Name: Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Scopri come espandere le cellule NKT umane utilizzando cellule artificiali presentanti l'antigene (aAPC) basate su CD1d. Questo metodo standardizzato offre risultati riproducibili per studi di immunoterapia.

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Gli autori desiderano ringraziare Priyanka Subrahmanyam per le discussioni utili. Gli autori non hanno concorrenti interesse finanziario. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, P30 e immunologia dei tumori e Programma di Immunoterapia TJ Webb. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.

1. Generazione di AAPC <ol><li> Prima di aggiungere proteine ​​di perle, preparare tutti i reagenti e tamponi: tampone borato 0,1 M; 1X D-PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +); (azide 1X PBS + 5% siero umano AB + di sodio 0,02%), il tampone di lavaggio perlina ; terreno completo (medium RPMI 100 mM piruvato di sodio, 10 mM non essenziali soluzione di vitamine, 100 mM MEM soluzione Vitamina, 1% di 2-mercaptoetanolo, 10 mM ciprofloxacina, 5% di siero umano AB); tampone MACS (1 L PBS libera di Ca 2 + e Mg 2 +, 5 g BSA, e 2 mmol EDTA). </li><li> Sciacquare 1 ml Dynabeads M-450 perle di resina epossidica con 3 ml di soluzione salina 0,1 M tampone borato (acido borico e acqua, pH 7,0-7,4) in un flaconcino da 5 ml in vetro borosilicato trasparente filettata. </li><li> In un altro tubo 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 100 mg hCD1d Ig-dimero e 20 molecole co-stimolatorie mcg (esempio: anti-CD28mAb) a 1 ml di PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Luogo perla fiala di vetro contenente il magnete e tampone borato aspirato da perline. Aggiungete il composto di proteine ​​da 1,2 a passo flacone di vetro e sostituire il tappo. Mescolare subito capovolgendo il flacone, coprire il tappo con parafilm, e posto su un mixer e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno successivo, il flacone di vetro posto sul magnete e rimuovere miscela proteica, evitando accuratamente perline. Lavare le perline aggiungendo 3 ml tallone tampone di lavaggio (PBS con 5% di siero AB sodio azide 0,02%), e incubando a 4 ° C su un agitatore per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Perline possono essere memorizzati in questa miscela di lavaggio tallone. Per rendere AAPC funzionale, rimuovere una piccola aliquota e contare le perline utilizzando un emocitometro. Controllare che le proteine ​​sono stabilmente caricati i beads di colorazione con anticorpi (es. PE-coniugato anti-topo IgG1) ed eseguendo analisi citofluorimetrica. </li><li> Per caricare le perline con l&#39;antigene, togliere 5 x 10 7 perline, e aggiungere un piccolo flaconcino di 1,5 ml in vetro, perle di sciacquare con 1 ml di PBS sterile. Resuspend perle lavato con 1 ml di PBS sterile e aggiungere l&#39;antigene; esempio: carico con α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Nota: Anche se, non abbiamo rilevato alcun problema con solubilità lipidica e la formazione di micelle, i lipidi devono essere trattati secondo le raccomandazioni del fabbricante. Specificamente, KRN7000 è stato ricostituito in DMSO (1mg/ml) per questi studi. KRN7000 e altri antigeni glicolipidi possono anche essere sciolto in 0,2 mg / ml di PBS contenente 0,5% Tween-20 (sonicare 2 hr. A 37 ° C). IMPORTANTE-La AAPC devono essere caricati per almeno 48-72 ore prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Isolamento di CD161 + cellule CD3 + <ol><li> Raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per la separazione di densità centrifugazione su gradiente Ficoll di linfociti da un buffy coat o pacco leucoferesi, prima diluire sangue eparinizzato con un volume uguale di 1X PBS a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 15 ml di Ficoll (riscaldata a temperatura ambiente) a 50 ml provette coniche. Lentamente overlay25 ml della miscela sangue diluito in cima al Ficoll. Centrifugare a 2000 rpm per 30 min a temperatura ambiente con il freno. </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;interfaccia di linfociti (anello bianco tra la media e Ficoll) con una pipetta Pasteur e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Lavare