Name: Un In Vitro per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in Aplysia californica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Scopri la registrazione extracellulare dei programmi motori di alimentazione in Aplysia californica. Questo metodo consente di registrare l'attività elettrica di nervi, muscoli e neuroni durante i movimenti fisiologici.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH e NSF NS047073 concessione DMS1010434.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il lavoro precedente ha caratterizzato Aplysia programmi motori in intatta di un animale e nelle preparazioni ridotto come gangli isolato. Nell&#39;animale intatto, anche se le registrazioni di singoli neuroni sono stati ottenuti 5, tali esperimenti sono molto difficili, e gli elettrodi non può essere spostato da neurone a neurone durante l&#39;alimentazione. In gangli isolato, i movimenti alimentazione indotte da attività neurale non può essere osservato. La preparazione massa sospesa buccale colma ...

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biologico, Certificato</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>Certificato ACS</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>Certificato ACS </td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Fisher Scientifc</td><td>C79</td><td>Certificato ACS </td></tr><tr><td>Glucosio (destrosio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>Tampone MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>Carbacholo</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>Idrrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certificato</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certificato</td></tr><tr><td>Vetro capillare monobuco</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Microelettrodo puller modello Flaming-Brown P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Filamento utilizzato: FT345B</td></tr><tr><td>Filo di acciaio inossidabile smaltato</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0,001D, rivestimento h </td></tr><tr><td>Colla in silicone Household Silicone II</td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Supercolla Duro Quick-Gel</td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Amplificatore A-M Systems modello 1700</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Impostazioni del filtro: 300-500 Hz nervi, 10-500 Hz muscolo I2</td></tr><tr><td>Stimolatore multicanale Pulsemaster</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore di stimolo</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Contatore totale Veeder-Root</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>Pins Connettori Dorati</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Prese Connettori Dorate</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Elastomero in silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto cristallizzatore 100 x 50 mm</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasso per vuoto alto</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Puntine Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastilina</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche in seta</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Pompa d'aria Whisper</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per acquario</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Pietra aerante Elite</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini Dumont n. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Alga nori per sushi Yaki</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</empreparazione&gt; per stimolare e registrare i programmi motori nutrire con i movimenti fisiologici in<em&gt; aplysia californica</em

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunzionalità, la capacità di una struttura periferica per generare più comportamenti distinti, 1, permette animali di adattarsi rapidamente loro comportamenti ai cambiamenti ambientali. Il mollusco marino Aplysia californica fornisce un sistema trattabili per lo studio della multifunzionalità. Durante l&#39;alimentazione, Aplysia genera diversi tipi distinti di comportamenti con la stessa apparecchiatura di alimentazione, la massa buccale. I gangli che controllano questi comportamenti contengono una serie di grandi neuroni identificati che sono accessibili per lo studio elettrofisiologico. L&#39;attività di questi neuroni è stato descritto in programmi motori che possono essere divisi in due tipi, programmi e ingestive egestive, basato sui tempi delle attività neurale che chiude la relativa grasper cibo all&#39;attività neurale che protrae o indietro la pinza 2. Tuttavia, in gangli isolato, i movimenti muscolari che producono tali comportamenti sono assenti, rendendodifficile essere certi se i programmi motori osservati sono correlati di comportamenti reali. In registrazioni vivo, nervose e muscolari sono stati ottenuti corrispondente a programmi di alimentazione 2,3,4, ma è molto difficile registrare direttamente da singoli neuroni 5. Inoltre, in vivo, programmi ingestive può essere ulteriormente suddiviso in morsi e 1,2 rondini, una distinzione che è difficile fare in precedenza descritto più in preparati in vitro. La preparazione massa sospesa buccale (Figura 1) colma il divario tra gangli isolati e animali intatti. In questa preparazione, comportamenti ingestive - compresi sia mordere e deglutizione - e comportamenti egestive (rifiuto) possono essere provocati, al tempo stesso neuroni individuali possono essere registrati da e stimolati con elettrodi extracellulari 6. I movimenti di alimentazione associati a questi comportamenti differenti possono essere regiDED, quantificati e direttamente collegati ai programmi motori. I programmi del motore per la preparazione massa sospesa buccale sembrano essere più simili a quelle osservate in vivo che sono programmi motori suscitato nei gangli isolato. Pertanto, i programmi motori di questa preparazione può essere più direttamente collegate al comportamento in vivo, al tempo stesso, i singoli neuroni sono più accessibili a registrazione e stimolazione che in animali intatti. Inoltre, come fase intermedia tra gangli isolati e animali intatti, risultati della massa sospesa buccale può aiutare nella interpretazione dei dati ottenuti in ambienti sia più ridotte e più intatta. La preparazione massa sospesa buccale è uno strumento utile per caratterizzare il controllo neurale della multifunzionalità in Aplysia.

