Un In Vitro per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in Aplysia californica

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività elettrica proveniente dai nervi, dai muscoli e dai neuroni, nonché i movimenti corrispondenti dell'apparato boccale durante i programmi motori alimentari. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo la massa buccale da un animale anestetizzato e posizionando elettrodi ad ago su nervi e muscoli chiave. Il secondo passaggio consiste nel posizionare la massa buccale in una camera di registrazione e preparare i gangli per la registrazione extracellulare.

Successivamente, i neuroni bersaglio vengono localizzati utilizzando elettrodi extracellulari. L'ultimo passaggio consiste nell'indurre e registrare programmi motori legati all'alimentazione, come il morso, la deglutizione e il rigetto. Infine, il preparato del massiccio buccale sospeso viene utilizzato per mostrare l'attività di nervi, muscoli e singoli neuroni durante diversi movimenti simili all'alimentazione del massiccio buccale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli studi su gangli isolati, è che le registrazioni provenienti dai nervi, dai muscoli e dai singoli neuroni possono essere direttamente correlate ai movimenti dell'apparato alimentare. Ad assistere nella dimostrazione della procedura sarà huu, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare la procedura, anestetizzare un plegia sano del peso di 200-300 grammi in un vassoio da dissezione, iniettando circa il 50% del peso corporeo di cloruro di magnesio isotonico. Dopo la prima iniezione vicino alla coda dell'animale, massaggiare delicatamente la superficie dell'animale per favorire la diffusione del cloruro di magnesio.

Somministrare ulteriori iniezioni vicino alla testa dell'animale secondo necessità. Dopo che l'animale smette di rispondere a stimoli tattili leggeri, fissarlo al vassoio con il dorso rivolto verso l'alto. Inserire un perno nella coda e un perno in ciascun tentacolo anteriore.

Quindi utilizzare la pinzetta per pizzicare e sollevare la pelle dell'animale al centro della testa. Dietro le zampe anteriori, effettuare un'incisione coronale attraverso la testa dell'animale appena dietro il punto trattenuto. Successivamente, praticare un'incisione sagittale mediana tra le zampe anteriori in direzione della bocca per esporre la massa buccale.

Successivamente, staccare la falda di pelle dalla massa buccale e recidere i nervi e i tessuti connettivi che si attaccano alla parete del corpo. Per separare completamente questa falda di pelle dalla massa buccale, accertarsi di non recidere alcun nervo o tessuto intrinseco alla massa buccale. In seguito, afferrare e tenere l'esofago.

Tagliare l'esofago posteriormente al punto trattenuto. Sollevare l'esofago ed estrarre il massiccio buccale posizionato dietro al massiccio buccale. I gangli cerebrale, pleurale e pedale formano un anello, con il ganglio cerebrale collegato ai gangli buccali tramite i connettivi cerebrali-buccali.

Lasciare questi gangli anulari attaccati alla massa buccale e recidere tutti i nervi che si estendono da questi gangli verso altre parti del corpo. Quindi tagliare il tessuto connettivo intorno alla massa buccale e continuare a sollevare la massa buccale man mano che si stacca dal corpo. Una volta che la massa buccale è attaccata soltanto alla bocca, tenere l'esofago e la massa buccale.

Dritto verso l'alto. Eseguire un taglio finale appena anteriore alle mascelle per liberare la massa buccale dal corpo. Posizionare la massa buccale in una soluzione al 50% di cloruro di magnesio isotonico e al 50% di soluzione salina SIA per mantenere un'anestesia parziale mentre vengono applicati gli elettrodi.

Successivamente, posizionare la massa buccale con la soluzione in una capsula di Petri con il fondo a forma di sigaro, praticando un'incisione attraverso l'arteria buccale sulla superficie ventrale della massa buccale. Quindi rimuovere i gangli pleurici e pedali recidendo le loro connessioni con il ganglio cerebrale. Lasciare il ganglio cerebrale attaccato ai gangli buccali e alla massa buccale tramite i CBC e recidere le altre connessioni tra il ganglio cerebrale e la massa buccale.

Tagliare l'esofago e le ghiandole salivari in brevi tratti. In questo passaggio, collegare gli elettrodi ad ago al nervo oculare ular, ai due nervi muscolari boccali due e tre e al ramo A del nervo buccale due. Utilizzare una procedura simile a quella illustrata nella pubblicazione di JoVE di Collins e Shield, brevemente riassunta qui.

Per ogni distacco dell'elettrodo, posizionare l'elettrodo vicino al nervo o al muscolo, inserire il nervo bersaglio nell'uncino e sollevarlo delicatamente utilizzando un manipolatore. Quindi asciugare la sezione del nervo con un fazzoletto di carta Kim. Applicare una goccia di colla istantanea gel super colla sull'uncino del nervo, assicurandosi che l'uncino sia completamente ricoperto di colla e che la punta del filo di riferimento non sia coperta di colla.

Successivamente, utilizzare una siringa con un attacco in tubo di polietilene per applicare la soluzione dalla bacinella sulla colla, inducendo così la superficie della colla a indurirsi. Il passaggio successivo consiste nel preparare una bacinella rotonda da registrazione in Pyrex di 100 per 50 millimetri da utilizzare come camera di registrazione, applicando uno strato sottile di grasso da vuoto sulla scanalatura tra la camera cerebrale e quella piegata con la punta di una pipetta, al fine di ridurre al minimo le perdite. Quindi riempire la camera anteriore con una soluzione salina di plescia.

