Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari
26 dicembre 2012
Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule epiteliali alveolari di tipo due, primarie, pure e vitali, per successivi analisi funzionali e molecolari. In primo luogo, il polmone e la trachea di un topo sacrificato vengono instillati con una soluzione di DYS displays e successivamente con agarosio. Il polmone viene quindi asportato dopo che il dispa ha digerito il tessuto polmonare.
Il tessuto viene disintegrato manualmente. La sospensione ottenuta viene filtrata attraverso una serie di maglie con dimensione decrescente dei pori. Successivamente, le cellule epiteliali alveolari di tipo due vengono colorate e isolate mediante selezione negativa citofluorimetrica.
In definitiva, le cellule epiteliali alveolari di tipo due isolate possono essere utilizzate per eseguire saggi funzionali e molecolari allo scopo di studiarne il ruolo nelle infezioni respiratorie e nelle malattie autoimmuni polmonari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della immunologia polmonare, in particolare nel contesto delle malattie polmonari autoimmuni e delle infezioni virali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la preparazione dell'organo e della sospensione cellulare è difficile da apprendere.
Il successo complessivo di questo protocollo dipende da diversi dettagli importanti durante questi passaggi. Per ogni topo dell'esperimento, preriscaldare un tubo da 15 millilitri contenente quattro millilitri di DYS bays in un bagno termico a 37 gradi Celsius; porre piccole aliquote di 1% low. Mel Aros in acqua in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius fino a completa liquefazione. Successivamente, raffreddare a 45 gradi Celsius e mantenerle a questa temperatura fino al successivo utilizzo.
Per preparare il polmone del topo, spruzzare un topo che è stato sacrificato per asfissia da CO2. Con etanolo. Eseguire un'incisione lunga lungo la linea mediana ventrale del corpo.
Quindi tirare la pelle ventrale esterna e tagliare con attenzione rimuovendo il peritoneo. Dopo aver esanguinato il topo, perforare con cautela e rimuovere il diaframma, quindi tagliare le costole. Per esporre il cuore e i polmoni, prestare particolare attenzione a non danneggiare i polmoni con una cannula da 26 gauge e una siringa da 10 millilitri riempita con liquido freddo.
Perforare il ventricolo destro del cuore con PBS ed effettuare la perfusione del polmone con PBS fino alla completa rimozione del sangue. Tagliare ed asportare le ghiandole salivari per esporre la trachea. Inoltre, tagliare con attenzione i muscoli che circondano la trachea.
Successivamente, inserire una cannula permanente da 22 gauge nella trachea. Rimuovere l'ago e spingere il catetere in plastica verso il polmone. Fissare il catetere al suo posto legando un piccolo pezzo di filo intorno alla trachea e al catetere.
Se necessario, preparare un campione di liquido di lavaggio broncoalveolare lavando i polmoni attraverso il catetere inserito nella trachea con PBS o mezzo. Conservare il liquido di lavaggio sul ghiaccio fino all'analisi successiva. L'aspetto più difficile di questa procedura è la digestione e la disintegrazione del tessuto.
Per garantire il successo di questo protocollo, è necessario verificare che la dispasi sia completamente riempita in tutti i lobi polmonari e dopo la digestione del tessuto. È necessario disintegrare il tessuto utilizzando con attenzione una siringa da due millilitri, introducendo ancora un volume massimo di due millilitri della dispasi preparata in precedenza nel polmone attraverso il catetere, in modo che tutti i lobi siano completamente espansi. Sostituire quindi la siringa con una da un millilitro contenente 0,5 millilitri della aros liquefatta e instillare il contenuto nel polmone.
Lasciare la siringa sul catetere per prevenire il reflusso degli aros e coprire immediatamente il polmone con carta da laboratorio, carta e ghiaccio. Lasciare riposare l'aero gel per alcuni minuti. Rimuovere la carta, il ghiaccio, la siringa e il catetere.