le cellule con il riempimento del tubo di 50 ml con PBS e centrifugazione a 1500 rpm per 5 min. Eliminare il supernatante e combinare i tubi da un unico individuo ad un unico tubo e lavare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di nuovo con 20 ml di PBS. Poi conta il PBMC e risospendere ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule / ml in tampone MACS (1 L PBS privo di Ca 2 + e Mg 2 +, 5 mmol g BSA, e 2 EDTA). </li><li> Per isolare la frazione di cellule T, iniziare con 2 ml di PBMC (10 8 cellule) e aggiungere 100 ml di soluzione Pan arricchimento delle cellule T dal Kit EasySep arricchimento umano cellule T. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li&gt; <li> Aggiungere 100 pl di particelle magnetiche alla soluzione e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Portare il volume finale di 2,5 ml di solvente e inserire il tubo nel magnete viola per 5 min. Velocemente versare l &#39;CD3 + frazione in una provetta da 15 ml conica. </li><li> Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 5 ml di tampone freddo MACS, contare il numero di cellule vitali, e prelevare un&#39;aliquota per la colorazione FACS. </li><li> Per selezionare le cellule CD161 +, in primo luogo arricchiti risospendere le cellule T nel 980 microlitri tampone ghiacciata MACS, aggiungere 10 mg contro CD161 mAb, e incubare in frigo per 10 minuti. </li><li> Centrifugare le cellule a 1500 rpm a 4 ° C per 5 min. Poi ricostituire il pellet di cellule in 800 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 200 pl di anti-topo IgG1 microperline e incubare la soluzione per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante questa fase di incubazione, equilibrare una colonna LS aggiungendo 3 ml tampone MACS. </li><li> Successivamente, lavare le cellule per centrifugazione 1500 rpm a 4 ° C per 5 min. Resutrascorrere le cellule in 3 ml di tampone MACS. Pipettare quindi le celle nella colonna LS MACS separazione. Assicurati di evitare di generare bolle pipettando lentamente. Lavare la colonna con l&#39;aggiunta di 3 ml di tampone MACS. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone fresco MACS e rimuovere colonne da magnete. Colonna Inserire in una provetta da 15 ml conica. Inserire il pistone e spingere fuori il contenuto per ottenere purificate CD161 + cellule CD3 +. Conteggio delle cellule NKT arricchito frazione. Si dovrebbe avere 2-4 milioni di cellule. </li></ol> 3. AAPC mediata da cellule NKT di espansione <ol><li> Impostare co-coltura con l&#39;aggiunta di 10 6 arricchiti CD161 + CD3 + cellule T e 10 6 AAPC in 16 ml di mezzo completo (completo medie + IL-2, 100 U / ml). Piatto questa miscela con l&#39;aggiunta di 160 microlitri / pozzetto volume finale di un ben 96 tessuto-cultura polistirene trattate, U-piastra di fondo a bassa evaporazione coperchio. Eseguire scambio media ogni giorno 7 ° con l&#39;aggiunta di 80 ml ​​di mezzo fresco. </li><li> Raccoltocellule, contare ed eseguire colorazione FACS il giorno 12-14. </li><li> Le cellule NKT espanse possono essere saltuariamente come descritto sopra nella fase 3.1, specificamente risospendere 10 6 cellule T espanse e 10 6 AAPC in 16 ml di mezzo completo. Piastra questa miscela aggiungendo 160 pl / pozzetto di una ben 96 U-piastra inferiore. Continuare a rinfrescare medio co-coltura ogni giorno 7 ° con l&#39;aggiunta di 80 ml ​​di mezzo fresco. </li><li> Si consiglia di congelare le cellule NKT supplementari dopo il secondo turno di espansione (1 x10 6 / provetta Microbank ™ in 1 ml di DMSO-5% / 95% FBS.) </li></ol> 4. Test funzionale: AAPC-mediata stimolazione delle cellule NKT <ol><li> Impostare 5x10 4 cellule NKT / bene con 5x10 5 AAPC in 200 microlitri di volume finale (terreno completo) in 96 e U-piastra inferiore. </li><li> Harvest supernatante di coltura cellulare per ELISA dopo 24-48 ore. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

