Name: Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Scopri come indurre la formazione di neo-isole nel fegato di topi diabetici mediante trasferimento genico con vettori adenovirali helper-dipendenti. Questo metodo offre un'alternativa promettente al trapianto di isole pancreatiche.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH: DK089061 R03-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), il diabete e Endocrinologia Research Center-(DERC - P30DK079638) presso il Baylor College of Medicine, una borsa di studio di fattibilità da Pilot &amp; il DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: premio JDRF # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

HDAds sono stati sviluppati per superare la debolezza di annunci prima generazione e di sfruttare per l&#39;applicazione di terapia genica. Tuttavia, le sfide tecniche rimangono. Ad esempio, è necessario HDAd HV per il confezionamento e l&#39;amplificazione HDAd vettore non è così efficace come annunci prima generazione. HV è un annuncio di prima generazione e la contaminazione di compromesso HV l&#39;efficacia della HDAd. Pertanto, transfezione altamente efficiente e condizioni ottimali per ogni passaggio seriale sono critici. Un altro parametro critico per la produzione di vettori è che il passaggio (P1-P4) deve essere utilizzato per il passaggio successivo 5 che è direttamente utilizzata come inoculo per cellule in sospensione. Per la nostra esperienza, i risultati migliori si ottengono utilizzando il passaggio attraverso il quale proporzione vettore HDAd è drammaticamente aumentata nel seguente passaggio (P3 in Figura 2). La resa di vettori HDAd dipende cassette transgene. Durante la produzione vettore, entrambi i transgeni sono espressi perché entrambi i geni sono in fase dipromotore onnipresente. Ngn3 è un fattore di trascrizione e BTC è un fattore di crescita, il che suggerisce che HDAd fattore di trascrizione vettore che esprime che possono influenzare la linea cellulare inibisce amplificazione mentre vettore che esprime ormone della crescita aiuta nella replicazione vettore e confezionamento. Con il diabete assumendo proporzioni epidemiche, nuovi approcci per il ripristino delle cellule B di massa sono necessari. In questa relazione, si descrivono i metodi per sfruttare i vantaggi di vettori HDAd per effettuare il trasferimento genico di isole lignaggio di definizione fattore di trascrizione, Ngn3 insieme al fattore di crescita isolotto, betacellulin per indurre neogenesi isolotto nelle regioni periportale del fegato. Per valutare l&#39;efficacia di questo, è importante scegliere topi con iperglicemia stabile e garantire che controlli appropriati sono sempre inclusi. Per gli esperimenti di trasferimento di questo gene, il vettore vuoto trattato topi diabetici devono sempre essere utilizzato. Inoltre, utilizzando HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc e trattate una diabetica mice serve per testare il contributo individuale di questi due geni in isolotto neogenesi. Come i nostri dati dimostrano che Ngn3 solo è sufficiente per indurre isolotto neogenesi, ma l&#39;aggiunta del fattore di crescita, Btc, serve per aumentare la risposta conseguente induzione robusto isolotto neogenesi. È anche importante verificare che il vettore di espressione è infatti realizzato nel tessuto bersaglio, il fegato e anche per dimostrare che l&#39;insulina dosati nel plasma dei topi trattati non proviene da isole residue nel pancreas, dimostrando l&#39;assenza di pancreas isolotti nei topi diabetici. In sintesi, il vantaggio di HDAd-vettore di trasferimento genico risiede nella sua capacità di clonazione elevata, trasduzione efficiente e di lunga durata espressione genica nel fegato con minima tossicità cronica e la sua natura di non-integrazione del genoma vettoriale nell&#39;ospite cromosoma. Le limitazioni principali sono i passaggi complessi coinvolti nella sua generazione e la suain applicazione vivo è principalmente limitato al fegato con il sierotipo annunci più popolare 5. Islet neogenesi può essere indotto a ripristinare completamente insulina plasmatica e la tolleranza al glucosio nei topi diabetici inducendo neogenesi isolotto nel fegato attraverso il trasferimento genico di isole lignaggio definitorio fattore di trascrizione, Ngn3 insieme con il fattore di crescita isolotto, betacellulin. In questo rapporto, si mostra il protocollo ottimale per generare alta qualità HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc, e dimostrare le tecniche per indurre e valutare neogenesi isolotto nel fegato di topi diabetici per invertire iperglicemia. Nota: I vettori virali e le linee cellulari qui descritti sono disponibili presso il Laboratorio Nucleo Vector Produzione, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Alcuni kit commerciali sono disponibili anche per la generazione di virus (ad esempio HDAd Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit Transfection mammiferi </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM polvere </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillina Streptomicina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNasi I, II grado </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vetro filatore fiaschi </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vetro filatore fiaschi </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Far scorrere A-lizzatore Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tubo optiseal poli allomer, 11.2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 1 kg di cloruro di cesio </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Ottimale LE-80K ultracentrifuga </td></tr><tr><td> Filtro </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifuga tubo 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree scientifico, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> L&#39;insulina, Mouse ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mouse C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> cavia anti-insulina anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> di capra anti-anticorpo Pdx1 </td><td> dono di Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> topo anti Ngn3 anticorpo </td><td> Beta cellulare Consorzio Biologia, Univ. della Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> topo anti Nkx6.1 anticorpo </td><td> Beta cellulare Consorzio Biologia, Univ. di Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticorpo anti-betacellulin </td><td> Cella Scienze </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Colore set di reagenti. </td><td> Teco Diagnostica </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Endpoint Reagente Imposta colore </td><td> Teco Diagnostica </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.