Quindi tagliare la trachea ed escindere il polmone, il cuore e il timo dalla cavità toracica. Sciacquare gli organi preparati in una piastra con PBS. Successivamente, rimuovere il cuore, il timo e la porzione residua di trachea dal polmone e scartarli.
Mettere il polmone nel tubo contenente i rimanenti due millilitri di displays e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Modificare l'incubazione per garantire un efficace blocco dei recettori FC delle cellule fagocitiche prima della procedura di colorazione. Trasferire il polmone dai displays in una piastra contenente sette millilitri di anticorpo anti-CD1632 ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro e 100 microlitri di DNA in DMEM, utilizzando due paia di pinzette per disintegrare completamente il tessuto polmonare tirandolo aparte.
Quindi incubarla per 10 minuti a temperatura ambiente su un agitatore impostato a 200 giri al minuto, se desiderato. La sospensione cellulare può quindi essere conservata a quattro gradi Celsius fino al passaggio successivo. Pipettare la sospensione cellulare attraverso una serie di maglie di nylon.
Prima di tutto, versare la sospensione attraverso un filtro da 100 micron posizionato sopra un tubo da 50 millilitri. Se si uniscono campioni, far passare le sospensioni cellulari di topi dello stesso gruppo attraverso lo stesso filtro. Se il filtro si ottura, sostituirlo con uno nuovo.
Ripetere questo processo utilizzando un filtro in mesh da 70 micron. Prestare attenzione a risciacquare accuratamente ogni mesh, nonché le provette e le capsule, con DMEM per minimizzare la perdita di cellule e massimizzare il rendimento. Successivamente, far passare la sospensione attraverso un filtro in mesh da 48 micron montato su un anello di plastica o vetro come mostrato qui.
Raccogliere il flusso passante in una piastra di Petri. Ripetere quindi questo procedimento con un setaccio da 30 micron. In base al volume, trasferire il filtrato in una o più provette da 50 millilitri e centrifugare per 15 minuti a 160 ×g a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi. Quindi interrompere rapidamente la lisi aggiungendo 13 millilitri di mezzo DMEM. Trasferire la soluzione in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per 12 minuti a 160 ×g e a quattro gradi Celsius.
Incubare le cellule in tre millilitri di un cocktail di anticorpi primari contenente anticorpi contro CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 e CD45. Incubare le cellule per 10 minuti al buio a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, lavare le cellule riempiendo la provetta con DMEM e centrifugare per 12 minuti a 160 × g e a quattro gradi Celsius.
Risospendere le cellule in un millilitro di DMEM e prefiltrare attraverso un filtro da 50 micron in un tubo per l'ordinamento cellulare. Contare le cellule per ottenere il numero totale di cellule nella sospensione polmonare. Utilizzare un ugello da 100 micron per l'approvvigionamento cellulare di un EC2 immediatamente prima dell'approvvigionamento.
Mescolare la sospensione cellulare mediante vortex nel fluido di guida. La pressione del fluido e le lunghezze d'onda di emissione e di rilevamento del laser dipendono dall'apparecchiatura utilizzata per l'ordinamento cellulare mediante citometria a flusso e dai fluorocromi impiegati nella procedura di marcatura con anticorpi. Per prima cosa, creare un grafico di dispersione laterale rispetto alla fluorescenza e impostare una finestra di selezione (gate) su tutte le cellule con elevata area di dispersione laterale e negative ai fluorocromi utilizzati per la marcatura.
Successivamente, generare i grafici di dispersione laterale area versus dispersione anteriore area e dispersione anteriore altezza versus dispersione anteriore area e dispersione laterale altezza versus dispersione laterale area, quindi effettuare il gating per escludere eventuali doppietti o aggregati cellulari, raccogliendo le cellule in un tubo contenente DMEM. Quando si utilizzano sospensioni cellulari polmonari isolate da topi sani, la popolazione nella finestra EC2 rappresenta tipicamente circa il 42 più o meno 10% di tutti gli eventi. Per raccogliere le cellule ordinate, centrifugare per 20 minuti a 280 ×g e a 4 °C.
