato in tutte le cellule che esprimono Cree, comprese le cellule stellate omicron di interesse.E questa espressione può essere visualizzata mediante microscopia a fluorescenza. Verificare le coordinate stereotassiche per la regione di interesse in un atlante del cervello murino e preparare l'apparato stereotassico accendendo il controllore del microiniettore e posizionando lo stantuffo e il supporto dell'elettrodo. Successivamente, riempire all'indietro l'ago con olio minerale per creare un'interfaccia con il virus e posizionare l'ago sullo stantuffo assicurandosi che non vi siano bolle d'aria all'interno dell'ago.Prelevare il virus e metterlo sul ghiaccio. Impostare la micropipetta per aspirare e posizionare il tubo contenente il virus al di sotto della capillare sulla micropipetta. Abbassare la punta della capillare nel virus e aspirare la quantità necessaria di virus per l'esperimento.Dopo la somministrazione della dose preoperatoria di buprenorfina, l'animale viene adeguatamente anestetizzato secondo le linee guida istituzionali. Eseguire una compressione del dito del piede e verificare l'assenza della risposta riflessa. Prima di iniziare la procedura.Posizionare il topo anestetizzato su un tappetino riscaldante appoggiato su un supporto mobile per regolare la posizione dell'animale. Applicare un unguento oculare per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia. Inserire quindi delicatamente il topo nell'apparato stereotassico, inserendo le barre auricolari nel condotto uditivo.Assicurarsi che la testa sia parallela alla base dello stereotassico e non si muova lateralmente. Successivamente, regolare la barretta d'occlusione per aiutare a stabilizzare la testa. Rimuovere il pelo nell'area dell'incisione.Quindi lavare questa zona tre volte con etanolo, seguito da tre lavaggi con iodio. Dopo aver praticato un'incisione sagittale nel tessuto cutaneo con un paio di forbici per esporre il cranio, tirare indietro la pelle usando ganci chirurgici artigianali. Successivamente, aspirare il microcapillare con bgma e utilizzare le manopole per spostare il microiniettore alle coordinate del nucleo genicolato laterale.Una volta localizzato il LGN, praticare un piccolo foro nel cranio nel sito di iniezione. Posizionare la capillare sul foro e abbassarla lentamente in una posizione appena dorsale rispetto alla superficie cerebrale. Questa è la posizione zero della coordinata dorsoventrale.La microcapillare deve essere abbastanza affilata da perforare la dura madre del topo. Abbassarla quindi lentamente fino a una profondità di 2,75 millimetri e iniettare la quantità richiesta di virus a una velocità di circa 100 litri al minuto. Lasciare l'ago nel cervello per circa sette minuti per consentire la diffusione del virus dal sito di iniezione e impedire che il virus risalga lungo l'ago.Estratto quindi molto lentamente nell'arco di due minuti, sollevare l'ago dal sito di iniezione e dall'interno del cervello. Infine suturare la sede chirurgica e monitorare gli animali fino al completo recupero dall'anestesia. Somministrare buprenorfina ogni 12 ore per due giorni.Generalmente, la diffusione trans-sinaptica del VSV può essere osservata circa 24 ore dopo l'iniezione. Tuttavia, tempi di attesa più lunghi determineranno una maggiore diffusione. Dopo l'eutanasia del topo mediante inalazione di anidride carbonica, dissezionare l'occhio in formaldeide al 4% e incubare per un'ora, assicurandosi che l'occhio rimanga completamente immerso.Quindi trasferire l'occhio in una piastra di Petri contenente PBS. Utilizzare una pinzetta numero 55 per rimuovere rapidamente la cornea e staccare e dissezionare la retina dagli altri tessuti. Analisi del preparato intero.Tagliare la retina su un vetrino in modo che giaccia piatta. Posizionare distanziatori di silicone ai bordi del vetrino, coprire con una montatura prolungata in oro e quindi applicare un cover slip in vetro di spessore zero per l'analisi delle sezioni retiniche. Immergere la retina in una soluzione di saccarosio al 30% in PBS fino a quando la retina non affiora.Quindi posizionare la retina in una miscela costituita da un rapporto uno a uno di OCT e soluzione di saccarosio al 30% per tre ore. Infine, congelare rapidamente la retina e conservarla a meno 80 gradi Celsius fino al momento del sezionamento. Questa immagine mostra un esperimento cinetico che dimostra l'infettività delle cellule TVA 800 e delle cellule 2 9 3 T da parte del virus vsv A trattino obliquo rg.I pannelli superiori mostrano cellule TVA 800 a sei ore, un giorno e due giorni dopo l'infezione. I pannelli inferiori mostrano cellule 2 9 3 T negli stessi intervalli di tempo. Il virus si diffonde tra le cellule che esprimono TVA nell'arco di poche ore, mentre la diffusione nelle cellule 2 9 3 T, che non esprimono il recettore TVA, sebbene avvenga, è molto più lenta.La barra della scala rappresenta 100 micron. Questa immagine mostra un'infezione rappresentativa di cellule gangliari retiniche di topi che non esprimono TVA. Gli animali sono stati iniettati nel corpo genicolato laterale con il virus vsv A/RG.Simulato con R-A-B-V-G e il tessuto è stato raccolto due giorni dopo l'iniezione. Qui si osserva un'infezione scarsa, con le cellule gangliari retiniche indicate dalla freccia gialla. Questa immagine mostra un'infezione più densa.Questo può essere ottenuto utilizzando un TI più elevato del virus e un'iniezione di buona qualità, come mostrato qui. Diversi tipi di cellule gangliari retiniche possono essere identificati in base alla morfologia, inclusi le cellule gangliari ad albero piccolo, le cellule gangliari melanopsine di tipo uno, le cellule gangliari selettive alla direzione o DS GCs e le cellule DS GCs on-off. Qui la barra della scala rappresenta 50 micron, come osservato nelle seguenti immagini provenienti da un topo esprimente TVA.La trasmissione di VSVA slash RG dai GC DS on-off ai starburst omici segue il pattern previsto. I GC DS on-off indicati con la freccia bianca, riempiti di verde, trasmettono il virus a numerosi starburst omici indicati dalla freccia gialla. Come si osserva qui, tutte le cellule verdi che non sono GC DS sono co-etichettate con il reporter Cree, indicando che si tratta di starburst omici esprimenti TVA.I GC DS indicati dalle frecce bianche con riempimento verde e le cellule omicron a stella indicate dalle frecce gialle che stratificano i corrispondenti strati della sinapsi interna retinica o IPL, le cellule alle quali il virus si trasmette includono sia quelle on che off. Omicron a stella. I numeri in questa figura indicano gli strati dell'IPL. Una volta acquisita padronanza, l'intero esperimento può essere eseguito in uno o due giorni se effettuato correttamente.La velocità del VSV è uno dei suoi principali vantaggi seguendo questa procedura. Altri metodi, come il channel red o la mappatura dei circuiti basata sugli opsine, possono essere eseguiti per convalidare il tracciamento dei circuiti virali e per analizzare le proprietà di queste connessioni sinaptiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della maggior parte dei diversi passaggi coinvolti nel tracciamento dei circuiti virali, dalla coltivazione del virus fino all'iniezione in vivo e all'analisi dei neuroni marcati con fluorescenza.

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Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

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Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

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