Quando un elettrodo extracellulare viene posizionato sopra il soma di un neurone e utilizzato per stimolarlo, è possibile osservare una corrispondenza uno-a-uno tra gli impulsi registrati sul canale del soma e quelli sui nervi a cui il neurone proietta (Figura 6, pannello sinistro, stimolazione del neurone identificato B9). Il canale del soma (canale superiore) viene impostato in modalità stimolazione quando viene applicata la corrente (tempo 1 nella figura), quindi viene rapidamente commutato in modalit...

Descriviamo una tecnica per la registrazione extracellulare e stimolare di nervi, muscoli e singoli neuroni identificati<em&gt; In vitro</em&gt; Mentre elicitare ed osservando diversi tipi di alimentazione comportamenti nell&#39;apparato di alimentazione<em&gt; Aplysia</em&gt;.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione&gt; per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in<em&gt; Aplysia californica</em

La multifunzionalità, ovvero la capacità di una singola struttura periferica di generare comportamenti molteplici e distinti1, permette agli animali di adattare rapidamente i propri comportamenti...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività elettrica proveniente dai nervi, dai muscoli e dai neuroni, nonché i movimenti corrispondenti dell'apparato boccale durante i programmi motori alimentari. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo la massa buccale da un animale anestetizzato e posizionando elettrodi ad ago su nervi e muscoli chiave. Il secondo passaggio consiste nel posizionare la massa buccale in una camera di registrazione e preparare i gangli per la registrazione extracellulare.Successivamente, i neuroni bersaglio vengono localizzati utilizzando elettrodi extracellulari. L'ultimo passaggio consiste nell'indurre e registrare programmi motori legati all'alimentazione, come il morso, la deglutizione e il rigetto. Infine, il preparato della massa buccale sospesa viene utilizzato per mostrare l'attività di nervi, muscoli e singoli neuroni durante diversi movimenti simili all'alimentazione della massa buccale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli studi su gangli isolati, è che le registrazioni provenienti dai nervi, dai muscoli e dai singoli neuroni possono essere direttamente correlate ai movimenti dell'apparato alimentare. A dimostrare la procedura sarà huu, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare la procedura, anestetizzare un plegia sano del peso di 200-300 grammi in un vassoio da dissezione, iniettando circa il 50% del peso corporeo di cloruro di magnesio isotonico. Dopo la prima iniezione vicino alla coda dell'animale, massaggiare delicatamente la superficie dell'animale per distribuire il cloruro di magnesio.Somministrare iniezioni aggiuntive vicino alla testa dell'animale secondo necessità. Dopo che l'animale smette di rispondere a stimoli tattili leggeri, fissarlo sul vassoio con il dorso rivolto verso l'alto. Inserire un perno nella coda e un perno in ciascun tentacolo anteriore.Quindi utilizzare la pinzetta per pizzicare e sollevare la pelle dell'animale nella parte centrale della testa. Dietro le zampe anteriori, effettuare un'incisione coronale attraverso la testa dell'animale appena dietro il punto trattenuto. Successivamente, praticare un'incisione sagittale mediana tra le zampe anteriori in direzione della bocca per esporre la massa buccale.Successivamente, staccare il lembo di pelle dalla massa buccale e recidere i nervi e il tessuto connettivo che si attaccano alla parete corporea. Per separare completamente questo lembo di pelle dalla massa buccale, accertarsi di non recidere alcun nervo o tessuto intrinseco alla massa buccale. Successivamente, afferrare e tenere l'esofago.Tagliare l'esofago posteriormente al punto trattenuto. Sollevare l'esofago ed estrarre il massiccio buccale situato dietro il massiccio buccale. I gangli cerebrali, pleurali e pedali formano un anello, con il ganglio cerebrale collegato ai gangli buccali tramite i connettivi cerebro-buccali.Lasciare questi gangli anulari attaccati alla massa buccale e recidere tutti i nervi che si estendono da questi gangli verso altre parti del corpo. Quindi tagliare il tessuto connettivo intorno alla massa buccale e continuare a sollevare la massa buccale man mano che si stacca dal resto del corpo. Una volta che la massa buccale è attaccata soltanto alla bocca, tenere l'esofago e la massa buccale.Verticalmente. Eseguire un taglio finale subito anteriormente alle mascelle per staccare la massa buccale dal corpo. Posizionare la massa buccale in una soluzione costituita da 50% di soluzione isotonica di cloruro di magnesio e 50% di soluzione salina SIA, al fine di mantenere un’anestesia parziale mentre vengono applicati gli elettrodi.Successivamente, posizionare la massa buccale con la soluzione in una capsula di Petri con fondo a sigaro, praticando un taglio attraverso l'arteria buccale sulla superficie ventrale della massa buccale. Quindi rimuovere i gangli pleurici e pedali recidendo le loro connessioni con il ganglio cerebrale. Lasciare il ganglio cerebrale attaccato ai gangli buccali e alla massa buccale tramite i CBC e recidere le altre connessioni tra il ganglio cerebrale e la massa buccale.Tagliare l'esofago e le ghiandole salivari a brevi lunghezze. In questo passaggio, collegare gli elettrodi ad ago al nervo oculare, ai due nervi muscolari boccali due e tre e al ramo A del nervo boccale due. Utilizzare una procedura simile a quella illustrata nella pubblicazione di JoVE di Collins e Shield, brevemente riassunta qui.Per ogni distacco dell'elettrodo, posizionare l'elettrodo vicino al nervo o al muscolo, inserire il nervo bersaglio nell'uncino e sollevarlo delicatamente mediante un manipolatore. Quindi asciugare la sezione del nervo utilizzando un fazzoletto Kim. Applicare una goccia di colla istantanea gel sull'uncino con il nervo, assicurandosi che l'uncino sia completamente ricoperto di colla e che l'estremità del filo di riferimento non sia coperta dalla colla.Successivamente utilizzare una siringa con un attacco in tubo di polietilene per