Name: La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Scopri come valutare le funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali tubulari prossimali mediante modulazione selettiva degli isoenzimi della protein chinasi C.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali, 2R01DK59558 (a GN). MSNA Translational Research Institute sostenuto dal National Institutes of Health Centro Nazionale per la Ricerca Risorse concessione UL1 RR029884 fornito un finanziamento parziale per Core Citometria a Flusso di MSNA. Ringraziamo il Dott. Peipei Ping (Università di California a Los Angeles, Los Angeles, CA) per fornire un &#39;aliquota di adenovirus portare cDNA codificante il dominante negativo (inattivo) mutante della PKC-ε e il dottor Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) per fornire una aliquota di vettore adenovirale codificante mutante costitutivamente attivo di PKC-ε. Ringraziamo anche Drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, Londra, Regno Unito) per la fornitura di cDNA codificante costitutivamente attivi PKC-ε.

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l&#39;obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all&#39;interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cappa a flusso laminare </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml e 15 ml smerigliatrice Dounce tessuto </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357.544 </td></tr><tr><td> 85 e 235 micron maglia di nylon </td><td> Piccole parti </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml provetta sterile </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml micro tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm piastre di coltura sterili </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrifuga </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotori: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Regolabile micro-centrifuga </td><td> SIGMA </td><td> Modello 1-15 </td></tr><tr><td> Monitor di ossigeno biologica </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI modello 5300A </td></tr><tr><td> Singolo Ossigeno Sistema Camerale Micro </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sonda di ossigeno </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Bagno di circolazione </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl e Kit membrana standard </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitatore magnetico </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Registratore Flatbed </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48 pozzetti e piastre da 96 pozzetti trasparenti </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Agitatore orbitale MaxQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (assorbanza / fluorescenza / luminescenza lettore) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Camicia d&#39;acqua degli Stati Uniti Autoflow automatica di CO 2 incubatore </td><td> Nuaire </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm in polistirolo Provette di coltura per citometria a flusso </td><td> Fisher Marca </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Obiettivo a immersione in acqua 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 Achroplan 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamina Mesylate </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenasi Tipo I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ioduro (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP bioluminescenza Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annessina V - FITC soluzione </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

la valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi c overexpressing isoenzimi

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l&#39;attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati ​​o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l&#39;attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta. Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l&#39;integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F 0 F 1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l&#39;attività di F 0 F 1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis. Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.

La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine ​​significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1). La ...

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L&#39;approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

La famiglia di isoenzimi della protein chinasi C (PKC) è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC...

Questo esperimento utilizza la modulazione selettiva dell'isoforma della proteina chinasi C xms per determinarne le funzioni mitocondriali e cellulari nelle cellule tubulari prossimali renali in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. In primo luogo, isolare le cellule tubulari prossimali renali primarie dal cortice renale o RPC che presentano metabolismo ossidativo, simile a quello dei tubuli prossimali renali.Infetta in vivo le RPC con vettori adenovirali che esprimono forme attive e inattive dell'isozima della proteina chinasi C. Quindi saggia le diverse funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare per determinare l'effetto dell'isozima sulla capacità mitocondriale di sintetizzare ATP e prevenire la morte cellulare. Esegui anche l'analisi mediante immunoblot delle forme fosforilate e della proteina chinasi C epsilon nei lisati cellulari prelevati complessivamente.I risultati mostrano che l'attivazione della proteina chinasi epsilon regola negativamente la capacità mitocondriale di generare ATP, riduce i livelli cellulari di ATP e la vitalità delle cellule tubulari prossimali renali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come le line

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Questo video dimostra la valutazione del funzionamento mitocondriale delle cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) utilizzando un test di flusso extracellulare. Le cellule CVE sono piastrate in una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare. I sensori di flusso extracellulare vengono idratati prima di essere caricati e calibrati nel bioanalizzatore. La piastra contenente le celle viene quindi caricata per l'analisi.

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Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

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mitocondri delle cellule endoteliali sono fondamentali per mantenere l'integrità del sangue-cervello barriera. Introduciamo un protocollo per misurare la funzione bioenergetico nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.

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Questo metodo sfrutta il contributo del poro di transizione della permeabilità mitocondriale alla perdita di protoni a bassa conduttanza per determinare la soglia di tensione per l'apertura dei pori nei topi neonatali con sindrome dell'X fragile con aumento del contenuto di coenzima Q mitocondriale dei cardiomiociti rispetto al controllo wildtype.

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Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

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Questo articolo descrive l'uso della microscopia confocale e di ImageJ per valutare la dinamica di fissione/fusione mitocondriale tramite la fluorescenza a fotocommutazione Dendra2.

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Scopri come valutare le funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali tubulari prossimali mediante modulazione selettiva degli isoenzimi della protein chinasi C.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi (Video) | JoVE Journal

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