La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Questo esperimento utilizza la modulazione selettiva della proteina chinasi C ISO xms per determinare le loro funzioni mitocondriali e cellulari nelle cellule tubulari prossimali renali in varie condizioni fisiologiche e patologiche. In primo luogo, isolare le cellule tubulari prossimali renali primarie dalla corteccia renale o RPC che hanno metabolismo ossidativo. Simile a quello dei tubuli prossimali renali.

Vivo infetta gli RPC con vettori adenovirali che esprimono forme attive e inattive di isys di proteine. La chinasi C analizza quindi le diverse funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare per determinare l'effetto dello zima sulla capacità mitocondriale di sintetizzare A TP e prevenire la morte cellulare. Eseguire anche l'analisi immuno blot della fosforilata e della proteina chinasi C epsilon nei lisati cellulari presi insieme.

I risultati mostrano che l'attivazione della proteina chinasi epsilon regola negativamente la capacità mitocondriale di generare un TP, diminuisce i livelli cellulari di un TP e la vitalità delle cellule tubulari prossimali renali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle nostre tecniche esistenti, come le linee cellulari, è che le colture primarie di cellule tubulari prossimali renali mantengono le funzioni differenziate e ossidate di cellule prossimali renali. Poiché le protein chinasi possono essere utilizzate come bersagli e potenziali agenti terapeutici, le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia, prevenendo il danno renale o accelerando il recupero renale dopo un infortunio.

Questo metodo può comprendere il meccanismo, l'infortunio e il recupero. Può anche essere applicato ad esempio al rene di coniglio appena isolato in sequenza con 50 millilitri. Ciascuno di soluzione salina tamponata con fosfato sterile sterile D-M-E-M-F 12, pH 7,4 e PBS per raccogliere la corteccia di ciascun rene.

Per prima cosa omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore in piuma da 15 millilitri. Quindi passare l'omogeneizzato attraverso due setacci a rete sterili in un becher sterile da un litro. Sciacquare le cellule rimaste sui setacci con tampone contenente deferoxamina.

Trasferire il tessuto rimasto sul fondo. Setaccio da 85 micron a 40 millilitri di tampone contenente deferoxamina posto in una provetta da centrifuga conica. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con il potente magnete.

Cattura i glomeruli pieni di ferro e aspira il ferro attaccato al magnete. Regolare il volume della sospensione cellulare a 40 millilitri e aggiungere un millilitro di terreno di digestione contenente collagenasi. Incubare a temperatura ambiente per 17 minuti.

Mescolando delicatamente la sospensione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 50 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius dopo diversi lavaggi. Resus sospendere il pellet cellulare in 46 millilitri di terreno non contenente semi di glucosio.

I PC RT primari a una densità di un milligrammo di proteine per piatto vengono coltivati in due millilitri di terreno D-M-E-M-F 12 privo di glucosio su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver riempito il terreno, procedere all'infezione delle cellule RPT confluenti con adenovirus che trasporta CD NA per la proteina chinasi costitutivamente attiva, C epsilon o la proteina chinasi negativa dominante C epsilon incubare per 24 ore, ricostituire il terreno e coltivare gli RPC primari trasfettati per altre 24 ore. Per visualizzare la morfologia mitocondriale del monostrato di cellule primarie, rifornire il terreno, aggiungere MIT tracker red five 80 e rimettere le piastre nell'incubatore per 30 minuti.

Quindi esaminare i monostrati vivi al microscopio a fluorescenza utilizzando un'immersione in acqua. Obiettivo due. Per valutare la funzione mitocondriale, valutare la respirazione allo stato tre della sospensione RPTC in una camera di consumo di ossigeno dotata di un elettrodo di tipo Clark.

Prima misura stato due respirazione in assenza di un DP. Quindi aggiungere un DP a una concentrazione finale di 0,4 millimolari. Per iniziare la respirazione di stato tre per la respirazione di stato quattro. Aggiungere oligomicina a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.

Includere anche una misurazione per la respirazione disaccoppiata aggiungendo 0,5 micromolari di FCCP alle cellule che respirano allo stato tre. Aggiungere lentamente 20 microlitri di JC 0,5 millimolare una soluzione a ciascuna piastra di coltura RPTC e agitare per mescolare accuratamente il colorante. Rimetti i piatti nell'incubatrice per 30 minuti.

Quindi, posiziona le colture sul ghiaccio ed esegui due lavaggi PBS ghiacciati. Quindi raccogli le cellule. Trasferire le cellule RPT in una provetta einor e rompere i monostrati in una sospensione di singole cellule mediante pipettaggio.

Analizza la fluorescenza mediante citometria a flusso utilizzando l'eccitazione di un laser a ioni argon a 488 nanometri. Quindi calcolare i mitocondri isolati del potenziale di membrana mitocondriale. Facilitare la valutazione dell'integrità della catena respiratoria.

Dopo due lavaggi dei monostrati RPTC con tampone PBS ghiacciato, raccogliere le celle e il pellet mediante centrifugazione. Lavare il pellet una volta in un millilitro di tampone A, quindi omogeneizzare le cellule in un omogeneizzatore di piumino fino a quando la maggior parte delle cellule dell'omogenato non si rompe quando viene ispezionata al microscopio. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità.

