L'ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino
December 1st, 2012
Questo articolo e il video di accompagnamento presentare il nostro protocollo per la generazione di tessuto ingegnerizzato intestino nel topo, utilizzando un organoid unità-on-scaffold approccio.
Questo video dimostrerà la nostra tecnica per generare intestino tenue ingegnerizzato nel topo utilizzando un approccio di unità organoidi su scaffolding. In questo esperimento, gli animali sono stati trattati in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e le linee guida del Children's Hospital, Los Angeles Savon Research Institute Animal Care Facility. Il primo passo è l'approvvigionamento dell'intero intestino di topo.
Il topo e gli strumenti sottoposti a eutanasia umana vengono preparati con etanolo al 70% in acqua e viene praticata un'incisione sulla linea mediana per entrare nella cavità peritoneale. L'intestino tenue viene eviscerato e diviso appena distalmente al legamento dei triti. Viene quindi sezionato in modo brusco e senza mezzi termini dal mesentere e dai suoi vasi.
Infine, l'ileo ha un transetto di cinque millimetri prossimale alla valvola ileocecale. L'intestino tenue raccolto mostra di essere in scala. Qui si procede ad aprire l'intestino longitudinalmente lungo il bordo antimesenterico in una soluzione salina tamponata di matassa con una soluzione antimicotica antibiotica X.
L'intestino viene quindi eliminato da una materia fecale nel piatto, seguita da tre lavaggi ripetuti con HBSS e una provetta. Il tessuto intestinale affonda sul fondo del tubo e un materiale galleggiante è costituito da detriti mesenchimali e può essere scartato. La soluzione di lavaggio viene rimossa accuratamente con una pipetta.
L'intestino viene poi tritato in pezzi quadrati di meno di un millimetro usando le forbici. Il materiale macinato viene raccolto con una pipetta automatica. Il materiale di lavaggio tritato è ora pronto per la digestione.
La soluzione digestiva contiene DASE 0,125 milligrammi per millilitro e collagenasi 800 unità per millilitro in HBSS con antibiotico antimicotico. Si noti il colore brunastro della soluzione digestiva rispetto all'HBSS con antibiotico antimicotico. È preparato al momento e vengono aggiunti 10 millilitri al materiale macinato.
Questo viene incubato a 37 gradi Celsius per 20 minuti su un rotatore. Il tessuto viene ulteriormente distrutto dall'iterazione con una pipetta, come mostrato qui. Questo viene ripetuto da 20 a 50 volte fino ad ottenere un aspetto uniforme.
Il puntale della pipetta da 10 millilitri è di dimensioni ottimali. Per questo, la reazione viene interrotta con tre millilitri di DMEM a quattro gradi con il 10% di siero fetale bovino. Il materiale viene centrifugato per 10 minuti.
A 500 giri/min, il surnatante viene scartato e il pellet viene risospeso in un lavaggio di 10 millilitri di DMEM a quattro gradi con il 10% di siero fetale bovino. Questo viene quindi centrifugato per cinque minuti a 800 giri/min per recuperare tutto il tessuto ad eccezione delle singole cellule che rimangono nel surnatante S e vengono scartate. Il pellet contiene le unità organoidi, il materiale più leggero nella parte superiore, indicato dalla pinza e dal materiale della vita.
Al di sotto di questo strato, il DMEM con siero viene rimosso con una pipetta. Prestare attenzione a non sospendere il pellet nella pipetta. Le ultime gocce possono essere rimosse in modo più sicuro con la pipetta di plastica monouso.
Qui è mostrata l'impalcatura in acido poliglicolico o polimero PGA utilizzata nei nostri esperimenti. I due millimetri distali di un puntale per pipetta monouso da 1000 microlitri vengono tagliati con forbici sterili. Carichiamo il polimero con unità organoidi in piastre di coltura a quattro pareti per ridurre al minimo la diffusione del materiale lontano dal polimero.
Le unità organoidi vengono caricate sullo scaffold con la pipetta prima nel lume e poi sulla superficie esterna. Una seconda pinza viene utilizzata per garantire un rivestimento adeguato del lume Prestare attenzione a non interrompere la forma cilindrica del polimero. Il topo ospite utilizzato nel caso di un donatore transgenico è un diabetico immunocompromesso non obeso.
Grave immunodeficiente combinato gamma carente di catena gamma o nod skid gamma animale. In caso contrario, gli ospiti singenici possono essere impiantati per l'impianto. Dopo l'induzione dell'anestesia generale, l'addome viene rasato, preparato e drappeggiato.
Viene praticata un'incisione della linea mediana di 0,5 centimetri. L'Omento maggiore viene identificato e accuratamente eviscerato. Il polimero caricato viene avvolto nell'omento e fissato con una sutura Monocryl da cinque oh.
