Name: Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Impara a indurre lesioni laser controllate nel muscolo scheletrico embrionale di Danio rerio per studiare i processi di rigenerazione. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione miofibrillare post-lesione tramite microscopia confocale.

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Ringraziamo Bob Nowak (Andor Technology) per assistenza e consulenza tecnica. SA-S. è sostenuto da una borsa di studio Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto da DFG concessione SE2016/7-1.

1. Etichettatura singole cellule Iniettare unicellulari embrioni allo stadio con un plasmide codificante GFP o qualsiasi proteina di fusione GFP sotto il controllo di un promotore di β-actina. Durante lo sviluppo, GFP è quindi espresso in modo mosaico. Qui, abbiamo usato il costrutto transgenico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], che pone l&#39;α-actinina-proteina di fusione GFP sotto il controllo del promotore di β-actina. 2. Embrione Embedding <ol class="lalpha"><li> Raccogliere embrioni di zebrafish e mantenere, in condizioni normali, fino al 28 HPF (stadiazione secondo a 12). </li><li> Embrioni Dechorionate allo stereomicroscopio con una pinza (Dumont # 5). </li><li> Preparare un vetrino da microscopio con un anello di vaselina. </li><li> Preparare un 1% a basso punto di fusione agarosio / 10% soluzione tricaine con mezzo E3: bollire 100 mg di agarosio in 10 ml di soluzione E3 ad ottenere un liquido omogeneo e soluzione di agarosio, aliquota e memorizzareinutilizzato soluzione di agarosio a -20 ° C per un ulteriore uso. Per l&#39;uso immediato, lasciare che la soluzione bollita raffreddare e mantenere al massimo. 39 ° C. Aggiungi soluzione madre tricaine per ottenere una concentrazione finale del 10% tricaine. Sia tricaine e agarosio sono necessari per impedire movimenti embrionali. </li><li> Incorporamento di un singolo embrione in 1% di agarosio a basso punto di fusione / 10% tricaine / E3 media all&#39;interno dell&#39;anello vaselina, con l&#39;embrione, che naturalmente sul lato, delicatamente coprire con un coprioggetto solo per mantenere l&#39;embrione in atto e per evitare un convesso superficie che avrebbe rotto la luce. Idealmente, il tessuto muscolare embrionale che saranno destinati dovrebbe toccare il coprioggetto. </li></ol> 3. Embryo Laser-ferimento <ol class="lalpha"><li> Preparare il laser Micropoint e il microscopio: <ol class="lroman"><li> Si prega di fare riferimento al manuale Micropoint laser per le istruzioni dettagliate su come impostare e utilizzare il laser in combinazione con il microscopio. </li><li> Selezionare la correttacolorante per la generazione di un fascio laser 435 nm di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Regolare la potenza del laser utilizzando il cursore attenuazione. La potenza del laser dovrebbe essere abbastanza forte per rompere una superficie di vetro con un singolo impulso (es. fuoco sul vetrino del campione per testare questa). Questa è la potenza necessaria per l&#39;ablazione laser cella. </li></ol></li><li> Concentrarsi sulla regione o cella di interesse utilizzando il reticolo installato nel oculare del microscopio. Utilizzare un obiettivo 20x (40x permetterà danni più precisa, ma spesso la distanza di lavoro non è sufficiente per questo obiettivo). </li></ol> Nota 1: Il laser non solo danneggiare le cellule all&#39;interno del piano di fuoco, ma anche celle sopra e sotto che sono entro il raggio laser. Assicurarsi prima dell&#39;esperimento che il laser sia impostato in modo ottimale e regolata per una massima attenzione ai asse z. È preferibile determinare la profondità del danno laser prima di eseguire l&#39;esperimento per sapere quale cellas esattamente saranno feriti. <ol class="lalpha" start="3"><li> Impostare la luce necessaria per visualizzare l&#39;esperimento: campo chiaro per l&#39;uso normale, il targeting o la fluorescenza se una cella fluorescente marcato. </li><li> Inviare un impulso di luce laser per la regione mirati, o più impulsi, a seconda del grado desiderato di lesioni. </li></ol> 4. Analisi della Ferita e recupero <ol class="lalpha"><li> Se desiderato, la procedura di lesioni laser possono essere registrati vivo (ad esempio utilizzando l&#39;opzione di acquisizione flusso del software Metamorph). 6 </li><li> Subito dopo il ferimento, l&#39;embrione deve essere rimosso con delicatezza dal agarosio con una pinza e rimesso in acqua uovo per il recupero. </li></ol> Nota 2: l&#39;attività muscolare (nuoto e spasmi), è particolarmente importante per il recupero del muscolo scheletrico. Poiché l&#39;embrione non può muoversi a causa dell&#39;esposizione tricaine e l&#39;incorporamento rigida agarosio, non è RACCOMAnded mantenere gli embrioni tra vetrino e coprioggetto per troppo tempo. <ol class="lalpha" start="3"><li> Dopo il recupero, l&#39;embrione può essere fissato e analizzati come desiderato dalla luce, microscopia a fluorescenza o confocale come indicato. </li></ol>