AAPC possono essere utilizzati per studiare i requisiti di base per l&#39;attivazione delle cellule NKT e ha il potenziale valore clinico per l&#39;espansione ex vivo di cellule NKT per immunoterapia adottiva. Mescher et al. Descritto uno dei primi sistemi basati tallone, dove murino biotinilato classe MHC-peptide-singoli costrutti catena sono stati combinati con molecole costimolatorie biotinilati B7.1 e B7.2 tramite streptavidina alla superficie delle microsfere lattice 14, 15. Questo approccio è stato utilizzato con successo per stimolare cellule T antigene-specifiche di topi transgenici. Inoltre, poiché questo approccio utilizza una singola catena MHC-peptide per garantire loading omogenea delle molecole MHC, ciascun antigene peptide desiderato richiederebbe una nuova trasfezione per l&#39;espressione della singola catena desiderata MHC-peptide, limitando così la generalità di approccio. È importante sottolineare che il gruppo del Dr. Schneck ha aperto la strada al tallone based-AAPC, attraverso lo sviluppo di un altro non cellulare AAPC tallone base, Realizzato accoppiando HLA-Ig, segnale 1, e anti-CD28, segnale 2, su biglie magnetiche. HLA-Ig, una forma unica multimerica di HLA fusa ad una immunoglobulina patibolo molecolare 16, 17 è stata sviluppata dal suo gruppo. Successivamente, hanno sviluppato MHC-Ig basata AAPC, che hanno dimostrato di espandere efficacemente CMV e MART-1 specifica CTL 18. Qui, abbiamo dimostrato che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per espandere cellule NKT funzionali. Uno studio ha utilizzato un sistema simile per esaminare l&#39;interazione fisica delle cellule NK con CD1d 19. In particolare, abbiamo progettato una cellula artificiale presentanti l&#39;antigene che è adattabile a qualsiasi esigenza troviamo necessaria per ottimizzare la proliferazione delle cellule NKT. Il metodo di espansione AAPC fornisce un metodo semplice e affidabile per estendere e arricchire cellule NKT. Il nostro AAPC può essere modificato per valutare sistematicamente il ruolo di un gruppo di molecole di costimolazione potenziali e valutare il loro ruolo sulla proliferazione delle cellule NKTzione e la funzione. Così, AAPC rappresentano una tecnologia robusta versatile utile per l&#39;induzione e l&#39;espansione delle cellule NKT. La generazione di aAPCs richiede meno di una settimana ed è adatto per la produzione di grandi quantità di perle. Tuttavia, un passo critico nel generare il AAPC è confermare che CD1d-Ig è stabilmente immobilizzato sulla superficie delle perle e valutare la loro funzionalità di coerenza da lotto a lotto. Un limite potenziale del sistema è che non vi è un meccanismo atto a spegnere stimolazione, oltre rimozione meccanica delle perle. Specificamente, l&#39;impegno del recettore delle cellule T (TCR) con l&#39;antigene: complesso CD1d/MHC generano tipicamente sinapsi immunologica in concerto con accessori / molecole di adesione, che può provocare l&#39;induzione di fattori inibitori o soppressiva sia sulla cellula T e cellule presentanti l&#39;antigene. Nel sistema AAPC, questi fattori possono essere upregulated dalla cellula T, ma il tallone non si esprimono i ligandi congiuntiper questi recettori. Inoltre, le cellule CD4 + NKT hanno dimostrato di sopprimere le risposte antitumorali nei topi e umani, quindi è possibile che l&#39;attivazione non selettivo di tutte le cellule NKT stimolazione (cioè globale con α-GalCer) o attivazione del sottoinsieme errato potrebbe provocare indesiderati immunologica risultati. Di conseguenza, si deve fenotipicamente e funzionalmente caratterizzano la AAPC espanso popolazione di cellule NKT. Come mostrato in figura 4, abbiamo trovato che la stimolazione con α-GalCer-loaded AAPC esprimere anti-CD28 può provocare cellule NKT producono Th1, Th2 e citochine di tipo Th17. Studi murini hanno riportato che sfida con IL-33, una citochina recentemente identificato, portato a un aumento dei livelli circolanti di citochine infiammatorie come IL-5 e IL-13. Trattamento di cellule NKT con IL-33 potenziato la loro produzione di citochine 20. IL-33 è un ligando specifico per ST2 ed è stato dimostrato che ST2 solubile can blocchi IL-33 di segnalazione. Quindi, come esempio di una futura applicazione, ST2 AAPC esprimendo potrebbe essere generato e utilizzato per determinare se si potesse inibire selettivamente la produzione di citochine Th2 mentre induce secrezione di citochine da Th1 cellule NKT. E &#39;stato anche riportato che l&#39;iniezione iv di Kb-AAPC esprimere in topi C57BL / 6 provocato metastasi polmonari ridotte