Risospendere le cellule epiteliali alveolari di tipo due o le aEC2 in coltura, in media o tampone secondo le necessità per le analisi successive. Le cellule epiteliali alveolari di tipo due primarie di origine murina sono state isolate mediante selezione negativa tramite citometria a flusso come descritto in questo video; l'analisi delle cellule ordinate è mostrata qui. Come indicato.
La purezza delle cellule isolate è approssimativamente del 92 più o meno 5%. Gli AEC2 purificati sono stati colorati per la proteina surfattante C: a sinistra è mostrata un'immagine a contrasto di fase e a destra l'immunofluorescenza. È stato riscontrato che quasi il 100% delle cellule era positivo per la proteina surfattante C, confermando così l'isolamento con successo di una popolazione pura. Per valutare gli effetti dell'infezione in vivo da virus influenzale di tipo A, gli AEC2 sono stati isolati da topi C57BL/6 che avevano ricevuto per via intranasale, uno, due o tre giorni prima, soluzione salina fosfato o virus influenzale A PR8 (A/34).
Questi grafici mostrano sospensioni cellulari polmonari ottenute da topi maschi C57 Black Six non infetti e infetti da tre giorni, colorati per l'ordinamento in seguito al reclutamento di cellule immunitarie nel polmone infetto. La proporzione di cellule negative alla fluorescenza e con area di scattering laterale elevata è notevolmente ridotta nella sospensione cellulare ottenuta dai topi infetti da tre giorni rispetto a quelli non infetti. L'espressione della proteina nucleare del virus dell'influenza A è stata analizzata mediante colorazione intracellulare utilizzando un anticorpo specifico per la proteina nucleare.
L'istogramma mostra che un C due isolato da topi infetti in vivo produce un segnale di fluorescenza specifico dopo la colorazione intracellulare per la nucleoproteina del virus dell'influenza A. La tabella mostra l'intensità media della fluorescenza della colorazione della proteina nucleare: l'intensità del segnale prodotto dalla colorazione intracellulare della proteina nucleare di un EC2 isolato da topi infettati dal virus dell'influenza aumenta con la durata dell'infezione virale, dimostrando la vitalità di un EC2 isolato da topi sani e testandone la suscettibilità all'infezione da virus dell'influenza A.
L'espressione della proteina nucleare del virus dell'influenza è stata inoltre analizzata in cellule isolate infettate ex vivo, come mostrato qui. Una percentuale considerevole di EC2 esprime la proteina nucleare virale sei ore dopo l'infezione. Questi dati sono riassunti qui.
La percentuale di un EC2 positivo per la colorazione intracellulare della proteina nucleare virale dipende dalla dose virale utilizzata per l'esperimento di infezione ex vivo. Questi risultati mostrano che il neurone primario isolato, un EC2, è vitale e suscettibile all'infezione e alla replicazione virale, valutata mediante l'espressione della proteina virale rilevata. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è molto importante ricordare di eseguire con attenzione tutti i passaggi di digestione e disintegrazione del tessuto.
Inoltre, è molto importante ricordare di selezionare accuratamente le cellule negative per la fluorescenza e quelle con area laterale alta. Dopo aver effettuato il sorting con questo metodo, è possibile eseguire altre tecniche, come studi molecolari e funzionali, per escludere il ruolo del tipo cellulare due dei terzi del polmone nel contesto delle infezioni virali e delle malattie polmonari autoimmuni.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento rapido di cellule epiteliali alveolari di tipo II murine primarie (AECII) utilizzando la selezione negativa citometrica a flusso. Le AECII isolate mostrano alta vitalità e purezza, rendendole adatte per vari studi funzionali e molecolari relativi alle condizioni respiratorie.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Fisiologia respiratoria
- Immunologia
Contesto
- Le cellule epiteliali alveolari di tipo II svolgono un ruolo cruciale nella funzione e nell'omeostasi polmonare.
- Comprendere la loro funzione è importante per studiare le malattie respiratorie.
