La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Questo esperimento utilizza la modulazione selettiva dell'isoforma della proteina chinasi C xms per determinarne le funzioni mitocondriali e cellulari nelle cellule tubulari prossimali renali in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. In primo luogo, isolare le cellule tubulari prossimali renali primarie dal cortice renale o RPC dotate di metabolismo ossidativo, simile a quello dei tubuli prossimali renali.

Infetta in vivo i RPC con vettori adenovirali che esprimono forme attive e inattive dell'isozima della proteina chinasi C. Quindi saggia le diverse funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare per determinare l'effetto dell'isozima sulla capacità mitocondriale di sintetizzare ATP e prevenire la morte cellulare. Esegui anche l'analisi tramite immunoblot delle proteine fosforilate e della chinasi C epsilon nella proteina chinasi C nei lisati cellulari prelevati complessivamente.

I risultati mostrano che l'attivazione della proteina chinasi epsilon regola negativamente la capacità mitocondriale di generare ATP, riduce i livelli cellulari di ATP e la vitalità delle cellule tubulari prossimali renali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come le linee cellulari, è che le colture primarie di cellule tubulari prossimali renali mantengono le funzioni differenziate e il metabolismo ossidativo del tubulo prossimale renale. Poiché le proteine chinasi possono essere utilizzate come bersagli e potenziali agenti terapeutici, le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia, prevenendo il danno renale o accelerando il recupero renale dopo una lesione.

Questo metodo può chiarire il meccanismo di lesione e recupero. Può inoltre essere applicato, ad esempio, al rene di coniglio isolato frescamente, lavandolo in sequenza con 50 millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 sterile, soluzione salina fosfato sterile tamponata a pH 7,4 e soluzione di ossido di ferro in PBS, per raccogliere la corteccia di ciascun rene.

Omogeneizzare prima il tessuto utilizzando un omogeneizzatore da 15 millilitri. Quindi far passare l'omogenato attraverso due setacci in maglia sterile in un becher sterile da un litro. Risciacquare le cellule rimaste sui setacci con un buffer contenente deferoxamina.

Trasferire qualsiasi tessuto rimasto sul fondo del setaccio da 85 micron in 40 millilitri di tampone contenente deferoxamina, posti in un tubo conico da centrifuga. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con il magnete potente.

Catturare i glomeruli contenenti ferro e aspirare il ferro aderente al magnete. Regolare il volume della sospensione cellulare a 40 millilitri e aggiungere un millilitro di mezzo di digestione contenente collagenasi. Incubare a temperatura ambiente per 17 minuti.

Mescolare delicatamente la sospensione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 50 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius dopo diversi lavaggi. Risospendere il pellet cellulare in 46 millilitri di mezzo contenente nessun seme di glucosio.

Piattiare le cellule RT primarie a una densità di un milligrammo di proteina per piatto in due millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 senza glucosio su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rinnovato il mezzo, procedere a infettare le cellule RPT confluenti con adenovirus portatore di CD NA per la proteina chinasi C epsilon costitutivamente attiva o per la proteina chinasi C epsilon dominante negativa, incubare per 24 ore, rinnovare il mezzo e coltivare le RPC primarie trasfettate per ulteriori 24 ore. Per visualizzare la morfologia mitocondriale del monostrato cellulare primario, rinnovare il mezzo, aggiungere MIT tracker red 580 e reinserire i piatti nell'incubatrice per 30 minuti.

Quindi esaminare i monociti vivi al microscopio fluorescente utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua. Obiettivo due. Per valutare la funzione mitocondriale, valutare la respirazione allo stato tre della sospensione di RPTC in una camera di consumo di ossigeno dotata di un elettrodo di tipo Clark.

Prima misurare la respirazione allo stato due in assenza di un DP. Quindi aggiungere un DP fino a una concentrazione finale di 0,4 millimoli. Per avviare la respirazione allo stato tre dalla respirazione allo stato quattro. Aggiungere oligomicina fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.

Includere anche una misurazione della respirazione disaccoppiata aggiungendo 0,5 micromolare di FCCP alle cellule che respirano allo stato tre. Aggiungere lentamente 20 microlitri di soluzione di JC uno 0,5 millimolare a ogni piastra di coltura di RPTC e agitare delicatamente per mescolare completamente il colorante. Reintrodurre le piastre nell'incubatrice per 30 minuti.

Successivamente, posizionare le colture sul ghiaccio ed eseguire due lavaggi con PBS freddo. Quindi raccogliere le cellule. Trasferire le cellule RPT in una provetta einor e dissociare i monostati in sospensione di cellule singole mediante pipettaggio.

Analizzare la fluorescenza mediante citometria a flusso utilizzando l'eccitazione di un laser a ioni di argon a 488 nanometri. Quindi calcolare il potenziale della membrana mitocondriale nei mitocondri isolati. Facilitare la valutazione dell'integrità della catena respiratoria.

Dopo due lavaggi dei monociti RPTC con tampone PBS freddo, raccogliere le cellule e formare il pellet mediante centrifugazione. Lavare il pellet una volta con un millilitro di tampone A, quindi omogeneizzare le cellule in un omogeneizzatore Down fino a quando la maggior parte delle cellule nell'omogenato risulta rotta all'osservazione al microscopio. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità.