del tumore 21. Importante, questi dati dimostrano che il traffico AAPC al polmone e sono in grado di attivare cellule T effettrici sottoinsiemi. Pertanto, si potrebbe generare diversi tipi di AAPC ed esaminare l&#39;interazione tra sottopopolazioni di cellule T antigene specifiche. Per riassumere, questi studi dimostrano che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per sostituire normale APC cellulare, e hanno il potenziale per migliorare attuali approcci clinici per cellule NKT based-immunoterapia adottiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep umano delle cellule T Kit di arricchimento </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Alloficocianina CD161 umano mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo IgG1 Microsfere </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimero XI ricombinante solubile dimerica mouse CD1d: proteina di fusione IG </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 epossidiche perline </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamina Soluzione </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacina </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE contro topo IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-topo IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, no calcio, magnesio no </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Siero umano AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo Rotator Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml in polistirolo a fondo tondo tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Vial in vetro con tappo </td><td> Fisher Scientific </td><td> Piccolo (03-343-6A) Grande (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

antigen presenting artificiale cellulare (aapc) attivazione mediata ed espansione delle cellule natural killer t

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cellule sono un sottogruppo di cellule T che visualizzano marcatori caratteristici di entrambi natural killer (NK) e le cellule T 1. Diversamente classici cellule T, cellule NKT riconoscono antigeni lipidi nel contesto di molecole CD1 2. Cellule NKT esprimere un riarrangiamento catena invariante TCRα: Vα14Jα18 in topi e Vα24Jα18 nell&#39;uomo, che è associata con catene Vβ limitata diversità di 3-6, e sono indicati come canoniche o invarianti NKT (i NKT) cellule. Simile a cellule T convenzionali, cellule NKT sviluppano da cellule precursori CD4-CD8-T timici seguendo la segnalazione appropriata CD1d 7. Il potenziale di utilizzare cellule NKT per scopi terapeutici è aumentato significativamente la capacità di stimolare ed espandere cellule NKT con α-Galactosylceramide (α-GalCer) e una varietà di citochine 8. È importante sottolineare che queste cellule mantenuto il loro originale phenotype, citochine secrete e visualizzata funzione citotossica contro linee cellulari tumorali. Così, espanse ex vivo cellule NKT rimanere funzionale e può essere utilizzato per l&#39;immunoterapia adottiva. Tuttavia, cellule NKT based-immunoterapia è stato limitato con l&#39;uso di cellule che presentano l&#39;antigene autologhe e la quantità e la qualità di queste cellule stimolatrici può variare sostanzialmente. DC derivate da monociti di pazienti affetti da cancro sono stati segnalati per esprimere livelli ridotti di molecole costimolatorie e producono citochine infiammatorie meno 9,10. Infatti, DC murine anziché APC autologhe sono stati utilizzati per testare la funzione delle cellule NKT da pazienti CML 11. Tuttavia, questo sistema può essere utilizzato solo per la sperimentazione in vitro cellule NKT poiché non può essere espansa murino DC e quindi utilizzati per l&#39;immunoterapia adottiva. Quindi, un sistema standardizzato che si basa su cellule artificiali Antigen Presenting (AAPC) potrebbe produrre gli effetti stimolanti della DC senza le insidie ​​di allo-o xenogeniche ceLLS 12, 13. Qui, si descrive un metodo per generare CD1d basata AAPC. Poiché l&#39;impegno del recettore delle cellule T (TCR) di CD1d-antigene è un requisito fondamentale di attivazione delle cellule NKT, antigene: CD1d-Ig complessi forniscono un metodo affidabile per isolare, attivare, ed espandere popolazioni di cellule effettrici NKT.

