Un semplice protocollo per Clumping piastrinica mediata da Plasmodium falciparum infette in una risorsa Povero Setting

Questa procedura offre alcune linee guida standardizzate per eseguire saggi di aggregazione mediata da piastrine di isolati di falsi parem di plasmodio clinici o di laboratorio. In primo luogo, raccogliere il sangue da un paziente infetto e prelevare eritrociti parassitati mediante centrifugazione, quindi coltivare e purificare gli stadi maturi asessuati. Successivamente, raccogliere il sangue da un donatore sano per preparare e standardizzare il plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione.

Combinare sia le piastrine che gli eritrociti parassitizzati per il test di aggregazione. Diciamo che i risultati della microscopia a immunofluorescenza possono mostrare grumi di P Fal sperum mediati dalle piastrine. Questa tecnica è specificamente progettata per misurare il fenotipo agglomerante di plasmodium sra.Isolati

clinici in un contesto povero di risorse. Secondo quanto riferito, variazioni minime nelle procedure hanno aumentato l'influenza sull'esito dell'agglomerazione dell'acido sul campo. Era quindi necessario un protocollo chiaro e facile da seguire, adattato a contesti con scarse risorse per standardizzare i siti sul campo endemici della malaria. In un citrato di sodio, il vacutainer raccoglie circa cinque millilitri di sangue intero da un ospite naïve alla malaria o 2,5 millilitri di sangue da pazienti affetti da malaria CM o SM.

Centrifugare il sangue intero a 250 Gs per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire con cura il surnatante torbido in un tubo pulito da 15 millilitri. Ricorda che le piastrine sono facilmente attivate dalla temperatura, dalle variazioni e dagli shock fisici.

Enumerare la sospensione di PRP utilizzando l'emocitometro di fastidio bower e regolare la concentrazione desiderata con PBS per ottenere un pellet di plasma povero di piastrine, la maggior parte delle piastrine da una porzione della frazione PRP mediante centrifugazione a 1500 GS per 10 minuti. Conservare le frazioni di PRP e PPP a quattro gradi Celsius per un massimo di 8-10 giorni. Idealmente utilizzando piastrine fresche per il test di agglomerazione.

Lavare i globuli rossi periferici pellettati tre volte con 5-10 millilitri di RPMI 1640 in un pallone di coltura Integrare PRBC con coltura standard della malaria, globuli rossi medi e freschi non infetti per ottenere un ematocrito del 5%. Permeare i palloni di coltura con una miscela di azoto al 92,5%, ossigeno al 2,5% e anidride carbonica al 5%. Quindi sigillatura e coltura per i parassiti maturi dai pbc dei pazienti.

Incubare il pallone di coltura per 24-36 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Mettere circa 10-15 microlitri di sangue su un'estremità di un vetrino di vetro smerigliato appoggiato su una superficie piana. Toccare la goccia di sangue con il bordo di un secondo vetrino fino a quando il sangue non si diffonde uniformemente sul bordo del secondo vetrino tenendo il secondo vetrino a un angolo di 45 gradi.

Rapidamente, ma delicatamente, senza esercitare troppa pressione sul primo vetrino, distribuire uniformemente il sangue sul primo vetrino. Quindi asciugare all'aria il sottile film di sangue, disidratare l'area del campione con metanolo per 10 secondi. Quindi asciugare all'aria, immergere il campione con il 2% di keem.

Sostenere per almeno 10 minuti. Risciacquare abbondantemente fino a quando l'acqua non diventa limpida e si asciuga all'aria. Esaminare i campioni sotto una lente di emulsione d'olio 100 x al microscopio ottico.

Successivamente, purificare e sincronizzare il parum PFS maturo, PRBC come descritto nel protocollo di testo. Tutti trasferiscono la coltura in una provetta pulita e sterile da 15 millilitri. Pellettare le celle mediante centrifugazione a temperatura ambiente a 370 GS per cinque minuti.

Ora aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi risospendere le cellule in modo tale che metà del volume totale sia gelatina che si fonde. Un terzo della seconda metà è costituito da terreno privo di proteine e due terzi della seconda metà è costituito da pbcs.

Trasferire la sospensione in una provetta sterile da 15 millilitri e incubare per 15-20 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino a quando non si forma una chiara demarcazione tra i livelli superiore e inferiore. Trasferire con cura lo strato superiore in una provetta sterile da 15 millilitri e aggiungere 10 millilitri di centrifuga RPMI fresca a 370-430 GS per cinque minuti. Quindi scartare con cura il surnatante.

Ora valuta il parsit e lo stadio di sviluppo mediante striscio di sangue sottile ed esamina al microscopio ottico come descritto in precedenza. Regolare la sospensione di P RBC ottenuta dopo la flottazione del gel plasmatico a una volta da 10 all'ottavo P RBC per microlitro in un tubo nuovo da 1,5 millilitri. Sospendiamo pbcs al 5% di ematocrito aine arancio o bromuro di aterio a 20 microgrammi per millilitro, concentrazione finale e PRP al 10% del volume totale.

Allo stesso modo, preparare i seguenti controlli globuli rossi non infetti e PRP e PRBC con PPP per accertare il ruolo delle piastrine nell'aggregazione del PBC. Ora trasferisci la sospensione in una fiala con tappo a vite da due millilitri. Posizionare la fiala sotto leggera agitazione arrotolando a 10-12 RRP a temperatura ambiente campionamento a intervalli di 15-20 minuti per un totale di 120 minuti per verificare la formazione di grumi.

Pipettare 10 microlitri del campione su un vetrino e coprire con un vetrino per esaminare sotto fluorescenza, Un grumo è considerato come un aggregato di tre o più eritrociti infetti. Questo esperimento ha analizzato circa il 70% degli stadi maturi di p FALs parem dopo l'arricchimento mediante flottazione su gel plasmatico, i grumi sono facilmente individuabili al microscopio come in condizioni di luce normale. Appaiono come aggregati cellulari e sotto fluorescenza come macchie verdi o rosse.

Quando viene colorato rispettivamente con acro e arancia o aterio, muore il bromuro. La dimensione del grumo aumenta significativamente fino a una media di oltre 15 pbc per grumo dopo l'incubazione per 120 minuti, con alcuni grumi contenenti numerosi pbc per grumo che non possono essere contati visivamente. La frequenza del fenotipo aggregante è calcolata come il numero di cellule infette presenti in grumi per 1000 cellule infette contate in saggi duplicati.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una chiara comprensione di come eseguire un test di aggregazione mediata da piastrine con plasmodium falciparum. Fare attenzione a non attivare le piastrine con movimenti a scatti e variazioni di temperatura. Questo test può essere applicato anche per misurare il test di aggregazione mediata dalle piastrine nella malaria grave.