- I metodi attuali per l'isolamento di queste cellule possono essere lunghi e inefficienti.
- Questo studio presenta un approccio semplificato per migliorare l'efficienza dell'isolamento.
Obiettivo dello studio
- Isolare cellule epiteliali alveolari di tipo II primarie pure e vitali.
- Facilitare successive analisi funzionali e molecolari.
- Migliorare la comprensione delle AECII nelle condizioni respiratorie.
Metodi utilizzati
- Instillazione di display DYS e agarose nei polmoni e nella trachea di topi sacrificati.
- Disintegrazione manuale del tessuto polmonare dopo digestione.
- Filtrazione della sospensione risultante attraverso maglie di poro di dimensioni decrescenti.
- Isolamento di AECII mediante selezione negativa citometrica a flusso.
Risultati principali
- Il metodo fornisce alta vitalità e purezza delle AECII isolate.
- Le cellule isolate sono adatte per studi funzionali e molecolari.
- La procedura è efficiente e riproducibile.
- Potenziali applicazioni nello studio di malattie respiratorie autoimmuni e infettive.
Conclusioni
- Questo metodo di isolamento migliora lo studio delle cellule epiteliali alveolari di tipo II.
- AECII di alta qualità possono portare a migliori intuizioni sulle condizioni respiratorie.
- L'approccio potrebbe essere applicabile ad altri tipi di cellule nelle future ricerche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) enables mechanistic de-risking in respiratory disease target validation by providing a disease-relevant system that reflects in vivo complexity. This approach supports predictive confidence in early discovery by yielding highly viable, pure AECII suitable for functional and molecular assays, reducing reliance on immortalized cell lines. The method facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation of immune-mediated lung pathologies and viral infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a primary cell context that retains native lung microenvironmental influences.
- Operational Value: Provides a reproducible source of untouched AECII for pathway clarification and functional target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing assessment of compound effects on AECII-mediated immune regulation in infection and autoimmunity models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, highly pure AECII suspensions suitable for downstream functional assays including T-cell stimulation and cytokine profiling.
- Quantitative Output: Enables measurement of dependent variables such as surfactant protein C expression and intracellular viral nucleoprotein levels as biomarkers of cellular state and infection susceptibility.
- Scalability: Compatible with flow cytometry platforms allowing multiplexed sample processing and cross-group comparison in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Permits isolation of AECII from mice subjected to respiratory challenges such as influenza infection, enabling study of cell-intrinsic responses under pathophysiological conditions.
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates correlation of functional readouts with molecular signatures (e.g., viral protein expression) relevant to human respiratory disease mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing data on AECII viability and susceptibility to viral replication, informing mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary AECII for hypothesis testing in early biology, enabling assay development for screening campaigns, and generating quantitative functional and molecular readouts that inform translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in lung immunology by providing access to primary AECII from naïve and challenged mice.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions enabling reproducible compound evaluation in functional assays such as cytokine secretion and immune cell interaction assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements including sideward scatter high gating, fluorescence intensity of viral nucleoprotein, and surfactant protein C positivity for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through ex vivo and in vivo infection models that model human respiratory pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across multiple respiratory disease models, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through use of primary cells reflecting native lung biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via flow cytometric negative selection, minimizing variability introduced by enzymatic depletion or magnetic bead methods.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of lack of efficacy in AECII-mediated pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by generating data on AECII function in infection and autoimmunity, supporting indication selection and biomarker strategy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue handling, enzymatic lung digestion, and flow cytometric cell sorting instrumentation.
- Dependent on access to flow cytometer with appropriate laser and detection capabilities for sideward scatter and fluorescence discrimination.
- Necessitates standardization of antibody cocktails and gating strategies across sites to ensure reproducibility of AECII isolation.
- Involves optimization of tissue disintegration steps to maximize yield while preserving cell viability and surface marker integrity.
- Limited by the accessibility of AECII in diseased lungs, where immune cell infiltration may alter SSChigh gate frequency and require adaptive gating.