Qui si descrive un metodo per generare CD1d-Ig basata AAPC, realizzato mediante accoppiamento covalente di CD1d-Ig e anti-CD28 mAb a perline magnetiche per stimolare le cellule NKT come metodo standardizzato per la propagazione delle cellule NKT (Figura 1). Primo, uno deve dimostrare che i CD1d-Ig proteine ​​di fusione sono stabilmente immobilizzato sulla superficie dei granuli magnetici. Come mostrato in Figura 2A, CD1d-Ig e anticorpi anti-CD28 sono stati sia espresso sulla superficie delle perle magnetiche. Per esaminare la capacità stimolante della AAPC, noi co-coltura di cellule NKT ibridomi con AAPC surnatanti raccolti durante la notte, la cultura e le misurata produzione di IL-2 da ELISA. Abbiamo trovato che CD1d-Ig basata AAPC erano in grado di stimolare le cellule NKT ibridomi a livelli pari o superiore al corrispettivo cellulari (Figura 3, i dati non mostrati). È interessante notare che, abbiamo scoperto che il nostro mouse ibridomi di cellule NKT sono stimolati da umano CD1d basata AAPC (Figura 2B), che fornisce un metodo semplice per testare ogni lotto di AAPC. Successivamente, si è cercato di dimostrare il potenziale propagazione AAPC, quindi le cellule T umane sono state isolate da sangue periferico. In primo luogo il CD161 + CD3 + frazione di cellule T è stata arricchita da separazione magnetica tallone. Quindi, le cellule T sono state stimolate bisettimanale con α-GalCer caricato AAPC. È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che anche con un relativamente basso iniziale popolazione di cellule NKT (0,03%), siamo stati in grado di espandere le cellule a ~ 67% Vα24 Vβ11 + + (Figura 3). Abbiamo ampliato le cellule NKT dal PBMC di molti volontari sani e pazienti affetti da cancro e hanno scoperto che α-GalCer caricato AAPC stati in grado di espandere la popolazione di cellule NKT in entrambi i gruppi. In particolare, il tasso di espansione è stata molto donatore dipendente. Come previsto maggiore è la popolazione iniziale di cellule Vα24 +, maggiore è la percentuale di espansione. Inoltre,quando si utilizza una popolazione iniziale di 2 milioni di cellule CD161 + CD3 + cellule T, si può ottenere&gt; 10 7 cellule dopo due cicli di espansione (Tabella 1). Circa 80-90% delle cellule NKT espanse sono CD4 +, ~ 5% CD8 +, e le restanti sono presumibilmente negativi cellule CD4-CD8-doppie NKT. Queste cellule NKT espanse possono essere utilizzati per studi funzionali come mostrato in Figura 4A-C. Abbiamo trovato che il nostro ex vivo espanse cellule NKT continuare ad adattarsi ai α-GalCer stimolazione e sono potenti produttori di IL-17A, TNF-α e IFN-γ. Occorre notare che se la prima popolazione di cellule T arricchimento è bassa e si è in grado di eseguire la seconda fase di arricchimento CD161, il AAPC mediata espansione non può dare i risultati attesi (vedere Figura 4D, donatori 1). Tuttavia, se la percentuale di cellule circolanti NKT è superiore a 0,1%, si dovrebbe essere ancora in grado di ottenere una significativa espansionei di cellule NKT. Nel complesso, questi dati dimostrano che CD1d based-AAPC può essere utilizzato per espandere in modo efficace e stimolare cellule primarie umane NKT. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma schematico di CD1d: Ig basati aAPCs porzioni extracellulari della molecola CD1d sono fusi alla regione costante di una catena pesante di immunoglobulina proteine ​​separate da un linker breve amminoacido. Queste molecole possono essere facilmente caricate con antigeni lipidici, come α-GalCer, semplicemente mediante incubazione con un eccesso di lipidi di interesse. AAPC state realizzate con l&#39;accoppiamento CD1d-Ig e anti-CD Abs a sfere magnetiche. In questo sistema, CD1d-Ig viene utilizzato per fornire l&#39;affine antigene-specifico segnale attraverso il TCR e anti-CD28 mAb fornisce il segnale di costimolazione. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. . Colorazione FACS di proteine ​​di superficie su aAPCs aAPCs A) sono stati testati per la presenza di CD1d: IgG dimero (tramite colorazione con PE-coniugato anti-topo IgG1) e anticorpo anti-CD28 (con FITC-coniugato anti-topo IgG2a) istogrammi. aperti indicano controllo isotipico; istogrammi pieni rappresentano gli anticorpi indicati. CD1d-Ig Esprimere AAPC possono stimolare produzione di IL-2 da parte delle cellule NKT. B) Il + Vα14 topo NKT cellulare di ibridomi, DN32.D3, è stato co-coltivate sia con media, antigene solubile (α-GalCer), scaricate AAPC o α-GalCer caricato AAPC. Supernatanti di coltura sono stati raccolti e standard sandwich ELISA è stato utilizzato per misurare la produzione di IL-2. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figura 3. Espansione delle cellule NKT da cellule rivestite CD1d-antigene artificiali presentano. (A) primario CD3 + CD161 + doppie cellule positive sono state isolate da PBMC mediante separazione magnetica. Le cellule sono state stimolate con filtrate α-GalCer caricato, CD1d-Ig AAPC rivestito per 14 giorni. Le cellule sono state colorate per Vα24 e Vβ11 seguito di stimolazione AAPC. (B) Primary cellula umana NKT mediato lisi di una linea di linfoma a cellule B. C1R-CD1d cellule incubate con cellule NKT ai rapporti indicati in presenza o assenza di antigene, un GalCer (100 ng / ml) a 96 pozzetti con fondo a U piastre per 20-24 hr. Lisi delle cellule NKT cellulo-mediata è stata valutata dalla norma 51Cr-release test. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figura 4. Profili delle citochine di AAPC-espanse cellule NKT. </strong&gt; Dopo stimolazione con α GalCer caricato AAPC per due settimane, le cellule NKT espanse (1 × 10 5 / pozzetto) sono state co-coltivate con α-solubile GalCer, PMA / ionomicina, anti-CD3/28 microperle, o α-GalCer loaded AAPC (2 × 10 5 / pozzetto) per 48 ore. (A) IL-17A, (B), TNF-α, e (C) IFN-γ produzione di citochine è stata misurata mediante ELISA standard. I dati indicati sono al netto della produzione di citochine dopo aver sottratto i controlli negativi (media e perle vuote). (D) cellule T primarie sono state isolate da PBMC mediante separazione magnetica tallone. Le cellule sono state stimolate filtrate per due settimane con l&#39;indicazione a-GalCer caricato-AAPC. Le cellule sono state colorate usando Abs specifici per Vα24 + e + Vβ11 ed analizzate al citofluorimetro.

Qui si descrive un metodo per l&#39;attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L&#39;uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Le cellule Natural Killer T (NKT) sono un sottoinsieme unico di cellule T che presentano marker caratteristici sia delle cellule natural killer (NK) che delle cellule T1. A differenza di...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule presentanti l'antigene artificiali CD1D, o AAPC, per l'espansione delle cellule NKT. Questo risultato si ottiene innanzitutto aggiungendo proteine per funzionalizzare le microsfere magnetiche. Nel secondo passaggio, la popolazione iniziale di cellule NKT proveniente dal sangue periferico viene arricchita.Successivamente, le cellule T arricchite vengono coltivate in co-coltura con le APC. Nell'ultimo passaggio, vengono valutati il fenotipo e la funzione della popolazione cellulare APC. Infine, la purezza dei sottoinsiemi di cellule T espanse può essere determinata mediante analisi citofluorimetrica. Il vantaggio principale delle APC rispetto ai metodi attuali che utilizzano cellule dendritiche è che le cellule dendritiche possono presentare un'elevata variabilità tra donatori.Le APC forniscono un metodo standardizzato, riproducibile e disponibile prontamente per l'espansione delle cellule T NK. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando lavoravo con il dottor Schneck e Oaky presso la Johns Hopkins. Essi hanno aperto la strada nel campo dell'utilizzo di complessi artificiali di presentazione dell'antigene per l'espansione di sottopopolazioni classiche di cellule T CD8.La procedura sarà dimostrata dal dottor James East, ricercatore postdottorando, e dal figlio della dottoressa Wendy. Un associato di ricerca del mio laboratorio inizia trasferendo un millilitro di perle Dyna Bead M-450 con rivestimento in epossido in un vial in vetro borosilicato trasparente da cinque millilitri con filettatura. Successivamente, lavare le perle con tre millilitri di buffer Bore 8 sterile in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 millilitri.Aggiungere 100 microgrammi di dimero