neo-islet formazione nel fegato di topi diabetici da helper-dipendente adenovirale vector-mediated gene transfer

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Diabete di tipo 1 è causato da cellule T-mediata distruzione autoimmune delle cellule che producono insulina nel pancreas. Finora sostituzione insulina è ancora la terapia importante, perché il trapianto di isole è stata limitata dalla disponibilità del donatore e dal bisogno di lungo termine immunosoppressione. Indotto isolotto neogenesi mediante trasferimento genico di Neuogenin3 (Ngn3), l&#39;isolotto lignaggio di definizione fattore di trascrizione specifico e Betacellulin (Btc), un fattore di crescita isolotto ha il potenziale per curare diabete di tipo 1. Vettori adenovirali (Ads) sono altamente efficiente vettore di trasferimento genico, tuttavia, annunci prima generazione hanno diversi svantaggi per uso in vivo. Helper-dipendenti Pubblicità (HDAds) sono gli annunci più avanzati che sono stati sviluppati per migliorare il profilo di sicurezza della prima generazione di annunci e di prolungare espressione del transgene 1. Mancano di tossicità cronica a causa della mancanza virali sequenze codificanti 2-5 e conservare solo Ad cis elENTI necessarie per la replicazione vettore e l&#39;imballaggio. Questo permette la clonazione di fino a 36 geni kb. In questo protocollo, si descrive il metodo per generare HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc e per fornire questi vettori in STZ indotte topi diabetici. I nostri risultati mostrano che la co-iniezione di HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc induce &#39;isolotti neo &quot;nel fegato e inverte iperglicemia nei topi diabetici.

Descriviamo epatica neo-isolotto formazione STZ (streptozotocina)-indotta topi diabetici mediante trasferimento genico di Neurogenin3 (Ngn3) e Betacellulin (Btc) utilizzando helper-dipendente vettore adenovirale (HDAd) e l&#39;inversione di iperglicemia. Il nostro metodo sfrutta le vettori adenovirali dipendenti da helper con la loro alta efficienza nella trasduzione vivo e l&#39;espressione genica lunga durata.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