applicare la soluzione dalla bacinella sulla colla, inducendo così la superficie della colla a indurirsi. Il passaggio successivo consiste nel preparare una bacinella rotonda da registrazione in Pyrex di 100 per 50 millimetri da utilizzare come camera di registrazione, applicando uno strato sottile di grasso da vuoto sulla scanalatura tra la camera cerebrale e quella piegata con la punta di una pipetta, al fine di ridurre al minimo le perdite. Quindi riempire la camera anteriore con una soluzione salina plescia.Trasferire con attenzione la massa buccale dalla piastra di Petri alla camera anteriore della capsula rotonda in Pyrex, assicurandosi che nessuno degli elettrodi venga tirato eccessivamente, il che potrebbe recidere i nervi. Prestare molta attenzione agli elettrodi ad uncino se la capsula deve essere trasferita su un altro microscopio stereoscopico. Per l'assottigliamento della guaina.Raggruppare insieme gli elettrodi su ciascun lato della massa buccale. Tenere con cura gli elettrodi afferrando il nastro adesivo che copre i perni dei connettori e, ancora una volta, assicurarsi che nessuno degli elettrodi venga tirato in modo troppo stretto. Quando la piastra è posizionata sotto il microscopio, gli elettrodi devono essere disposti delicatamente lungo i bordi della piastra e appoggiati sulla piattaforma durante le pause e tra le diverse fasi dell'esperimento; aerare la soluzione salina nella camera della massa buccale utilizzando una pietra porosa da acquario.Successivamente fissare il ganglio cerebrale nella camera posteriore con i CBC che passano attraverso l'incisione. Applicare ulteriore grasso da vuoto sui CBC. Quindi aggiungere ulteriore soluzione salina SIA in entrambe le parti della capsula in modo che i gangli siano completamente immersi.Assicurarsi che il livello della soluzione salina sia inferiore all'altezza della vaselina da vuoto tra le camere cerebrale e buccale, in modo da evitare perdite tra le camere. A questo punto, la massa buccale dovrebbe trovarsi sul fondo della camera anteriore. Successivamente, fissare i gangli buccali sulla piattaforma centrale per evitare di danneggiare i nervi ancora collegati alla massa buccale.Inserire i perni solo sul foglio tra due nervi. Quindi aggiungere altri due perni ai lati dei CBC per stirarli e ancorarli. Mantenere i gangli buccali piatti o ruotati in base alla posizione dei neuroni di interesse.Per ruotare il ganglio buccale, utilizzare un paio di pinzette fini per afferrare una parte in eccesso della guaina del CBC e fissarla tra il secondo nervo buccale e il terzo nervo buccale. A questo punto, la maggior parte dei corpi cellulari situati vicino alla camera posteriore e non facilmente accessibili dalla parte superiore del ganglio buccale diventa visibile. Infine, aggiungere due puntine sulla guaina del ganglio buccale in prossimità del lato del massiccio buccale.Per ridurre al minimo il movimento del ganglio buccale, afferrare la guaina del ganglio buccale vicino alla camera posteriore e rimuovere con pinzette fini l'eccesso di guaina senza esporre i corpi cellulari. Per ridurre al minimo i danni, rimuovere soltanto la quantità di guaina necessaria per visualizzare i corpi cellulari dopo averne completato l'assottigliamento. Collegare tutti i pin degli elettrodi alle relative prese sui cavi che si connettono agli amplificatori.Assicurarsi che gli elettrodi non siano tirati eccessivamente e siano correttamente collegati ai rispettivi cavi, e che le polarità siano corrette per eliminare eventuali residui di cloruro di magnesio. Sostituire la soluzione salina SIA nella camera del massiccio buccale con soluzione salina SIA fresca. Successivamente, passare un filo di seta attraverso il tessuto molle nella parte anteriore del massiccio buccale e dorsalmente alla cartilagine della mascella.Utilizzare due pezzi di argilla modellabile per fissare la suture al bordo della piastra, sospedendo così la massa buccale dalla sua posizione all'estremità anteriore. Un manipolatore tiene un elettrodo extracellulare in vetro in modo che la punta dell'elettrodo sia vicina al ganglio buccale. Per localizzare e identificare un neurone, abbassare delicatamente la punta dell'elettrodo extracellulare sulla guaina.Sopra il soma neuronale. Applicare una corrente stimolante, quindi passare il canale utilizzato per eccitare il soma in modalità di registrazione per registrare l'attività sull'elettrodo extracellulare e l'attività corrispondente sui nervi al fine di indurre il rigetto. Come nei programmi motori, stimolare il nervo buccale due A con una lunga serie di impulsi di due hertz, della durata di un millisecondo, per generare schemi di ees.I modelli continuano per tutta la durata della stimolazione e possono persistere fino a poco dopo la fine della stimolazione. Per indurre programmi motori simili al morso, posizionare alcuni cristalli di caracol solido direttamente sul ganglio cerebrale.I modelli ripetitivi iniziano generalmente entro cinque minuti e durano circa da 10 a 15 minuti prima di iniziare a diminuire, inducendo la deglutizione. Come nei programmi motori, applicare caracol e attendere finché la massa buccale non genera morsi vigorosi. Quindi, durante un morso, inserire una striscia di alga nella bocca dell'animale in modo che afferrino l'alga.Qui è mostrata la stimolazione e la registrazione del neurone motorio identificato B9 e la registrazione dallo stesso neurone, dal muscolo I2 e da diversi nervi durante i programmi motori associati all'alimentazione. Di seguito sono riportate le immagini video tratte dalla stessa serie di programmi motori. I modelli di deglutizione sono stati indotti mediante applicazione di carbacolo al ganglio cerebrale e successivo posizionamento di una striscia di alga nell'afferratore durante il morso indotto da carbacolo.In questa immagine, la radula è protrusa per afferrare l'alga, e in questa immagine, la radula si è ritratta tirando l'alga all'interno della bocca. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire la preparazione del massiccio buccale sospeso e ottenere registrazioni dei programmi motori del pasto in vitro.

