Name: Preparazione di Drosophila Neuroni centrali per In situ Patch di serraggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Impara a preparare i neuroni motori di Drosophila per registrazioni patch clamp in situ. Questo metodo utilizza marcatura GFP e applicazione di proteasi per rimuovere detriti e migliorare l'accesso elettrofisiologico.

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<ol><li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker%2C+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li>
<li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248(2007).</li>
<li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li>
<li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation%2C+inactivation%2C+and+persistent+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li>
<li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-dependent+Ca2%2B+currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li>
<li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li>
<li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li>
<li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na%2B%2FK%2B+pump+current+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63(2006).</li>
<li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li>
<li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li>
<li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080(2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Quando visualizzare le cellule con proteine ​​fluorescenti come la GFP, è importante non sovraesporre la preparazione di troppa luce. Ciò può causare danni foto. Usiamo 100W HBO brevi lampade al mercurio ad arco per l&#39;illuminazione, e si usa anche densità neutra (ND) di 0,8 (filtri ND Chroma 0.3 e 0.5). Per poter valutare la qualità della pulizia buona visibilità è cruciale. Pertanto, filtri ND può essere rimosso per brevi periodi di circa 20 s per più volte. Quando si applica un po &#39...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agente / item </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Proteasi tipo XIV </td><td> Sigma Aldrich USA </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> Microfil ago per iniezione flessibile </td><td> Mondo Strumenti di precisione USA </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari, od 1,5 mm, ID 1,0 mm, nessun filamento </td><td> Mondo Strumenti di precisione USA </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen USA </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Sylgard elastomero Kit 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL ELAST KIT </td></tr><tr><td> Filtro ND set (non montata) </td><td> Chroma </td><td> 22000b serie </td></tr><tr><td> Elettrodi supporto 1-HL-U </td><td> MomentoDispositivi lecular </td><td> 1-HL-U </td></tr></tbody></table>

preparazione di<em&gt; drosophila</em&gt; neuroni centrali per<em&gt; in situ</em&gt; patch di serraggio

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Tempi di generazione brevi e facili tecniche genetiche rendono il moscerino della frutta Drosophila melanogaster un ottimo modello genetico fondamentale nella ricerca neuroscientifica. I canali ionici sono la base di tutti i comportamenti in quanto mediare l&#39;eccitabilità neuronale. Il primo canale ionico tensione gated clonato è stata la tensione di Drosophila gated canale del potassio Shaker 1,2. Verso la comprensione del ruolo dei canali ionici e di eccitabilità della membrana per il funzionamento del sistema nervoso, è utile combinare potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila con registrazioni in situ patch clamp. Per molti anni tali registrazioni sono stati ostacolati dalla piccola dimensione del SNC Drosophila. Inoltre, una guaina robusta fatta di glia e collagene costituivano ostacoli per l&#39;accesso delle patch pipetta neuroni centrali. La rimozione di questa guaina è un presupposto necessario per le registrazioni di patch clamp da ogni neurone del sistema nervoso centrale adulto Drosophila. In anni recentiscienziati sono stati in grado di effettuare in situ registrazioni patch clamp da neuroni nel cervello adulto e 3,4 cordone nervoso ventrale del 5,6 embrionale, larvale 7,8,9,10, e adulti Drosophila 11,12,13,14. Una stabile giga-sigillo è il presupposto indispensabile per una buona patch e dipende contatto pulito della pipetta patch con la membrana cellulare per evitare correnti di perdita. Pertanto, per la cellula intera nelle registrazioni in situ patch clamp da neuroni adulti di Drosophila devono essere puliti a fondo. Nella prima fase, la guaina gangliare deve essere trattata enzimaticamente e rimosso meccanicamente per rendere accessibili le cellule bersaglio. Nella seconda fase, la membrana cellulare deve essere lucidato in modo che nessun strato di materiale glia, collagene o altro possono disturbare giga-sigillo formazione. In questo articolo viene descritto come preparare un neurone identificato centrale nel cordone nervoso ventrale Drosophila, il motoneurone volo 5 (MN5 15), per tutto il c somaticaell di patch clamp. L&#39;identificazione e la visibilità del neurone si ottiene l&#39;espressione mirata di GFP in MN5. Noi non proponiamo di spiegare la tecnica del patch clamp stesso.

In situ di patch clamp registrazioni sono utilizzate per la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni nel circuito intatto. Nel modello Drosophila genetico cerotto bloccaggio è difficile perché il CNS è piccolo e circondato da una guaina robusta. Questo articolo descrive la procedura per rimuovere i neuroni guaina e pulite per le registrazioni successive patch clamp.

Preparazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni centrali per<em&gt; In situ</em&gt; Patch di serraggio

I brevi tempi di generazione e le semplici tecniche genetiche rendono la mosca della frutta Drosophila melanogaster un eccellente modello genetico nelle neuroscienze fondamentali...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare il motoneurone del volo cinque di Drosophila per registrazioni con tecnica del patch clamp in C due. Questo viene ottenuto innanzitutto visualizzando il cordone nervoso ventrale di Drosophila, contenente i motoneuroni del volo marcati con GFP da uno a cinque, mediante un obiettivo immerso in acqua da 40x. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare una pipetta per patch clamp riempita di proteasi e leggermente rotta per applicare la proteasi sui motoneuroni marcati con GFP, al fine di allentare la glia residua e le trachee che ostacolano l'accesso al motoneurone cinque.Successivamente, i detriti, la glia e la trachea vengono rimossi aspirando delicatamente i detriti e la glia ormai staccati nella pipetta ed estraendo la trachea applicando pressione positiva e negativa. In alternativa, a questo punto, si può utilizzare una luce intensa per rimuovere i detriti residui non visibili con la luce fluorescente attraverso un filtro GFP. Alla fine, il motoneurone cinque pulito può essere visto debolmente alla luce intensa, ma appare chiaramente utilizzando la luce fluorescente con un filtro GFP.Dopo aver risciacquato le cellule con solu

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Questa tecnica espone il neuromusculature Drosophila embrionali per immunoistochimica o registrazione elettrofisiologica. E 'utile per studiare eventi precoci nello sviluppo neuromuscolare o l'esecuzione di elettrofisiologia in mutanti che non possono schiudersi.

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Descriviamo la procedura per preparare in...

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

Il video dimostra la registrazione dell'attività elettrica nei neuroni fotorecettori dell'ommatidio di Drosophila stabilendo una configurazione dell'intera cellula. Evidenzia l'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio da parte di impulsi luminosi, con conseguenti urti quantici misurabili.

Registrazioni con morsetto di tensione a cellula intera dai fotorecettori di Drosophila

Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Delle correnti sinaptiche possono essere registrate focale da visualizzati boutons sinaptici alla giunzione neuromuscolare larve instar terza della drosofila . Questa tecnica consente il monitoraggio dell'attività di una singola bouton sinaptica.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.

Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

Impara a preparare i neuroni motori di Drosophila per registrazioni patch clamp in situ. Questo metodo utilizza marcatura GFP e applicazione di proteasi per rimuovere detriti e migliorare l'accesso elettrofisiologico.

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