Il diabete di tipo 1 è causato dalla distruzione autoimmune, mediata dalle cellule T, delle cellule produttrici di insulina nel pancreas. Fino a oggi, la terapia sostitutiva con insulina è ancora la ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è indurre neo-isolotti nel fegato di topi diabetici mediante trasferimento genico mediato da vettori adenovirali dipendenti da helper. Ciò si ottiene generando vettori adenovirali dipendenti da helper contenenti il fattore di trascrizione degli isolotti neurogene 3 e il fattore di crescita degli isolotti betalina, al fine di indurre la formazione di neo-isolotti periportali nel fegato; i vettori vengono quindi iniettati in topi diabetici. Nei topi diabetici trattati si procede successivamente alla verifica della normalizzazione della glicemia, dell'insulina plasmatica e della presenza di cellule beta produttrici di insulina nel fegato.I risultati di questi saggi dimostrano che l'iper glicemia viene invertita nei topi trattati con vettore a seguito della formazione di neo palpebre nelle regioni periportali del fegato. Il vantaggio del vettore avir dipendente da herpa è un ampio tropismo e una elevata capacità cronica. Inoltre, il vettore adenovirale dipendente da herpa non contiene alcuna regione codificante per avir.Per questo motivo non presenta tossicità cronica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del diabete, poiché l'induzione di nuovi isolotti rappresenta un'alternativa efficace al trapianto di isolotti, limitato dalla carenza di donatori, dal fallimento dell'innesto e dall'immunità alloreattiva. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché il processo di trasfezione è complesso a causa delle grandi dimensioni del vettore.E per minimizzare la contaminazione da virus nell'ambiente, l'amplificazione e il processo di purificazione devono essere eseguiti con attenzione. La produzione di vettori adenovirali dipendenti da helper prevede diverse fasi che devono essere seguite attentamente per ottenere risultati ottimali. In preparazione del seme per la trasfezione, seminare 800.001 cellule in ciascuna di due piastre da sei centimetri.Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, le cellule saranno confluenti al 70-80% per la trasfezione. Nel giorno della trasfezione.Sostituire il mezzo di crescita con cinque millilitri di mezzo fresco e incubare le cellule per tre ore. Successivamente, utilizzando il kit di trasfezione mammiferica Pro Perfection Arm di Promega, trasfettare le cellule 16 con 10 microgrammi di DNA che codifica per il neurogene in tre, indicato in seguito come tre, o una cellula beta, indicata in seguito come BTC. Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con un millilitro di mezzo di crescita ogni volta.Aggiungere il virus helper a 500 particelle virali per cellula in 0,1 millilitri di PBS con calcio e magnesio. Quindi riporre le cellule nell'incubatrice ogni 10 minuti. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente il virus helper.Dopo 60 minuti, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di mantenimento e rimettere le piastre nell'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere un altro millilitro di mezzo di mantenimento. Quindi, utilizzando un microscopio ottico standard, esaminare le cellule per valutare gli effetti citopatici.Le cellule infette diventeranno arrotondate e si staccheranno. Continuare l'incubazione delle cellule infette fino al secondo giorno. A questo punto, più dell'80% delle cellule dovrebbe mostrare effetti citopatici.Raccogliere il lisato virale grezzo aspirando e dispensando con una pipetta, quindi trasferirlo in una provetta da cinque millilitri. Aggiungere il 10% in volume di saccarosio al 40%. Etichettare questa provetta come CVL, per lisato virale grezzo passaggio zero ai pidocchi.Per rilasciare le particelle virali, sottoporre il tubo contenente il lisato virale grezzo a tre cicli di congelamento e scongelamento, alternando il posizionamento del tubo in un congelatore a meno 80 gradi e in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine del terzo ciclo di congelamento e scongelamento, utilizzare il mezzo per amplificare ulteriormente il vettore come descritto nel testo allegato. Il processo di amplificazione del vettore produrrà un lisato virale grezzo dal passaggio cinque o P cinque del vettore.Per la produzione su larga scala di adenovirus dipendenti da helper, iniziare scongelando e congelando nuovamente P cinque ottenuto dalla procedura di amplificazione del vettore, ripetendo il ciclo tre volte come in precedenza durante il processo di congelamento-scongelamento. Trasferire una 16 cellule da un'ampolla agitata da tre litri in bottiglie coniche da 500 millilitri e centrifugare a 1000 volte G per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere tutto il supernatante tranne 100 millilitri.Quindi risospendere le cellule e trasferirle in un matraccio agitato da 250 millilitri contenente le cellule risospese. Aggiungere tutto il lisato virale grezzo P5. Quindi aggiungere il virus helper a 200 particelle virali per cellula e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius a 60 giri al minuto.Al termine dell'incubazione, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una pozzetta di una piastra a 12 pozzette. Trasferire il resto della sospensione cellulare in un nuovo matraccio agitato da 3 litri e aggiungere 2 litri di mezzo di crescita in sospensione. Incubare sia il matraccio che la piastra per due giorni in un'incubatrice a anidride carbonica a 60 giri al minuto; nei due giorni successivi, monitorare le cellule nella piastra per evidenziare eventuali effetti citopatici.Se le cellule nella piastra mostrano effetti citopatici, anche le cellule nel matraccio agitato presentano effetti citopatici. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere con 15 millilitri di tris 100 millimolare HCl in un tubo da 50 millilitri etichettato P sei.Conservare questo tubo a meno 80 gradi Celsius fino alla purificazione. Per purificare il vettore, aggiungere un millilitro di deossicolato di sodio al 5% al tubo scongelato contenente il lisato virale grezzo P6. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere cloruro di magnesio, RNA A e DNA 1 ed incubare a 37 gradi Celsius per un'ora; dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 6.000 ×g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere il soprannatante in un nuovo tubo da 50 millilitri e trasferirlo in un tubo sterilizzato per ultracentrifuga NVT 65. Aggiungere 2,8 millilitri di una soluzione di cloruro di cesio a bassa densità da 1,25 grammi per millilitro.Quindi, utilizzando una pipetta da due millilitri, si aggiungono sottofondo 2,8 millilitri di una soluzione di cloruro di CM ad alta densità (1,41 grammi per millilitro) al tubo, appoggiando la punta della pipetta sul fondo del tubo e rilasciando lentamente la soluzione. Successivamente, utilizzando una pipetta da due millilitri, si sovrappongono cinque-sei millilitri di supernatante. Appoggiando la punta alla parete laterale del tubo e rilasciando lentamente la soluzione, il tubo deve essere riempito fino al collo.In caso contrario, potrebbe collassare durante la centrifugazione ad alta velocità. Se necessario, utilizzare tris HCl 100 millimolare per riempire il resto del tubo. Quindi centrifugare a 10 gradi Celsius per 30 minuti a 237.000 × g a 10 gradi Celsius.Dopo la ultracentrifugazione su gradiente di densità, una singola banda vettoriale opalescente è visibile al di sotto dei detriti cellulari opachi. A volte una banda d'aiuto molto tenue può essere osservata al di sotto della banda vettoriale più evidente. Pulire il tubo nella zona della banda opalescente inferiore con etanolo al 70%.Quindi, utilizzando una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 22 gauge, perforare la parete del tubo alla base della banda del vettore e raccogliere la banda opalescente inferiore. Trasferire il materiale del vettore raccolto in nuovi tubi per ultracentrifuga sterilizzati, quindi sovrapporre una soluzione di cloruro di cesio con densità di 1,35 grammi per millilitro fino a riempire i tubi fino al collo.Centrifugare a 10 gradi Celsius a 237.000 ×g per tutta la notte. Dopo il secondo gradiente di densità, raccogliere la banda opalescente mediante ultracentrifugazione come in precedenza. Trasferire la banda in una cassetta per dialisi e dializzare contro tre litri di T tris sterile, HCL contenente cloruro di magnesio e saccarosio a quattro gradi Celsius per tutta la notte; procedere il giorno successivo.Per rimuovere il vettore adenovirale helper-dipendente dalla cassetta per dialisi, utilizzare una siringa da tre millilitri per iniettare due millilitri di aria nella cassetta dall'angolo superiore. Ruotare la cassetta in modo che la siringa e l'ago si trovino nell'angolo inferiore e, mantenendo la cassetta in posizione verticale, aspirare la soluzione nella siringa. Trasferire la soluzione, che ora contiene il virus purificato, in provette criogeniche precedentemente etichettate.Aliquotare 20 microlitri per la titolazione fisica e 50 microlitri per la caratterizzazione del DNA in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro, quindi congelare. I tubi criogenici contengono il virus purificato a meno 80. Il virus purificato deve poi essere valutato per una maggiore purezza e per l'efficacia in vitro.Come descritto nel documento allegato, lo streptodigio viene utilizzato per indurre il diabete. In questo studio, come descritto nel documento allegato, monitorare settimanalmente gli animali trattati con streptozocina per rilevare iperglicemia. Una volta che la glicemia si attesta tra 250 e 500 milligrammi per decilitro per 48 ore, posizionare i topi nel contenitore per la vena della coda per un'iniezione endovenosa nella coda.Posizionare la coda in un tubo da 50 millilitri contenente acqua calda per dilatare le vene della coda. Quindi strofinare la coda con un tessuto imbevuto di etanolo al 70%. Caricare una siringa da un millilitro con un ago da 30 e mezzo di calibro con la concentrazione appropriata di vettore, verificando che non ci siano bolle d'aria nella