Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in Drosophila Le larve

Lo scopo di questa procedura è analizzare le funzioni cerebrali superiori. In un modello semplice, larva DFA per mezzo dell'appetito, apprendimento olfattivo associativo. Ciò si ottiene raccogliendo prima 30, nutrendo le larve del terzo stadio da una fiala di cibo.

Successivamente, le larve vengono addestrate per cinque minuti su una capsula di Petri con fruttosio come ricompensa e un contenitore di odori su ciascun lato che contiene un ottale come stimolo olfattivo. Quindi viene eseguita una seconda fase di allenamento di cinque minuti su un piatto senza il premio di fruttosio e con contenitori di odore su ciascun lato che contengono acetato di Amal. Dopo tre ripetizioni delle due fasi di addestramento, le larve vengono esposte a contenitori di odori su lati opposti per un test di cinque minuti senza ricompensa.

In definitiva, la preferenza relativa per l'odore di un ottale rispetto all'acetato di Amal indica che le larve di drosophila possono formare un'associazione tra stimoli olfattivi e ricompensa dello zucchero, e questo può essere utilizzato per studiare l'apprendimento associativo in un sistema geneticamente flessibile. Questo metodo, in combinazione con l'interferenza genetica della funzione neurale, può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'apprendimento e della memoria, come ad esempio quali sono i neuroni che segnalano la ricompensa, o quali sono i neuroni necessari o sufficienti per l'acquisizione o il recupero di una memoria ripetitiva? Dimostrare la procedura sarà anti a postop.

Uno studente di dottorato del mio laboratorio prepara prima piastre di Petri al 2,5% di aros senza fruttosio. Per preparare i piatti a base di fruttosio, aggiungere il fruttosio agli aros sciolti e poi versarlo nel piatto. Quindi, etichetta ciascuno di questi piatti con un simbolo diverso che accecherà lo sperimentatore.

Il piatto contenente fruttosio è la ricompensa condizionante, e il piatto semplice è la non-ricompensa. Per gli stimoli della condizione, preparare un totale di tre contenitori per odori in teflon personalizzati con 10 microlitri di puro un ottale. I coperchi hanno piccoli fori per consentire l'evaporazione dell'odore.

In secondo luogo, prepara altri tre contenitori per odori con 10 microlitri di acetato di amile diluito da uno a 50 in olio di paraffina. Questa diluizione è attraente quanto i 10 microlitri di puro un ottale iniziano raccogliendone 30, nutrendosi, non vagando. Terzo in da una fiala di cibo.

Questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento della giornata. È indipendente dai ritmi circadiani. Trasferisci la lava in una capsula di Petri che contiene alcune gocce di acqua del rubinetto e muovile con cautela avanti e indietro con una spazzola.

Quindi trasferisci la lava in una seconda capsula di Petri che contiene anche alcune gocce di acqua del rubinetto. Ispeziona le larve per verificare la presenza di pasta alimentare sulle pareti del corpo. Ora posiziona la capsula di Petri nella configurazione sperimentale per addestrare le larve ad associare gli odori a una particolare coda di zucchero.

Metti un contenitore per gli odori sul lato sinistro e sul lato destro di uno dei due tipi di piatto utilizzati dagli stimoli. Qui c'è un ottale, ma la scelta è arbitraria poiché lo sperimentatore è cieco alla ricompensa. Quindi posiziona il gruppo di queste larve al centro del piatto.

Chiudi il coperchio e attendi cinque minuti mentre gli animali sono esposti agli stimoli. Assicurati che le larve possano superare la tensione superficiale della goccia d'acqua in modo che non rimangano intrappolate e possano esplorare. Liberamente. Metti un nuovo contenitore di acetato di Amal su una capsula di Petri fresca.

Dopo cinque minuti, utilizzare un umido e un pennello per trasferire la lava sul tipo opposto di piatto con gli stimoli opposti situati sul lato sinistro e destro. Quindi l'odore qui è acetato di amal. Una volta trasferite le larve, chiudi il coperchio e lascia che gli animali esplorino per cinque minuti.