Trasferire con attenzione la massa buccale dalla piastra di Petri alla camera anteriore della capsula rotonda in Pyrex, assicurandosi che nessuno degli elettrodi venga tirato eccessivamente, il che potrebbe recare danno ai nervi. Prestare la massima attenzione agli elettrodi ad uncino qualora fosse necessario trasferire la capsula a un altro microscopio stereoscopico. Per assottigliare la guaina.

Raggruppare insieme gli elettrodi su ciascun lato della massa buccale. Tenere con cura gli elettrodi afferrando il nastro adesivo che copre i perni dei connettori e, ancora una volta, assicurarsi che nessuno degli elettrodi sia tirato in modo troppo stretto. Quando la piastra è posizionata sotto il microscopio, gli elettrodi devono essere disposti delicatamente lungo i bordi della piastra e appoggiati sulla piattaforma durante le pause e tra le diverse fasi dell'esperimento; aerare la soluzione salina nella camera della massa buccale utilizzando una pietra porosa da acquario.

Successivamente fissare il ganglio cerebrale nella camera posteriore con i CBC che passano attraverso l'incisione. Applicare ulteriore grasso da vuoto sui CBC. Quindi aggiungere ulteriore soluzione salina SIA a entrambe le parti della capsula in modo che i gangli siano completamente immersi.

Assicurarsi che il livello della soluzione salina sia inferiore all'altezza della vaselina da vuoto posta tra le camere cerebrale e buccale, in modo da evitare perdite tra le camere. A questo punto, la massa buccale deve trovarsi sul fondo della camera anteriore. Successivamente, fissare con dei perni i gangli buccali sulla piattaforma centrale per evitare di danneggiare i nervi ancora collegati alla massa buccale.

Inserire i perni solo sulla guaina tra due nervi. Quindi aggiungere altri due perni ai lati dei CBC per stirarli e ancorarli. Mantenere i gangli buccali piatti o ruotati in base alla posizione dei neuroni di interesse.

Per ruotare il ganglio buccale, utilizzare un paio di pinzette fini per afferrare una parte in eccesso della guaina del CBC e fissarla tra il secondo nervo buccale e il terzo nervo buccale. A questo punto, la maggior parte dei corpi cellulari situati vicino alla camera posteriore e non facilmente accessibili dalla parte superiore del ganglio buccale diventa visibile. Infine, posizionare due puntine sulla guaina del ganglio buccale in prossimità del lato del massiccio buccale.

Per ridurre al minimo il movimento del ganglio buccale, afferrare la guaina del ganglio buccale vicino alla camera posteriore e rimuovere con forbici fini l'eccesso di guaina senza esporre i corpi cellulari. Per ridurre al minimo i danni, rimuovere soltanto la quantità di guaina necessaria per visualizzare i corpi cellulari dopo aver completato l'assottigliamento della guaina. Collegare tutti i pin degli elettrodi alle rispettive prese sui cavi che si connettono agli amplificatori.

Assicurarsi che gli elettrodi non siano tirati eccessivamente e siano correttamente collegati ai rispettivi cavi, e che le polarità siano corrette per eliminare eventuali residui di cloruro di magnesio. Sostituire la soluzione salina SIA nella camera del massiccio buccale con soluzione salina SIA fresca. Successivamente, far passare un filo di seta attraverso il tessuto molle nella parte anteriore del massiccio buccale e dorsalmente alla cartilagine della mascella.

Utilizzare due pezzi di argilla modellabile per fissare la suture al bordo della piastra, sospedendo così la massa buccale dalla sua posizione all'estremità anteriore. Un manipolatore tiene un elettrodo extracellulare di vetro in modo che la punta dell'elettrodo sia vicina al ganglio buccale. Per localizzare e identificare un neurone, abbassare delicatamente la punta dell'elettrodo extracellulare sul foglietto.

Sopra il soma neuronale. Applicare una corrente stimolante, quindi passare alla modalità di registrazione il canale utilizzato per eccitare il soma, al fine di registrare l'attività sull'elettrodo extracellulare e l'attività corrispondente sui nervi per indurre il rigetto. Ad esempio, programmi motori stimolano il nervo buccale due A con una lunga serie di impulsi di due hertz, di un millisecondo ciascuno, per generare schemi di ees.

I modelli persistono per tutta la durata della stimolazione e possono continuare fino a poco dopo la fine della stimolazione stessa. Per indurre programmi motori simili al morso, posizionare alcuni cristalli di caracol solido direttamente sul ganglio cerebrale.

I modelli ripetitivi iniziano generalmente entro cinque minuti e durano circa da 10 a 15 minuti prima di iniziare a diminuire, inducendo la deglutizione. Come nei programmi motori, applicare caracol e attendere finché la massa buccale non genera morsi vigorosi. Quindi, durante un morso, inserire una striscia di alga nella bocca dell'animale in modo che afferrino l'alga.

Di seguito è mostrata la stimolazione e la registrazione del neurone motore identificato B9, nonché la registrazione da questo stesso neurone, dal muscolo I2 e da diversi nervi durante i programmi motori associati all'alimentazione. Di seguito sono riportate le immagini video tratte dalla stessa serie di programmi motori. I modelli di deglutizione sono stati indotti applicando carbacolo al ganglio cerebrale e successivamente posizionando una striscia di alga nell'afferratore durante il morso indotto da carbacolo.

In questa immagine, la radula è protrusa per afferrare l'alga, e in questa immagine, la radula si è ritratta tirando l'alga all'interno della bocca. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come allestire il preparato buccale sospeso e ottenere registrazioni dei programmi motori del comportamento alimentare in vitro.