umano CD1D-Ig e 20 microgrammi delle molecole co-stimolatorie desiderate a un millilitro di PBS privo di calcio e magnesio. Successivamente, posizionare il flaconcino di vetro contenente le perle su un magnete ed aspirare il tampone borato. Quindi aggiungere la miscela proteica al flaconcino di vetro e riposizionare il tappo.Mescolare immediatamente la soluzione capovolgendo la provetta, quindi coprire il tappo con parafilm e posizionarla su un agitatore rotante durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, posizionare nuovamente la provetta di vetro sul magnete ed eliminare con attenzione la miscela proteica evitando le perle. Lavare le perle tre volte aggiungendo tre millilitri di tampone per il lavaggio delle perle e incubandole sull’agitatore rotante a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Per confermare che le proteine siano state caricate stabilmente sulle perle, colorare un'aliquote delle perle con anticorpi e analizzarle mediante analisi citofluorimetrica. Ora trasferire cinque volte 10 alla settima perle in una piccola provetta di vetro da 1,5 millilitri e lavare le perle con un millilitro di PBS sterile. Quindi 48-72 ore prima dell'uso.Caricare le perle lavate con l'antigene in un millilitro di PBS sterile mentre le perle vengono caricate con l'antigene. Raccogliere i PBMC diluendo prima il sangue del donatore eparinizzato con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 15 millilitri di PHI a temperatura ambiente, trasferire in provette coniche da 50 millilitri e sovrapporre lentamente 25 millilitri della miscela di sangue diluito sopra il PHI.Chiamare quindi dopo aver centrifugato i campioni per 30 minuti a 700 ×g e a temperatura ambiente con la frenata disattivata. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire con attenzione l'interfaccia dei linfociti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, lavare i linfociti con 50 millilitri di PBS, scartando il sopranatante e combinando i tubi provenienti da un singolo donatore in un unico tubo.Dopo aver lavato nuovamente i PBMC con 20 millilitri di PBS, contare le cellule e quindi sospenderle a una concentrazione di cinque per 10 alla settima cellule per millilitro in buffer max. Per isolare la frazione di linfociti T, incubare 100 microlitri di soluzione di arricchimento PAN per linfociti T del kit di arricchimento per linfociti T umani EP con due millilitri di PBMC per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, incubare la soluzione con 100 microlitri di microsferette magnetiche a temperatura ambiente per altri 10 minuti.Portare il volume finale del solvente a 2,5 millilitri, quindi posizionare il tubo sul magnete. Dopo cinque minuti, versare rapidamente la frazione CD3 positiva in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare ora le cellule con 5 millilitri di buffer Max freddo e contare le cellule vitali.Prelevare un'aliquote per la colorazione degli antigeni di superficie per selezionare prima le cellule CD161 positive. Risospendere le cellule T arricchite in 980 microlitri di buffer MAX freddo di ghiaccio, quindi incubare le cellule con 10 microgrammi di anticorpo monoclonale anti-CD161 per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule, risospendere il pellet in 800 microlitri di buffer MAX e 200 microlitri di microsferette di anti-IgG di topo.Incubare questa soluzione a quattro gradi Celsius per altri 10 minuti. Mentre le cellule sono in incubazione con le microperle, aggiungere tre millilitri di buffer max per equilibrare una colonna LS. Dopo aver lavato questa frazione cellulare, pipettare lentamente le cellule in tre millilitri di buffer max all'interno della colonna.Ora lavare la colonna tre volte con tre millilitri di buffer max fresco. Quindi aggiungere altri tre millilitri di buffer max fresco alla colonna e trasferire la colonna in un tubo conico da 15 millilitri. Eluire le cellule CD161 positive e CD3 positive purificate, quindi contare la frazione arricchita in cellule NKT.Iniziare questo passaggio co-coltivando da 10 alla sesta cellule T CD161 positive e CD3 positive arricchite e 10 alla sesta cellule A APC in 16 millilitri di mezzo completo in una piastra. Trasferire 160 