Pellettare i mitocondri grezzi dal surnatante a 15.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eseguire tre lavaggi dei mitocondri pellettati nel tampone c, risospendere il pellet mitocondriale in 50-100 microlitri del tampone di saggio e congelare in azoto liquido per dosare l'attività della NADH ubichinone ossidato reduttasi. Aggiungete 500 microlitri di tampone di analisi con le aggiunte e i mitocondri includeranno anche un campione bianco che contiene tutte le aggiunte ma nessun mitocondrio. Equilibrare la piastra a 30 gradi Celsius mescolando per cinque minuti.

Quindi, posizionare la piastra nella specifica e aggiungere 10 microlitri di ubichinone da 3,25 millimolari per avviare la reazione in ciascuna. Registrare bene l'assorbanza a 340 nanometri per tre minuti a intervalli di 22. In un test simile, misurare l'attività della citocromo C ossidasi utilizzando il citocromo C ridotto come substrato per la reazione A TP sintasi.

Preparare miscele per il dosaggio dell'attività totale degli APA e dell'attività degli APA insensibili all'oligomicina di ciascun gruppo di trattamento. Incubare i campioni in una miscela di reazione a 31 gradi Celsius per 10 minuti. Iniziare la reazione aggiungendo un substrato TP e incubare a 31 gradi Celsius per cinque minuti.

Trasferire 200 microlitri della miscela di incubazione in una provetta contenente 50 microlitri di TCA a tre molari, precipitare le proteine sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi pellettare per centrifugazione. Successivamente, caricare una piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di ogni standard di fosfato e 50 microlitri di ogni campione surnatante in duplicato.

Quindi aggiungere 250 microlitri di reagente Sumner a ciascun pozzetto, incubare a 30 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi registrare l'assorbanza a 595 nanometri. Lavare due volte i monostrati RPTC con un tampone PBS ghiacciato.

Raccogliere le cellule in un millilitro di PBS e trasferire la sospensione cellulare in una provetta einor. Pellettare i campioni RPTC mediante centrifugazione e determinare un contenuto di TP utilizzando il metodo della luciferasi di un kit di saggio di bioluminescenza A TP. Per l'analisi della vitalità cellulare in piastre da 35 millimetri, utilizzare cinque monostrati RPTC per tre gruppi di trattamento di controllo di cellule positive per le cellule dell'osi positive per l'apoptosi e un controllo senza colorazione per due piatti.

Aggiungere due microlitri di cisplatino da 50 millimolari al secondo set. Aggiungere due microlitri di 500 millimolari di idroperossido di butile di torta. Dopo aver colorato le cellule con ioduro di propidio come descritto nel testo allegato, lavare i monostrati con il tampone legante.

Quindi, colorare le cellule utilizzando l'ANNESSINA cinque coniugata con ZI come descritto nel protocollo di testo. Quindi raccogliere delicatamente le cellule e sospenderle in 500 microlitri di tampone legante. Usando un poliziotto di gomma.

Utilizzare una pipetta per disperdere le cellule in una singola sospensione cellulare e trasferire la sospensione cellulare in provette per citometria a flusso. Disperdere le cellule in una singola sospensione cellulare. Procedere immediatamente alla quantificazione della fluorescenza per PI e FE mediante citometria a flusso, la somministrazione adenovirale del rivestimento di CD NA, i mutanti costituentemente attivi e inattivi della proteina chinasi C, l'epsilon provoca un aumento significativo dei livelli proteici della proteina chinasi C epsilon nell'RPTC e nei mitocondri.

Come previsto, la forma costitutivamente attiva dell'enzima è fosforilata in RP tcs e l'enzima dominante negativo non è fosforilato. La presenza della proteina chinasi C epsilon attiva riduce la respirazione mitocondriale nell'RPTC indipendentemente dal substrato utilizzato per energizzare i mitocondri. Ma la proteina chinasi inattiva C epsilon non ha alcun effetto sulla respirazione mitocondriale.

È interessante notare che l'attivazione della proteina chinasi C epsilon in RP TCS riduce l'attività dei complessi uno su quattro. Questa diminuzione della respirazione RPTC è associata ad un aumento del potenziale di membrana mitocondriale. Il mutante dominante negativo non ha tale effetto.

Questi cambiamenti sono anche accompagnati da diminuzioni dell'attività di una TP sintasi nei mitocondri isolati da RPTC che esprimono la proteina chinasi attiva C epsilon. Di conseguenza, il contenuto di A TP di RPTC che sovraesprime la proteina chinasi attiva C epsilon è una diminuzione dell'attivazione sostenuta della proteina chinasi. Il C epsilon ha effetti profondi sulla morfologia mitocondriale, come evidenziato dalla frammentazione mitocondriale.

Attivazione della proteina chinasi C, ma non inibizione. Provoca anche cambiamenti nella morfologia dell'RPTC causando il restringimento cellulare e l'allungamento delle cellule sopravvissute. Questi effetti mitocondriali della sovraespressione della proteina chinasi attiva C epsilon nelle RPC sono anche correlati con la morte cellulare sia per ON che per apoptosi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sovraesprimere le proteine in colture primarie utilizzando la tecnica adenovirale e come valutare la capacità mitocondriale per una sintesi di TP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. E carentemente, Non dimenticare che lavorando con l'accesso adenovirus thet, quindi prendere precauzioni come appropriato.