Centrifugare le mitocondrie grezze dal soprannatante a 15.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eseguire tre lavaggi delle mitocondrie pellettizzate nel buffer c. Risospendere il pellet mitocondriale in 50-100 microlitri di buffer per il saggio e congelare in azoto liquido per determinare l'attività della NADH ubiquinone ossidoriduttasi. Aggiungere 500 microlitri di buffer per il saggio con aggiunte e mitocondri; includere anche un campione bianco contenente tutte le aggiunte ma privo di mitocondri. Equilibrare la piastra a 30 gradi Celsius con mescolamento per cinque minuti.

Successivamente, posizionare la piastra nello spettrofotometro e aggiungere 10 microlitri di ubiquinone 3,25 millimolare per avviare la reazione in ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza a 340 nanometri per tre minuti a intervalli di 22 secondi. In un saggio analogo, misurare l'attività della citocromo C ossidasi utilizzando citocromo C ridotto come substrato per la reazione della sintasi ATP.

Preparare i mix per il dosaggio dell'attività totale delle APA e dell'attività delle APA insensibili all'oligomicina per ciascun gruppo di trattamento. Incubare i campioni nel mix di reazione a 31 gradi Celsius per 10 minuti. Avviare la reazione aggiungendo un substrato TP e incubare a 31 gradi Celsius per cinque minuti.

Trasferire 200 microlitri della miscela di incubazione in un tubo contenente 50 microlitri di TCA tre molare, precipitare le proteine sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, centrifugare per formare il pellet. Poi caricare una piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di ciascuno standard di fosfato e 50 microlitri di ciascun sopranatante campione in duplicato.

Quindi aggiungere 250 microlitri di reagente di Sumner in ogni pozzetto e incubare a 30 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, registrare l'assorbanza a 595 nanometri. Lavare i monociti di RPTC due volte con tampone PBS freddo di ghiaccio.

Raccogliere le cellule in un millilitro di PBS e trasferire la sospensione cellulare in una provetta Eppendorf. Pellettare i campioni di RPTC mediante centrifugazione e determinare il contenuto di ATP utilizzando il metodo della luciferasi di un kit per saggio bioluminescente dell'ATP. Per l'analisi della vitalità cellulare in piastre da 35 millimetri, utilizzare cinque monocapati di RPTC per tre gruppi di controllo: cellule positive per l'onosi, cellule positive per apoptosi e un controllo senza colorazione, distribuiti su due piastre.

Aggiungere due microlitri di cisplatino 50 millimolari al secondo set. Aggiungere due microlitri di idroperossido di turt-butilo 500 millimolari. Dopo aver colorato le cellule utilizzando l'ioduro di propidio come descritto nel testo allegato, lavare i monociti con il buffer di legame.

Successivamente, colorare le cellule utilizzando l'ANNEXINA V coniugata con ZI come descritto nel protocollo testuale. Quindi raccogliere delicatamente le cellule e sospenderle in 500 microlitri di buffer di legame. Utilizzando un raschietto di gomma.

Utilizzare una pipetta per disperdere le cellule in una sospensione monocellulare e trasferire la sospensione cellulare in provette per citometria a flusso. Disperdere le cellule in una sospensione monocellulare. Procedere immediatamente a quantificare la fluorescenza per PI e FE mediante citometria a flusso. La somministrazione adenovirale di CD NA, rivestendo la forma costitutivamente attiva e le forme inattive del chinasi C epsilon delle proteine chinasi, determina un aumento significativo dei livelli proteici del chinasi C epsilon delle proteine chinasi nell'epitelio tubulare renale prossimale e nei mitocondri.

Come previsto, la forma costitutivamente attiva dell'enzima è fosforilata nei RPTC e l'enzima dominante negativo non è fosforilato. La presenza di proteina chinasi C epsilon attiva riduce la respirazione mitocondriale nei RPTC indipendentemente dal substrato utilizzato per fornire energia ai mitocondri. Tuttavia, la proteina chinasi C epsilon inattiva non ha alcun effetto sulla respirazione mitocondriale.

È interessante notare che l'attivazione della proteina chinasi C epsilon nei TCS delle cellule tubulari renali riduce l'attività dei complessi uno e quattro. Questa diminuzione della respirazione nei TCS è associata a un aumento del potenziale della membrana mitocondriale. Il mutante dominante negativo non ha tale effetto.

Questi cambiamenti sono accompagnati anche da una riduzione dell'attività di una sintetasi di TP nei mitocondri isolati da RPTC che sovraesprimono la proteina chinasi C epsilon attiva. Di conseguenza, il contenuto di ATP nei RPTC che sovraesprimono la proteina chinasi C epsilon attiva è ridotto; l'attivazione sostenuta della proteina chinasi C epsilon ha profondi effetti sulla morfologia mitocondriale, come dimostrato dalla frammentazione mitocondriale.

L'attivazione della proteina chinasi C, ma non la sua inibizione, provoca anche cambiamenti nella morfologia delle cellule tubulari prossimali renali, causando riduzione della dimensione cellulare e allungamento delle cellule sopravvissute. Questi effetti mitocondriali dovuti alla sovraespressione della proteina chinasi C epsilon attiva nelle cellule progenitrici renali si correlano anche con la morte cellulare tramite necrosi e apoptosi.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sovraesprimere proteine in colture primarie utilizzando la tecnica adenovirale e di come valutare la capacità mitocondriale per la sintesi di TP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. E infine, non dimenticare che lavorare con adenovirus richiede precauzioni adeguate, quindi adotta misure di sicurezza appropriate.