Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule presentanti antigene artificiali CD1D, o A APC, per l'espansione delle cellule NKT. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo proteine per funzionalizzare le microsfere magnetiche. Nel secondo passaggio, la popolazione iniziale di cellule NKT proveniente dal sangue periferico viene arricchita.

Successivamente, i linfociti T arricchiti vengono coltivati in co-coltura con le APC di tipo A. Nell'ultima fase, viene valutato il fenotipo e la funzione della popolazione cellulare APC di tipo A. Infine, la purezza dei sottoinsiemi di linfociti T espansi può essere determinata mediante analisi citofluorimetrica. Il vantaggio principale delle APC rispetto ai metodi attuali che utilizzano cellule dendritiche è che le cellule dendritiche possono presentare un'elevata variabilità tra donatori.

Le APC forniscono un metodo riproducibile, pronto all'uso e standardizzato per l'espansione delle cellule T NK. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando lavoravo con il dottor Schneck e Oaky presso la Johns Hopkins. Essi hanno aperto la strada nel campo dell'utilizzo di complessi artificiali di presentazione dell'antigene per l'espansione dei sottogruppi classici di cellule T CD8.

La procedura sarà dimostrata dal dottor James East, ricercatore postdottorato, e dal figlio della dottoressa Wendy, un associato di ricerca del mio laboratorio. Iniziare trasferendo un millilitro di Dyna Bead M-450 di perle epoxide in un vial in vetro borosilicato trasparente da cinque millilitri con filettatura. Successivamente, lavare le perle con tre millilitri di buffer Bore 8 sterile in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 millilitri.

Aggiungere 100 microgrammi di dimero umano CD1D Ig e 20 microgrammi delle molecole co-stimolatorie desiderate in un millilitro di PBS privo di calcio e magnesio. Successivamente, posizionare il flaconcino in vetro contenente le perle su un magnete ed aspirare il tampone borato. Quindi aggiungere la miscela proteica al flaconcino in vetro e riposizionare il tappo.

Mescolare immediatamente la soluzione capovolgendo la provetta, quindi coprire il tappo con parafilm e posizionarla su un agitatore rotante durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, posizionare nuovamente la provetta di vetro sul magnete ed eliminare con attenzione la miscela proteica evitando le perle. Lavare le perle tre volte aggiungendo tre millilitri di tampone per il lavaggio delle perle e incubandole sull’agitatore rotante a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Per confermare che le proteine siano state caricate stabilmente sulle perle, colorare un'aliquote delle perle con anticorpi e analizzarle mediante analisi citofluorimetrica. Ora trasferire cinque volte 10 alla settima perle in una piccola provetta di vetro da 1,5 millilitri e lavare le perle con un millilitro di PBS sterile. Quindi 48-72 ore prima dell'uso.

Caricare le perle lavate con l'antigene in un millilitro di PBS sterile mentre le perle vengono caricate con l'antigene. Raccogliere i PBMC diluendo prima il sangue del donatore eparinizzato con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 15 millilitri di PHI a temperatura ambiente, trasferire in provette coniche da 50 millilitri e sovrapporre lentamente 25 millilitri della miscela di sangue diluito sopra il PHI.

Chiamare quindi dopo aver centrifugato i campioni per 30 minuti a 700 ×g e temperatura ambiente con la frenata disattivata. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire con attenzione l'interfaccia dei linfociti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, lavare i linfociti con 50 millilitri di PBS, scartando il surnatante e combinando i tubi provenienti da un singolo donatore in un unico tubo.

Dopo aver lavato nuovamente i PBMC con 20 millilitri di PBS, contare le cellule e quindi sospenderle a una concentrazione di cinque per 10 alla settima cellule per millilitro in buffer max. Per isolare la frazione di linfociti T, incubare 100 microlitri di soluzione di arricchimento PAN per linfociti T del kit di arricchimento per linfociti T umani EP con due millilitri di PBMC per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, incubare la soluzione con 100 microlitri di microsfere magnetiche a temperatura ambiente per altri 10 minuti.

Portare il volume finale del solvente a 2,5 millilitri, quindi posizionare il tubo sul magnete. Dopo cinque minuti, versare rapidamente la frazione CD3 positiva in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare ora le cellule con 5 millilitri di buffer Max freddo e contare le cellule vitali.

Prelevare un'aliquote per la colorazione degli antigeni di superficie per selezionare prima le cellule CD161 positive. Risospendere le cellule T arricchite in 980 microlitri di buffer Max freddo, quindi incubare le cellule con 10 microgrammi di anticorpo monoclonale anti-CD161 per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule, risospendere il pellet in 800 microlitri di buffer Max e 200 microlitri di microsferette di anti-IgG di topo.

Incubare questa soluzione a quattro gradi Celsius per altri 10 minuti. Mentre le cellule sono in incubazione con le microperle, aggiungere tre millilitri di buffer max per equilibrare una colonna LS. Dopo aver lavato questa frazione cellulare, pipettare lentamente le cellule in tre millilitri di buffer max all'interno della colonna.