siringa.Quindi, con il pollice e l'indice, afferrare la coda sotto il sito di iniezione e inserire l'ago nella vena della coda. Se l'ago è all'interno della vena, potrebbe essere visibile un lampo di sangue nel connettore dell'ago. Iniettare lentamente il vettore.Se l'ago è posizionato correttamente, non ci sarà resistenza durante l'iniezione. Rimuovere l'ago e tenere il sito di iniezione con una garza per arrestare qualsiasi sanguinamento prima di restituire il topo alla gabbia. Dopo il trattamento con il vettore, monitorare settimanalmente la glicemia a digiuno di sei ore e il peso corporeo, e controllare i livelli di insulina e degli enzimi epatici ogni due settimane.Eseguire un test di tolleranza al glucosio a sei settimane dal trattamento per verificare se la secrezione di insulina stimolata dal glucosio è stata ripristinata in vivo a tre e a sei settimane dal trattamento. Prelevare il fegato e il pancreas dai topi per l'analisi del MNA tissutale e per la colorazione immunoistochimica, al fine di valutare se la neoformazione di isolotti possa essere indotta nel fegato di topi diabetici mediante trasferimento genico mediato da vettore adenovirale. I vettori adenovirali dipendenti dall'aiutante, o H-D-A-D-N-G-N tre e vettori BTC, sono stati preparati e purificati come descritto in questo video; i vettori sono stati somministrati a topi diabetici indotti da streptozotocina mediante iniezione nella vena della coda.I vettori vuoti e i vettori H-D-A-D-B-T-C da soli sono stati utilizzati come controlli negativi. La glicemia è stata quindi monitorata ogni due giorni per un periodo compreso tra sette e dieci giorni successivi all'iniezione. L'iperglicemia si è invertita nei topi iniettati sia con HDAD e GN tre che con H-D-A-D-B-T-C, ma non nei topi di controllo.La secrezione di insulina stimolata dal glucosio è stata inoltre monitorata mediante un test di tolleranza al glucosio eseguito sei settimane dopo il trattamento, come mostrato qui. La secrezione di insulina è stata ripristinata nei topi iniettati sia con HDAD e GN tre e H-D-A-D-B-T-C per valutare se l'insulina fosse sintetizzata nel fegato. Il contenuto di peptide C e di insulina è stato analizzato nel fegato.Le concentrazioni di peptido C e il contenuto totale di insulina sono stati misurati utilizzando un kit ELIZA commerciale. La presenza di peptido C e insulina in rapporti molari conferma che l'insulina rilevata nel fegato viene effettivamente sintetizzata in loco. L'immunohistochimica ha mostrato cellule positive nel fegato di topi trattati con HDAD, NGN tre e H-D-A-D-B-T-C, ma non nei topi trattati con vettore di controllo; la colorazione immunoistochimica ha inoltre dimostrato l'assenza di residui di isolotti pancreatici nei topi trattati con NGN tre BTC.L'espressione del fattore di trascrizione specifico per la linea cellulare della palpebra è stata inoltre valutata mediante immunomarcatura del fegato. Come mostrato qui, NGN tre era espresso nel fegato dei topi trattati con NGN tre BTC, ma non nei topi trattati con vettore vuoto.Analogamente, BTC è stato espresso a un livello più elevato nel fegato dei topi trattati con NGN tre BTC rispetto a quanto osservato con il trattamento con vettore vuoto, come mostrato qui. La colorazione immunoistochimica per P DX uno ha rivelato una localizzazione nucleare nei fegati dei topi trattati con NGN tre BTC, ma non nei fegati dei topi trattati con vettore vuoto. NK X 6.1 è stato inoltre rilevato esclusivamente nei fegati dei topi trattati con NGN tre BTC.Nel complesso, questi risultati indicano un'induzione con successo della formazione di una nuova palpebra nel fegato del topo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare vettori adenovirali dipendenti dall'aiuto per trasferire nel fegato i geni determinanti la linea cellulare della palpebra, al fine di indurre la neogenesi oculare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre settimane se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il virus helper è un avir di prima generazione che ci aiuta. La contaminazione deve essere mantenuta al minimo per l'applicazione in vivo.

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Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Viene presentato un protocollo per creare pseudoislets umani modificati in gene da cellule di isole umane disperse che vengono tradusse da lentivirus che trasportano RNA a forcina corta (shRNA). Questo protocollo utilizza vasi enzimatici e di coltura prontamente disponibili, può essere eseguito facilmente e produce pseudoislets umani geneticamente modificati adatti per studi funzionali e morfologici.

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.

Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri come indurre la formazione di neo-isole nel fegato di topi diabetici mediante trasferimento genico con vettori adenovirali helper-dipendenti. Questo metodo offre un'alternativa promettente al trapianto di isole pancreatiche.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

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