Allo scadere di questo tempo, il primo ciclo di formazione è stato completato. Esegui altri due cicli di allenamento allo stesso modo del primo. Trasferire gli animali con un umido e spazzolare ed esporli a ogni stimolo e combinazione di ricompensa tre volte in totale.

Per il luogo di prova sperimentale, contenitori di odori freschi, uno di ogni stimolo su siti opposti di una piastra di Petri solo agros non rivestita. Trasferisci gli animali addestrati al centro del piatto. Chiudi il coperchio e attendi cinque minuti.

Dopo cinque minuti, usa una sagoma sotto il piatto che definisca chiaramente tre zone del piatto a sinistra, a destra, un conteggio centrale del numero di larve in ciascuna zona. La zona centrale è un punteggio di non preferenza e rende l'analisi più restrittiva e meno soggetta a bias. Infine, per completare l'esperimento, seleziona 30 nuovi terzi nel personale che nutrono la lava e ripeti l'addestramento e il test con la combinazione opposta di ricompensa e stimoli.

Continua a utilizzare gli stessi contenitori per gli odori. Sono necessari diversi test di controllo per determinare se gli animali transgenici hanno una normale elaborazione degli odori per gli stimoli di ricompensa. Il test per la preferenza olfattiva naïve inizia con la raccolta e il lavaggio di 30 larve come fatto per l'addestramento e il test.

Quindi, caricare le larve su una capsula di Petri agro rose con una sola fiala di stimoli su un lato. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti. Successivamente, utilizzando il modello, conta il numero di larve sul lato vicino, al centro e sul lato opposto del piatto rispetto agli stimoli.

Esegui questo test per ogni stimolo utilizzato nell'esperimento per verificare la preferenza naïve per lo zucchero. Preparare metà e metà piastre di Petri ritagliando metà degli agro di una pirofila e riempiendo lo spazio vuoto con agro fusi dell'altro tipo. Fare attenzione che entrambe le metà corrispondano in volume e non formino un bordo definito.

Ciò può richiedere la pratica con il mezzo mezzo piatto preparato e a temperatura ambiente, posto 30 naïve, pulito dall'alimentazione. Terzo nelle larve stellate al centro del piatto. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti.

Successivamente, utilizzando il modello, conta il numero di larve su entrambi i lati e conta quelle al centro. La procedura descritta è stata utilizzata per addestrare e testare la lava di trincea. Utilizzando gli stimoli di esempio, i dati sono stati conteggiati come il numero di larve in diverse regioni delle piastre di Petri.

Dopo cinque minuti da questa preferenza di dati, sono stati calcolati gli indici e sono stati derivati gli indici di performance dai gruppi reciprocamente formati. Poiché le lava testate erano transgeniche, è stata offerta anche la scelta tra un contenitore di odori pieno e aria, nonché una scelta tra aros puro e aros più uno zucchero. Un esame degli indici calcolati nel box plot ha rivelato che gli animali sono stati in grado di imparare a distinguere un acetato ottale da quello di ML utilizzando l'agros di fruttosio come rinforzo.

Gli animali hanno riconosciuto entrambi gli stimoli come attrattivi e hanno mostrato una preferenza ingenua per il fruttosio o l'esagerazione dell'aerodinamica. Questo paradigma sperimentale è stato utilizzato con successo con un'ampia varietà di stimoli olfattivi e visivi, nonché con un'ampia varietà di stimoli gratificanti e punitivi. Questo paradigma, combinato con le molte potenti manipolazioni genetiche disponibili nella drosofila, è particolarmente utile per sezionare le reti neurali, ad esempio, manipolando geneticamente specifici gruppi di neuroni, definiti da quattro modelli di espressione gal, i ruoli funzionali di quei neuroni nell'apprendimento dell'appetito possono essere valutati.

Seguendo questa procedura, insieme all'interferenza genetica della funzione neuronale può essere utilizzato per analizzare le reti neurali del cervello larvale coinvolte nell'apprendimento e nella memoria. Grazie alla semplicità del cervello larvale, questo può essere raggiunto fino al livello di una singola cellula.