microlitri per pozzetto della co-coltura in una piastra in polistirene trattata per colture cellulari, a fondo rotondo, da 96 pozzetti, con coperchio a bassa evaporazione. Al giorno 12-14, raccogliere e contare le cellule. Analizzare le popolazioni mediante analisi citofluorimetrica, quindi ripiantare e proseguire la co-coltura.I linfociti NKT espansi, come appena dimostrato, congelano i linfociti NKT aggiuntivi dopo il secondo ciclo di espansione. Per verificare la funzionalità delle cellule A A PC, effettuare innanzitutto una co-coltura di cinque volte 10 alla quarta cellule NKT per pozzetto con cinque volte 10 alla quinta cellule A A PC, in un volume finale di 200 microlitri di mezzo completo, in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo. Dopo 24-48 ore, raccogliere il sopranatante della coltura cellulare per l'analisi mediante Elisa. Questa prima figura dimostra che le proteine CD 1D IG sono stabilmente immobilizzate sulla superficie delle microsferette magnetiche, come mostrato qui.Gli anticorpi CD1D-Ig e anti-CD28 sono entrambi espressi sulla superficie delle microsfere magnetiche, come dimostrato in questo grafico. L'ibridoma di cellule T NK del topo V alpha 14 positivo DN3A2-D3 è stato coltivato in co-coltura con antigene alpha-galactosilceramide solubile in mezzo, APC A20 non cariche o APC A20 cariche con alpha-gal. I supernatanti di coltura sono stati quindi raccolti e la produzione di IL-2 è stata misurata mediante ELISA, fornendo un metodo semplice per testare ogni lotto di cellule presentanti l'antigene. In questo esperimento, le cellule T del sangue periferico umane CD161 positive e CD3 positive sono state arricchite mediante separazione con microsfere magnetiche.Le cellule sono state quindi stimolate una volta alla settimana per 14 giorni con APC caricate con alfa-galattosilceramide e analizzate per l'espressione di V alfa 24 e V beta 11. È importante notare che, anche con una popolazione iniziale relativamente bassa di cellule NKT pari allo 0,03%, è stato possibile espandere le cellule fino a raggiungere circa il 67% di popolazione positiva per V alfa 24 e positiva per V beta 11. In questo caso, cellule C1R CD1D sono state incubate con cellule NKT nei rapporti indicati in presenza o assenza dell'antigene Alpha GalCer, in piastre a 96 pozzetti con fondo a U, per un periodo di 20-24 ore.La lisi cellulare mediata da cellule NKT della linea di linfoma B è stata quindi valutata mediante saggio di rilascio del cromo. Le cellule NKT espanse in PC sono state in grado di lisare questa linea cellulare di linfoma. In presenza o assenza di alfa-galactosylceramide, le cellule NKT sono state espanse dai PBMC sia di volontari sani che di pazienti oncologici, e caricate con alfa-galactosylceramide.Un PC A è stato in grado di espandere le popolazioni di cellule NKT da entrambi i gruppi. Partendo da una popolazione di 2 milioni di cellule T CD161 positive e CD3 positive, è possibile ottenere più di 10 alla settima potenza di cellule dopo due cicli di espansione. Le cellule NKT possono essere utilizzate per studi funzionali, come dimostrato in questo caso.I linfociti NKT espansi ex vivo rimangono sensibili alla stimolazione con Alpha GAL e sono i nostri produttori potenti di IL-17A, TNF-alfa e interferone gamma. Va notato che se la popolazione iniziale di linfociti T arricchita è bassa e il secondo passaggio di arricchimento per CD161 non può essere eseguito, l'espansione mediata da A APC potrebbe non produrre i risultati previsti. Tuttavia, se la percentuale di linfociti NKT circolanti è superiore allo 0,1%, dovrebbe comunque essere possibile ottenere un'espansione significativa dei linfociti NKT invarianti.Nel complesso, questi dati dimostrano che l'AA PC basata su CD1D può essere utilizzata per espandere ed attivare efficacemente linfociti NKT umani primari seguendo questa procedura. Altri metodi, come la QPCR, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali siano la cinetica dell'attivazione dei linfociti NKT dopo il loro sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'epatologia per esplorare il ruolo delle cellule NKT nella malattia del fegato grasso.

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