Un semplice protocollo per Clumping piastrinica mediata da Plasmodium falciparum infette in una risorsa Povero Setting

Questa procedura fornisce alcune linee guida standardizzate per eseguire saggi di aggregazione mediati da piastrine su isolati clinici o di laboratorio di Plasmodium falsa parem. In primo luogo, prelevare il sangue da un paziente infetto ed ottenere gli eritrociti parassitizzati mediante centrifugazione, quindi coltivare e purificare le forme asessuali mature. Successivamente, raccogliere il sangue da un donatore sano al fine di preparare e standardizzare il plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione.

Combinare le piastrine e gli eritrociti parassitati per il saggio di aggregazione. I risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza immunoistochimica possono mostrare aggregati di P. falciparum mediati dalle piastrine. Questa tecnica è stata specificamente progettata per misurare il fenotipo di aggregazione di Plasmodium falciparum.

Isolati clinici in un contesto con scarse risorse. Sono stati segnalati minimi cambiamenti nelle procedure in grado di aumentare l'influenza sull'esito del test dell'acido agglutinante sul campo. È risultata pertanto necessaria una procedura chiara e di facile esecuzione, adattata a contesti con scarse risorse, per standardizzare le metodiche tra diversi siti di studio in aree endemiche per malaria. In un vuotovena contenente citrato di sodio, raccogliere circa cinque millilitri di sangue intero da un soggetto naïve per la malaria oppure 2,5 millilitri di sangue da pazienti affetti da malaria CM o SM.

Centrifugare il sangue intero a 250 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire con attenzione il sopranatante torbido in un tubo pulito da 15 millilitri. Ricordare che le piastrine si attivano facilmente a causa di variazioni di temperatura e di shock fisici.

Enumerare la sospensione di PRP utilizzando una camera di Bürker, un emocitometro, e regolare la concentrazione desiderata con PBS per ottenere un pellet di plasma povero di piastrine; rimuovere la maggior parte delle piastrine da una porzione della frazione di PRP mediante centrifugazione a 1500 ×g per 10 minuti. Conservare le frazioni di PRP e PPP a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di otto-dieci giorni. Idealmente, utilizzare piastrine fresche per il saggio di aggregazione.

Lavare le cellule rosse periferiche pellettizzate tre volte con cinque-dieci millilitri di RPMI 1640 in un matraccio da coltura. Introdurre nelle GRBP il comune mezzo di coltura per la malaria e cellule rosse fresche non infette per ottenere un ematocrito del 5%. Saturare i matracci di coltura con una miscela di 92,5% azoto, 2,5% ossigeno e 5% anidride carbonica. Quindi sigillare e coltivare per ottenere parassiti maturi dai PBMC del paziente.

Incubare il flacone colturale per 24-36 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Posizionare circa 10-15 microlitri di sangue su un'estremità di un vetrino in vetro smerigliato appoggiato su una superficie piana. Toccare la goccia di sangue con il bordo di un secondo vetrino fino a quando il sangue si distribuisce uniformemente lungo il bordo del secondo vetrino, tenendo quest'ultimo a un angolo di 45 gradi.

Diffondere rapidamente ma delicatamente, senza esercitare troppa pressione, il sangue uniformemente sul primo vetrino. Quindi lasciare asciugare all'aria il film sottile di sangue, disidratare l'area del campione con metanolo per 10 secondi. Successivamente, lasciare nuovamente asciugare all'aria, quindi immergere il campione in 2%keem.

Mantenere per almeno 10 minuti. Risciacquare abbondantemente fino a quando l'acqua non diventa limpida ed essiccare all'aria. Esaminare i campioni al microscopio ottico con obiettivo ad immersione ad 100 x.

Successivamente, purificare e sincronizzare i parassiti maturi di P. falciparum, PRBC, come descritto nel protocollo testuale. Trasferire tutta la coltura in un tubo sterile da 15 millilitri. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a temperatura ambiente a 370 ×g per cinque minuti.

Ora aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet. Quindi risospendere le cellule in modo che una metà del volume totale sia jello fusing, un terzo della seconda metà sia mezzo privo di proteine e i due terzi della seconda metà siano pbcs.

Trasferire la sospensione in un tubo sterile da 15 millilitri e incubare per 15-20 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius fino a quando si forma una netta delimitazione tra il livello superiore e quello inferiore. Trasferire con attenzione il livello superiore in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri e aggiungere 10 millilitri di RPMI fresco; centrifugare a 370-430 GS per cinque minuti. Successivamente, eliminare con cura il sopranatante.

Ora valutare il parassitemia e lo stadio di sviluppo mediante striscio sottile di sangue ed esaminare al microscopio ottico come descritto in precedenza. Regolare la sospensione di globuli rossi parassitati ottenuta dopo la galleggiatura su gel di plasma a un valore di 1 × 10⁸ globuli rossi parassitati per microlitro in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Sospendiamo i globuli rossi parassitati a un ematocrito del 5% in aine orange o bromuro di aterio a una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro e il PRP al 10% del volume totale.

Allo stesso modo, preparare i seguenti controlli: globuli rossi non infettati, PRP e PRBC con PPP, per accertare il ruolo delle piastrine nell'aggregazione dei PBC. Trasferire ora la sospensione in un vial da due millilitri con tappo a vite. Posizionare il vial sotto lieve agitazione mediante rotazione a 10-12 giri al minuto a temperatura ambiente, prelevando campioni a intervalli di 15-20 minuti per un totale di 120 minuti per verificare la formazione di aggregati.

Prelevare con pipetta 10 microlitri del campione su un vetrino e coprire con un coprioggetto di vetro per l'esame in fluorescenza. Un ammasso è definito come un aggregato di tre o più eritrociti infetti. Questo esperimento ha analizzato circa il 70% di stadi maturi di p FALs parem dopo l'arricchimento mediante galleggiamento su gel di plasma. Gli ammassi sono facilmente individuabili al microscopio anche in luce normale. Appaiono come aggregati cellulari in luce normale e come punti verdi o rossi in fluorescenza.

Quando colorati rispettivamente con acro e arancio o con bromuro di atherium, le dimensioni degli aggregati aumentano significativamente fino a una media superiore a 15 PBL per aggregato dopo un'incubazione di 120 minuti, con alcuni aggregati che contengono numerosi PBL per aggregato non conteggiabili visivamente. La frequenza del fenotipo di aggregazione viene calcolata come numero di cellule infette presenti negli aggregati ogni 1000 cellule infette contate in saggi duplicati.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una chiara comprensione di come eseguire un saggio di aggregazione mediata da piastrine di plasmodium falciparum. Presta attenzione a non attivare le piastrine con movimenti bruschi o variazioni di temperatura. Questo saggio può essere applicato anche per misurare l'aggregazione mediata da piastrine nella malaria grave.