Ora risciacquare la colonna tre volte con tre millilitri di buffer max fresco. Quindi aggiungere altri tre millilitri di buffer max fresco alla colonna e trasferire la colonna in un tubo conico da 15 millilitri. Espellere le cellule CD161 positive e CD3 positive purificate, quindi contare la frazione arricchita in cellule NKT.

Iniziare questo passaggio co-coltivando da 10 alla sesta cellule T CD161 positivo CD3 positivo arricchite e 10 alla sesta cellule A APC in 16 millilitri di mezzo completo. Trasferire 160 microlitri per pozzetto della co-coltura in una piastra in polistirene trattata per colture cellulari a fondo rotondo da 96 pozzetti con coperchio a bassa evaporazione. Al giorno 12-14, raccogliere e contare le cellule. Analizzare le popolazioni mediante analisi citofluorimetrica, quindi ripiantare e co-coltivare.

I linfociti NKT espansi, come appena dimostrato, congelano i linfociti NKT aggiuntivi dopo il secondo ciclo di espansione. Per verificare la funzionalità delle cellule A A PC, effettuare innanzitutto una co-coltura di cinque volte 10 alla quarta cellule NKT per pozzetto con cinque volte 10 alla quinta cellule A A PC, in un volume finale di 200 microlitri di mezzo completo, in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo. Dopo 24-48 ore, raccogliere il sopranatante della coltura cellulare per l'analisi mediante Elisa. Questa prima figura dimostra che le proteine CD 1D IG sono stabilmente immobilizzate sulla superficie delle microsferette magnetiche, come mostrato qui.

Gli anticorpi CD1D-Ig e anti-CD28 sono entrambi espressi sulla superficie delle microsferette magnetiche, come dimostrato in questo grafico. L'ibridoma di cellule T NK del topo V alpha 14 positivo DN3A2-D3 è stato coltivato in co-coltura con antigeni solubili di alpha-galactosilceramide non caricati su APC o con alpha-gal caricati su APC. I supernatanti di coltura sono stati quindi raccolti e la produzione di IL-2 è stata misurata mediante ELISA, fornendo un metodo semplice per testare ogni lotto di cellule presentanti l'antigene. In questo esperimento, le cellule T del sangue periferico umane CD161 positive e CD3 positive sono state arricchite mediante separazione con microsferette magnetiche.

Le cellule sono state quindi stimolate una volta a settimana per 14 giorni con APC caricate con alfa-galattosilceramide e analizzate per l'espressione di V alfa 24 e V beta 11. È importante notare che, anche con una popolazione iniziale relativamente bassa di cellule NKT pari allo 0,03%, è stato possibile espandere le cellule fino a raggiungere circa il 67% di popolazione positiva per V alfa 24 e positiva per V beta 11. In questo caso, cellule C1R CD1D sono state incubate con cellule NKT nei rapporti indicati in presenza o assenza dell'antigene Alpha GalCer, in piastre a 96 pozzetti con fondo a U, per un periodo di 20-24 ore.

Il lisaggio cellulare mediato da cellule NKT della linea di linfoma B è stato quindi valutato mediante saggio di rilascio del cromo. Le cellule NKT espanse in PC sono state in grado di lisare questa linea cellulare di linfoma. In presenza o assenza di alfa-galactosylceramide, le cellule NKT sono state espanse dai PBMC sia di volontari sani che di pazienti oncologici, e sono state caricate con alfa-galactosylceramide.

Un PC A è stato in grado di espandere le popolazioni di cellule NKT da entrambi i gruppi. Partendo da una popolazione di 2 milioni di cellule T CD161 positive e CD3 positive, è possibile ottenere più di 10 alla settima cellule dopo due cicli di espansione. Le cellule NKT possono essere utilizzate per studi funzionali, come dimostrato in questo caso.

I linfociti NKT espansi ex vivo rimangono sensibili alla stimolazione con Alpha GAL e sono produttori potenti di IL-17A, TNF-alfa e interferone-gamma. Va notato che se la popolazione iniziale di linfociti T arricchita è bassa e il secondo passaggio di arricchimento per CD161 non può essere eseguito, l'espansione mediata da A APC potrebbe non produrre i risultati previsti. Tuttavia, se la percentuale di linfociti NKT circolanti è superiore allo 0,1%, dovrebbe comunque essere possibile ottenere un'espansione significativa dei linfociti NKT invarianti.

Nel complesso, questi dati dimostrano che l'AA PC basata su CD1D può essere utilizzata per espandere ed attivare efficacemente le cellule T NK umane primarie seguendo questa procedura. Altri metodi, come la QPCR, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali siano la cinetica dell'attivazione delle cellule T NK dopo il loro sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'epatologia per esplorare il ruolo delle cellule NKT nella steatosi epatica.