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Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare...

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

I saggi comportamentali forniscono potenti strumenti per comprendere la funzione neuronale. Qui presentiamo diversi protocolli per quantificare il comportamento alimentare predatorio trovato nel nematode modello Pristionchus pacificus e nei suoi parenti. Inoltre, forniamo metodi per analizzare gli adattamenti all'alimentazione predatoria, comprese le strutture della bocca e i denti.

Saggio comportamenti alimentari predatori in<em&gt; Pristionchus</em&gt; E altri nematodi

Questo protocollo descrive l'uso di codificato geneticamente Ca2 + reporter per registrare le modifiche attività neurale in comportarsi vermi di Caenorhabditis elegans .

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

Qui presentiamo un protocollo per la parte chirurgica minimamente invasiva dei muscoli intrinseci all'apparato alimentare del mollusco marino Aplysia californica per comprendere i ruoli di questi muscoli durante il comportamento di alimentazione.

Una tecnica di lesione mini-invasiva per i muscoli intrinseca all'odontoia di Aplysia californica

Questo protocollo presenta un metodo per l'imaging dell'attività della popolazione neuronale con risoluzione a singola cellula in specie di invertebrati non transgenici utilizzando coloranti sensibili alla tensione di assorbanza e un array di fotodiodi. Questo approccio consente un flusso di lavoro rapido, in cui l'imaging e l'analisi possono essere perseguiti nel corso di un solo giorno.

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

Questo protocollo dettaglia un saggio quantitativo di defecazione nel giovane mutante RAC1/ CED-10 Caenorhabditis elegans, fornendo un modello semplice per studiare gli stadi del morbo di Parkinson prodromico. Supera i limiti di altri modelli animali e facilita il test di strategie terapeutiche mirate alla patologia parkinsoniana precoce.

Valutazione della motilità gastrointestinale nei mutanti RAC1/CED-10 di Caenorhabditis elegans come strumento per studiare il morbo di Parkinson precoce

Scopri la registrazione extracellulare dei programmi motori di alimentazione in Aplysia californica. Questo metodo consente di registrare l'attività elettrica di nervi, muscoli e neuroni durante i movimenti fisiologici.

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