Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

L'obiettivo generale di questa procedura è lo studio dell'infezione ricorrente da virus herpes simplex o HSV. Questo obiettivo viene raggiunto infettando innanzitutto dei topi in modo tale che diventino infetti in forma latente senza danni alla cornea. Una volta completamente stabilita la latenza, il passo successivo consiste nel riattivare il virus esponendo i topi alla luce UVB; nell'ultima fase, viene raccolto il film lacrimale per la rilevazione dell'eliminazione virale e i topi vengono quindi osservati per almeno cinque settimane al fine di monitorare l'andamento della malattia.

In definitiva, l'entità della malattia che si sviluppa nei topi può essere valutata mediante il punteggio di malattia della cheratite stromale erpetica. Si tratta di una malattia che colpisce molte persone in tutto il mondo. Questa particolare patologia è una delle principali cause di cecità infettiva.

Abbiamo un modello che utilizziamo nei topi per simulare questa particolare malattia. Esistono altri modelli in grado di mimare effettivamente questa patologia, ma riteniamo che questo rappresenti nel modo migliore tale specifica malattia. Vorrei dedicare alcuni minuti oggi per presentare le persone che vedrete in questo video.

Questa è Chloe, che ha lavorato con me negli ultimi mesi. Questo è Nippo, uno studente estivo che lavora in laboratorio. Iniziare l'esperimento coltivando HSV uno su cellule Vero per tre o quattro giorni fino a raggiungere una confluenza dell'80% in un fiasco T uno 50.

A questo punto le cellule saranno arrotondate e si staccheranno facilmente colpendo il fiasco. Trasferire la sospensione cellulare in provette coniche sterili da 50 millilitri, quindi centrifugare le cellule per 15 minuti. Aggiungere 1.510 ×g a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco.

Successivamente, trasferire il soprannatante in provette sterili da 50 millilitri, quindi suddividere un totale di cinque millilitri di terreno tra ciascuna delle provette coniche per la risospensione. Risospendere i pellet grandi, quindi sottoporre i pellet risospesi ad ultrasuoni per un minuto, con due impulsi da un trentaduesimo. Dopo la centrifugazione del soprannatante in una centrifuga ad alta velocità da pavimento, si ottiene un piccolo pellet virale.

Dopo aver scartato il soprannatante, combinare i pellet cellulari con i piccoli pellet virali e sottoporli nuovamente a sonicazione per 45 secondi. Centrifugare quindi la soluzione di cellule e virus sottoposta a sonicazione in una centrifuga da banco per cinque minuti a 280 ×g e 4 °C, quindi aliquotare il soprannatante per la conservazione come ceppo virale a -70 °C, da utilizzare successivamente per la titolazione in piastra.

Diluizioni dieci volte del virus, a partire dal supernatante del ceppo virale da 10 alla zero fino a 10 alla meno otto, due volte da due serie di diluizioni separate, su cellule Vero in piastre sterili a 12 pozzetti, iniziano la procedura di infezione anestetizzando il topo. Il topo deve rimanere completamente anestetizzato per 20-30 minuti per consentire l'assorbimento del virus prima che si risvegli.

Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare un ago da 30 gauge per graffiare la cornea dell'occhio destro. Ora numerare l'animale mediante foratura dell'orecchio. Successivamente, iniettare nel topo un millilitro di siero umano pooled al fine di proteggere le cornee da danni durante l'infezione primaria.

Quindi utilizzare una pipetta da 20 microlitri per infettare l'occhio graffiato con 10 alla sesta unità formanti placche e aggiungere cinque microlitri di HBSS nell'altro occhio per mantenerlo umido mentre l'animale è anestetizzato, al fine di confermare l'infezione. Idratare un'applicatore di cotone sterile con un millilitro di terreno Vero. Tre giorni dopo l'infezione, tamponare l'occhio infetto con l'applicatore, quindi trasferire 100 microlitri del terreno prelevato su cellule Vero coltivate in piastre a 48 pozzetti, almeno cinque settimane dopo l'infezione primaria.

Tampone l'occhio infetto di un topo anestetizzato come appena mostrato. Contrassegni il prelievo come giorno zero sul coperchio della piastra a 48 pozzetti per controllare i battiti spontanei. Successivamente, posizioni il topo su un transilluminatore in grado di emettere luce UVB con una lunghezza d'onda di picco di 302 nanometri, in modo che un solo occhio sia esposto alla luce UVB, ed esponga il topo a 250 millijoule di luce UVB per centimetro quadrato.

Poi tamponare l'occhio giornalmente dal giorno uno al giorno sette. Dopo l'irradiazione con UVB, per i tamponi che contengono virus infettivo, quantificare la quantità di virus mediante un saggio standard di placche utilizzando piastre a 12 pozzetti per valutare la malattia oculare clinica nei topi. Posizionare il topo sotto un microscopio stereoscopico binoculare.

L'opacità corneale viene valutata su una scala da zero a quattro, dove zero indica uno stroma chiaro, uno indica un'opacizzazione stromale lieve, due indica un'opacità moderata con iride distinguibile, tre indica un'opacità densa con perdita dei dettagli definiti dell'iride, fatta eccezione per i margini della pupilla, e quattro indica un'opacità totale senza visibilità delle strutture posteriori.

La neovascolarizzazione viene valutata su una scala da uno a otto dividendo la cornea in quattro quadranti uguali e determinando il grado di vascolarizzazione in ciascuno di questi quadranti. In questa prima figura, topi infettati in forma latente sono stati indotti a riattivare l'infezione mediante irradiazione UVB, quindi è stato monitorato l'opacità corneale nei topi per 35 giorni. Questi dati dimostrano che i topi maschi C57BL/6 presentano un'opacità corneale significativamente inferiore rispetto ai topi femmine C57BL/6, poiché nei topi femmine C57BL/6 si è osservata una malattia indotta dal virus significativamente maggiore nei giorni compresi tra il 14° e il 35°.

Allo stesso modo, quando la neovascolarizzazione corneale è stata valutata nelle stesse condizioni sperimentali, i topi maschi hanno mostrato una crescita significativamente minore di nuovi vasi nella cornea rispetto ai topi femmine, e ancora una volta si osserva una malattia indotta dal virus significativamente maggiore nei topi C 57 black six femmine dai giorni 14 al 28. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di anestetizzare completamente i topi in modo che rimangano addormentati per un periodo compreso tra 20 e 30 minuti. Dopo aver visto questo video, spero che abbiate compreso come utilizzare il modello murino di cheratite stromale ricorrente per studiare questa malattia umana.