Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari

Questo sistema modello biochimicamente definito di grandi vescicole Ella imita la membrana mitocondriale esterna per osservare la funzione delle proteine BCL due in vitro. Per prima cosa, unire i lipidi e creare un film lipidico in una provetta sigillata. Successivamente, preparare una soluzione fresca di LUV e solubilizzare il film lipidico.

Successivamente, eseguire l'estruzione della soluzione lipidica e purificare le grandi Ella Les mediante filtrazione su gel. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le LUV per rilevare un aumento della fluorescenza indotto da detergenti. Infine, il sistema modello di LUV viene impiegato per valutare la funzione e la regolazione di proteine permeabili alla membrana, come le proteine ricombinanti BCL due.

Questo approccio che utilizza vescicole lipidiche di grandi dimensioni presenta diversi vantaggi rispetto ai sistemi esistenti, come le mitocondri. Tali vescicole vengono generate impiegando lipidi purificati in assenza di proteine. Sono biochimicamente definite sia nella composizione che nella dimensione.

Questo permette interpretazioni chiare dei risultati poiché le uniche proteine oggetto della vostra indagine sono quelle che aggiungete. Questo metodo può fornire informazioni meccanicistiche sulle capacità della famiglia BCL-2 di regolare l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi che studiano il rimodellamento della membrana e l'attività permeabilizzante.

Questo includerebbe la macchina dinamica mitocondriale o le tossine formanti batteriche. Lavorare in una cappa con illuminazione minima. Risciacquare una siringa di vetro di tipo Hamilton Gast con cloroformio.

Quindi, in un vial di vetro GL da 1,5 millilitri, combinare i quattro milligrammi di lipidi solubilizzati nel cloroformio. Successivamente, per rimuovere il cloroformio, applicare un flusso delicato di un gas inerte come azoto o argon. Dopo due o tre ore, verificare la presenza di un film lipidico secco sul fondo e sui lati del vial nel buffer LUV.

Preparare soluzioni da 500 microlitri del colorante policationico e del quencher ionico CAS. Le soluzioni da mescolare. Quindi combinare le soluzioni di A NTS e DPX e vortexare per un minuto, poi sottoporre a sonica in un bagno ad ultrasuoni per garantire che le soluzioni siano completamente solubilizzate e omogenee.

Ora aggiungere la soluzione A-N-T-S-D-P-X al film lipidico e sigillare il vial con pellicola di paraffina. Sonificare il film lipidico per cinque minuti; la soluzione apparirà opaca dopo la sonificazione. Assicurarsi che la soluzione sia completamente solubilizzata, poiché aggregati lipidici di piccole dimensioni potrebbero influire negativamente sui passaggi successivi. Controllare anche il fondo e i lati del vial per verificare che non rimanga alcun film lipidico.

Assemblare l'estrusore seguendo le indicazioni del produttore, utilizzando il buffer LUV per inumidire i supporti del filtro e la membrana in policarbonato; stringere la carcassa dell'apparecchio in modo da evitare perdite di volume durante l'estruzione, ma senza eccessiva forza. Per rompere la membrana, provare l'estrusore con il buffer LUV per accertarsi che non vi siano perdite o problemi. Riempire ora la siringa di destra con la soluzione lipidica ed effettuare 31 estrusioni, in modo che le vescicole ELLA di grandi dimensioni attraversino la membrana almeno una volta e si raccolgano nella siringa di sinistra. Nelle prime estrusioni potrebbe essere necessaria una leggera pressione aggiuntiva se la soluzione attraversa improvvisamente e rapidamente la membrana.

Verificare la presenza di rotture nella membrana e sostituirla se necessario. Aggiungere alla colonna in un unico passaggio. Evitare di disturbare l'interfaccia delle perle.

Lasciare defluire il tampone dalla colonna. Quando il flusso si arresta, tappare la colonna e riempirla delicatamente con il tampone LUV, avendo cura di non disturbare le perle. Quindi rimuovere il tappo e raccogliere sei frazioni da un millilitro ciascuna.

Gli AUV di norma eluiscono nelle frazioni tre e quattro e possono essere identificati da un aspetto torbido per riciclare il lavaggio della colonna e conservare a quattro gradi Celsius. Gli UUV nella frazione della colonna vengono rilevati da un aumento della fluorescenza dovuto alla presenza di chaps. Ricordarsi di utilizzare piastre nere opache a 96 pozzetti per tutti gli studi sui LUV.

Pipettare 100 microlitri di tampone LUV o LUV più 0,5% CHAPS in sei pozzetti. Aggiungere a ciascuno cinque microlitri della frazione appropriata e mescolare per la Biotech H One Synergy. Aprire il software Gen5 2.0, impostando una lunghezza d'onda di eccitazione di 355 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nanometri.

Regolare il guadagno di tensione a 125 nella posizione ottica superiore e impostare l'altezza di lettura a 5,5 millimetri. Leggere ora la piastra a 37 gradi Celsius e identificare le frazioni contenenti LUV. Raccogliere le frazioni di LUV purificate.

Questi saggi sono progettati per misurare la capacità delle proteine BCL due di indurre direttamente la permeazione di LUV e anche la regolazione dell'attività di permeazione. Combinare i componenti del saggio nell'ordine indicato. Dettagli sui titoli delle proteine BS e bid sono disponibili nel manoscritto allegato.

Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per i tempi previsti dal saggio. Inserire la piastra nel lettore di micropiastre, che agiterà la piastra e misurerà la fluorescenza come mostrato in precedenza. Questo esperimento utilizza liposomi LUV con detergente OG attivato come controllo positivo per la permeabilizzazione.

È importante notare che le concentrazioni di OG inferiori allo 0,025% non influenzano direttamente la permeazione delle LUV in questo caso. Viene inoltre utilizzato un trattamento con lo 0,5% di CHAPS per determinare la quantità massima di fluorescenza delle LUV per saggio. Un punto di partenza necessario per lo studio della permeazione delle LUV con le proteine della famiglia BCL-2 è stabilire le concentrazioni di Bax e Bid che promuovono il rilascio ottimale.

Queste curve di titolazione di backs e bid mostrano un rilascio di fondo minimo e una sinergia ottimale. In alternativa, la permeazione dei LUV può essere misurata in modo cinetico. Queste letture sono state effettuate ogni due minuti per 30 minuti, con due secondi di agitazione delicata della piastra prima di ogni lettura.

Questo esperimento determina l'influenza di una proteina anti-apoptotica sulla permeabilizzazione di LUV mediata da Bax e Bid. BCL-XL inibisce l'attività di Bax e Bid in maniera dipendente dalla dose. In un saggio di repressione D, l'effetto inibitorio può essere invertito mediante l'aggiunta di proteine contenenti solo il dominio BH3.

Ad esempio, la puma beta si lega a BCL xl, consentendo così a backs e bid di agire in sinergia e di permeabilizzare. Le grandi vescicole ELLA. Una volta padroneggiata questa tecnica per la generazione di grandi vescicole ulari, è possibile effettuare un'analisi rapida ed efficiente delle proteine della famiglia BCL due, dei peptidi e delle piccole molecole in un ambiente biochimicamente definito, simile a quello della membrana mitocondriale esterna. È importante notare che questo saggio consente l'analisi rapida di centinaia di condizioni, utilizzando sia punti finali che parametri cinetici.

Non dimenticare che entrambe le proteine UUV e BCL sono altamente suscettibili ad artefatti indotti dai detergenti. Utilizza attrezzature pulite e prive di detergenti per garantire risultati riproducibili.