L'uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in C. elegans Embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere una tecnica in vivo per l'analisi delle dinamiche subcellulari in embrioni di sea elegance esposti all'anossia, utilizzando un sistema a flusso gassoso su un microscopio ad alta potenza. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un campione di animali transgenici giovani adulti, al fine di ottenere una popolazione adeguata di embrioni giovani da sottoporre a imaging. Successivamente, preparare vetrini con pad di agarosio sottile da utilizzare nella camera di micro-incubazione.

Successivamente, i ricci di mare vengono adeguatamente anestetizzati e ricoperti con olio di alogenuro carbonico per evitare la disidrataziona quando esposti al flusso di gas. Infine, il vetrino circolare con gli animali anestetizzati viene posizionato all'interno della camera di microincubazione. La camera viene quindi posta sul tavolo del microscopio e riempita con gas azoto per creare un ambiente anossico durante l'acquisizione delle immagini, sfruttando infine un flusso di gas attraverso la camera di microincubazione.

In combinazione con la microscopia a fluorescenza in vivo, permette di ottenere video e immagini dettagliate ad alta risoluzione dell'arresto del ciclo cellulare in risposta all'anossia. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza indiretta, è che i cambiamenti subcellulari possono essere documentati in vivo mentre gli animali sono esposti a condizioni specifiche. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'animazione sospesa indotta dall'anossia negli embrioni di elegans.

Il metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come lieviti, colture cellulari o embrioni di altri piccoli invertebrati o vertebrati. È inoltre possibile applicare condizioni aggiuntive, come iperossia, temperatura, stress o trattamento con molecole di piccole dimensioni. A dimostrazione di questa procedura, Anastacia Garcia e Mary Latt, due studentesse laureate del mio laboratorio, iniziano utilizzando una linea transgenica di C. elegans appropriata per lo studio; in questo caso, verrà impiegata la linea transgenica TH32 per visualizzare cromosomi e centrosomi come marcatori della divisione cellulare.

Generare una popolazione sincronizzata disintegrando adulti gravidi in soluzione di ipoclorito ed utilizzando gli embrioni rimanenti, trasferendo gli adulti gravidi su una piastra seminata e facendo deporre le uova per uno o due ore, oppure trasferendo larve L4 da una popolazione mista su una nuova piastra seminata. Coltivare i nematodi a 20 gradi Celsius fino al giovane adulto GR, il che richiederà circa 96 ore dalla schiusa, 72 ore dalle larve L1 o 24 ore dopo la muta da L4. Questa metodologia fornisce un mezzo per generare una popolazione di giovani adulti che contengono un elevato numero di embrioni giovani, i quali presentano blastomeri e nuclei di grandi dimensioni ottimali per l'analisi mediante imaging di cambiamenti subcellulari e subnucleari.

Per preparare una camera umida per contenere i vetrini preparati, posizionare un tovagliolo di carta inumidito all'interno di una grande capsula di Petri o contenitore dotato di coperchio di dimensioni adeguate. Preparare l'agarosio al 2% fuso in acqua deionizzata riscaldando la miscela in un recipiente di vetro mediante microonde o bagno a ultrasuoni. Successivamente, posizionare da una a tre gocce di agarosio caldo su un vetrino microscopico pulito, quindi appoggiare immediatamente un secondo vetrino capovolto perpendicolarmente sopra le gocce di agarosio e premere leggermente in modo che la matrice risultante sia sottile e priva di bolle d'aria.

Dopo che l'aro si è raffreddato, separare lentamente i due vetrini, lasciando il cuscinetto di aro intatto su uno di essi. È importante assicurarsi che il cuscinetto di aro sia abbastanza sottile da non interferire con la capacità di mettere a fuoco il microscopio. Successivamente, utilizzare una lametta pulita per modellare il cuscinetto di aro in un piccolo quadrato.

Conservare le vetrini nella camera umida preparata fino al momento dell'uso. Utilizzando la stessa lametta pulita, prelevare con attenzione il bordo del tampone aros e trasferirlo dal vetrino a un coprioggetto micro circolare da 25 millimetri. Evitare l'accumulo di bolle d'aria sotto il coprioggetto circolare, che deve adattarsi correttamente nel micro incubatore.

Aggiungere una goccia di anestetico sul tampone aros. Prelevare da cinque a dieci vermi e posizionarli nella goccia di anestetico. Attendere da uno a tre minuti affinché i vermi cessino il movimento.

Utilizzando la punta di una pipetta, aggiungere una goccia di olio di carbonio leggero sulla parte superiore dei vermi per evitare che si disidratino quando il gas viene fatto passare attraverso la camera. Successivamente, collegare un'estremità del tubo di plastica flessibile alla camera. Separare le due metà dell'incubatore microperfusionato chiuso e posizionare con attenzione il vetrino in posizione verticale sull'anello inferiore.

Chiudere saldamente i due lati della camera. Quindi collegare la camera, tramite il tubo flessibile in plastica, alla bombola di gas azoto e posizionarla sul palchetto del microscopio. Verificare la presenza di eventuali perdite assicurandosi che il tubo e i tappi dei connettori lungo il lato della camera siano ben fissati per l'acquisizione delle immagini degli embrioni.

Per prima cosa, localizzare gli animali a basso ingrandimento. Successivamente passare all'ingrandimento superiore appropriato. Per acquisire immagini di blasfemi embrionali negli adulti, utilizzare il laser a 488 nanometri per localizzare la proteina di fusione GFP nelle cellule di interesse.

Per visualizzare una specifica fase dell'arresto del ciclo cellulare, ad esempio la profase tardiva, identificare un blasfemo in una fase precedente della divisione cellulare, come l'interfase tardiva o la profase iniziale. Perfundere la camera con gas azoto e continuare a monitorare i blasfemi mentre l'azoto riempie la camera, regolando il piano focale secondo necessità. Effettuare un'acquisizione con microscopia a intervalli per catturare il fenomeno di interesse desiderato in questo caso.

Arresto in profase e ancoraggio dei cromosomi alla membrana nucleare interna. Acquisire immagini ogni 10 secondi per un massimo di 30 minuti. Tipicamente, l'arresto in profase indotto da anossia si verifica entro 20-30 minuti dall'inizio del flusso di gas azoto.

Per documentare il recupero dallo stato di arresto indotto dall'anossia, spegnere il gas e permettere alla camera di tornare alla normossia, registrando nel contempo una serie a intervalli di tempo. La ripresa del ciclo cellulare e la risoluzione dei cromosomi si verificano tipicamente entro cinque-venti minuti. Utilizzare ImageJ o Photoshop per elaborare immagini e video e importarli in QuickTime per la visualizzazione.

All'interno dell'embrione esposto all'anossia, i cromosomi in profase si condenseranno e si allineeranno con la periferia interna della membrana nucleare. Un fenomeno noto come ancoraggio dei cromosomi; al ripristino dell'ossigeno, la progressione del ciclo cellulare riprenderà e i cromosomi in profase si disporranno nuovamente.

Blasphemy passerà dalla periferia nucleare alla piastra equatoriale, indicando il passaggio alla metafase. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore utilizzando animali opportunamente stadiati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare esclusivamente animali adulti giovani e sani, di dedicare tempo sufficiente per completare l'esperimento e di essere pazienti nell'apprendere a selezionare correttamente gli stadi di blasphemers.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catturare eventi subcellulari indotti da anossia in vivo utilizzando embrioni GaN e una camera con flusso di gas su un microscopio ad alta potenza.