È di fondamentale importanza che l'omento non sia strappato, altrimenti le cellule potrebbero fuoriuscire nel peritoneo. Il polimero caricato Secured l'omento viene sostituito nell'addome, che è chiuso a strati. Una sutura in Vicryl da quattro ore viene utilizzata in modo interrotto per chiudere.
Prima lo strato muscolare e poi la pelle per l'analgesia postoperatoria, due milligrammi per chilogrammo. Il ketoprofene in acqua sterile viene iniettato come una ruota sottocutanea adiacente all'incisione quattro settimane dopo l'impianto, l'animale ospite viene sottoposto a eutanasia umana e l'incisione originale viene riaperta. Il costrutto di ingegneria tissutale è identificato come un globo e può essere aderente allo stomaco e ai visceri intraaddominali.
Le aderenze vengono bruscamente ridotte e viene recuperato uno steroide di intestino ingegnerizzato tissutale. Qui è mostrato lo steroide raccolto in confronto diretto con il polimero di partenza. In questa immagine, il lume dell'intestino ingegnerizzato è stato aperto bruscamente per rivelare il suo interno.
Il tessuto può essere fissato per l'analisi istologica o utilizzato fresco per vari saggi biologici molecolari, come abbiamo dimostrato in altre pubblicazioni. Qui è mostrata una micrografia a bassa potenza di ematina ed eosina di un tipico costrutto di intestino tenue di successo ingegnerizzato nei tessuti. La freccia sinistra indica il lume rivestito dalla mucosa intestinale e la freccia destra mostra il pancreas dell'ospite.
Che ha aderito al costrutto.
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Panoramica
Questo articolo e il video di accompagnamento presentano un protocollo per generare un intestino ingegnerizzato in topi, utilizzando un approccio basato su unità organoidi su scaffold. Il video dimostra la tecnica e delinea i passi necessari per la procedura.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Rigenerazione degli organi
- Modelli murini
Contesto
- Importanza dello sviluppo di tessuti intestinali funzionali.
- Applicazioni nella medicina rigenerativa e nella modellazione delle malattie.
- Metodi precedenti e i loro limiti.
- Avanzamenti nella tecnologia degli organodi.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per generare intestino tenue ingegnerizzato.
- Migliorare la comprensione dello sviluppo e della funzione intestinale.
- Fornire una piattaforma per future ricerche nelle malattie gastrointestinali.
Metodi utilizzati
- Procura dell'intero intestino di topo.
- Preparazione degli strumenti con etanolo al 70%.
- Incisione mediana per l'accesso alla cavità peritoneale.
- Eviscerazione e dissezione dell'intestino tenue dal mesentere.
Risultati principali
- Isolamento con successo dell'intestino tenue per l'ingegneria dei tessuti.
- Dimostrazione dell'approccio basato su unità organoidi su scaffold.
- Potenziale per ulteriori applicazioni nella ricerca e nella terapia.
- Conformità alle linee guida etiche per l'uso degli animali.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce una base per generare tessuti intestinali ingegnerizzati.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per varie applicazioni.
- Contribuisce al campo della medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables preclinical evaluation of regenerative therapies for short bowel syndrome using a murine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in gastrointestinal disease programs. The use of GMP-compliant reagents and immunocompromised hosts facilitates translational continuity toward human applications. It provides a scalable platform for assessing tissue-engineered constructs prior to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling functional assessment of engineered intestinal tissue in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through preservation of mucosal-mesenchymal interactions critical for stem cell niche maintenance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible tissue constructs for quantitative evaluation of regenerative potential.
- Operational Value: Enables assay readiness via organoid unit isolation and scaffold loading protocols compatible with high-content analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying short bowel syndrome pathophysiology and repair mechanisms.
- Operational Value: Utilizes immunocompromised mouse strains to support human tissue xenografting and cross-species validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through organoid derivation, advances to preclinical validation via implantation in immunocompromised hosts, and supports analytics through histologic and molecular readouts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of intestinal regeneration pathways using transgenic tools available in murine models.
- Screening: Delivers standardized tissue constructs with quantifiable outputs for evaluating pro-regenerative compounds or genetic modifications.
- Analytics: Supports histological, molecular, and functional assessments that inform go/no-go decisions in therapeutic development.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by permitting human tissue testing in mouse xenograft models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative design-test cycles in regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling human intestinal structure and function in a physiologically relevant system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized organoid isolation, scaffold seeding, and implantation techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early evaluation of regenerative therapeutics in a validated disease model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of intestinal regeneration candidates based on functional engraftment and tissue maturation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, organoid culture, and biomaterial handling.
- Dependent on sterile tissue culture facilities, centrifugation equipment, and microsurgical instruments.
- Necessitates cross-team standardization between biology, surgery, and histology groups for consistent outcomes.
- Involves adaptation considerations when scaling from murine to human tissue sources or alternative scaffold materials.
- Limited by the need for postoperative monitoring and euthanasia at defined endpoints for tissue harvest, as described in the protocol.