<ol><li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).</li>
<li>Steffen, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+runzel+muscular+dystrophy+is+linked+to+the+titin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene.</a> Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).</li>
<li>Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+mutants+to+identify+secondary+target+effects+of+acetylcholine+esterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors.</a> Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).</li>
<li>Otten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xirp+proteins+mark+injured+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish.</a> PLoS One. 7, e31041(2012).</li>
<li>Roostalu, U., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+somite+cell+rearrangements+lead+to+distinct+waves+of+myotome+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth.</a> Development. 134, 1253-1257 (2007).</li>
<li>Choi, W. Y., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).</li>
<li>Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+dedifferentiation+provides+replacement+tissue+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Laser-mediata lesione è un metodo efficace per infliggere ferite della dimensione desiderata da ablazione cellule per studiare la rigenerazione in condizioni controllate in zebrafish. In particolare, le cellule possono essere mirati proprio (Figura 2) e sia l&#39;area ferita e tempi può essere controllato. Successivamente, il sito di lesione e processi di rigenerazione sono facilmente controllati, registrati (Figura 3) e analizzati (Figura 1). Tuttavia, anche se il lase...

<table border="1"><tbody><tr><td> Riscaldamento del blocco </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coppia pinze # 5 </td><td> Dumont </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diapositiva su vetro </td><td> Menzel </td><td></td><td> 76 x 26 mm </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Roth </td><td></td><td> 50 x 24 mm N ° 1 </td></tr><tr><td> Vaselina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> MZFLIII </td></tr><tr><td> Micropoint laser </td><td> Andor Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Axioplan II </td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti <ul><li> Basso punto di fusione agarosio (# 50081,Lonza) </li><li> Tricaine Soluzione madre: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml di dH 2 O pH 9,0 </li><li> Media E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4) </li></ul></td></tr></tbody></table>

laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale zebrafish

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Diversi approcci sperimentali sono stati utilizzati nel topo per indurre infortunio muscolare, con l&#39;obiettivo di studiare la rigenerazione muscolare, compresi gli apporti myotoxin (bupivacaina, cardiotossina o notexin), trapianti muscolari (denervazione-devascolarizzazione rigenerazione indotta), esercizio fisico intenso, ma anche modelli murini distrofia muscolare come ad esempio il topo mdx (per una rassegna di questi approcci vedi 1). In zebrafish, approcci genetici includono mutanti che presentano fenotipi distrofia muscolare (come runzel 2 o sapje 3) e antisenso Morpholinos oligonucleotide che bloccano l&#39;espressione di geni associati alla distrofia 4. Inoltre, approcci chimici sono possibili, per esempio con Galanthamine, un composto chimico inibente acetilcolinesterasi, ottenendo in tal modo ipercontrazione, che finisce per distrofia muscolare 5. Approcci tuttavia, genetici e farmacologici generally colpire tutti i muscoli all&#39;interno di un individuo, mentre l&#39;entità delle ferite inferte fisicamente sono più facilmente controllabili spazialmente e temporalmente 1. Localizzata lesioni consente la valutazione del muscolo controlaterale come controllo interno. Infatti, abbiamo recentemente utilizzato ablazione laser-mediata delle cellule per studiare la rigenerazione del muscolo scheletrico nel zebrafish 6, mentre un altro gruppo ha recentemente riportato l&#39;uso di un laser a due fotoni (822 nm) per danneggiare molto localmente la membrana plasmatica di singoli muscoli zebrafish embrionale celle 7. Qui, si riporta un metodo per utilizzare il laser Micropoint (Andor Technology) per lesioni cellula muscolare scheletrica in zebrafish. Il laser Micropoint è un laser ad alta energia che è adatto per l&#39;ablazione cellula bersaglio alla lunghezza d&#39;onda di 435 nm. Il laser viene collegato ad un microscopio (nel nostro setup, un microscopio ottico Zeiss da) in modo tale che il microscopio può essere utilizzato al tempo stesso fo focalizzare la luce laser sul campione e per visualizzare gli effetti della ferita (campo chiaro o fluorescenza). I parametri per controllare gli impulsi laser comprendono lunghezza d&#39;onda, intensità e numero di impulsi. Grazie alla sua trasparenza ed esterna sviluppo embrionale, l&#39;embrione di zebrafish è altamente suscettibile sia indotta da laser pregiudizio e per lo studio del successivo recupero. Tra 1 e 2 giorni dopo la fecondazione, somitic cellule muscolari scheletriche progressivamente maturano da anteriore a posteriore a causa della progressione della somitogenesis dal tronco alla coda 8, 9. In queste fasi, embrioni spontaneamente twitch e avviare il nuoto. Il pesce zebra è stata recentemente riconosciuta come un importante organismo modello vertebrato per lo studio della rigenerazione dei tessuti, come molti tipi di tessuti (cardiache, neuronale, vascolare ecc) possono essere rigenerati dopo lesione nell&#39;adulto zebrafish 10, 11.

Lesioni laser-mediata è stata eseguita su immobilizzati 1 giorno di età embrioni. Come mostrato in figura 1, un paio di impulsi laser può generare una ferita piccola, facilmente riconoscibili dai danneggiati, arrotolati, Actina ricchi miofibrille che sono normalmente tese tra i confini somite. Un più alto numero di impulsi laser sarà comunque comportare un blocco somite massicciamente danneggiato, dove vengono distrutti maggior miofibrille. Tuttavia, si può osservare che letteralmente &quot;il tempo gua...

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Sono stati utilizzati vari approcci sperimentali nel topo per indurre lesioni muscolari allo scopo di studiare la rigenerazione muscolare, tra cui le iniezioni di miotossina...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un danno precisamente controllato al muscolo scheletrico embrionale del pesce zebra al fine di studiare i processi di rigenerazione muscolare. Questo viene ottenuto innanzitutto etichettando geneticamente singole cellule del muscolo scheletrico in modo mosaicale. Successivamente, gli embrioni selezionati vengono inclusi in agarosio contenente trica su un vetrino.Successivamente, gli embrioni vengono posizionati sotto il microscopio e le cellule muscolari bersaglio vengono danneggiate mediante un laser a micro punto. Infine, gli embrioni vengono rimossi dagli agros e lasciati riprendere per periodi di tempo definiti. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano modifiche nell'organizzazione dei miofibrilli attraverso il danno indotto dal laser seguito da microscopia confocale.Il metodo che presentiamo oggi è rilevante per il campo della rigenerazione muscolare, ma può essere applicato anche ad altri paradigmi di rigenerazione, come la rigenerazione della pinna e dei pesci zebra. Per etichettare le cellule, si iniettano embrioni allo stadio monocellulare con un plasmide che codifica per GFP o qualsiasi proteina fusione G

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Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle...

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Questo video descrive il metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish utilizzando l'assotomia laser a due fotoni e osservando il recupero assonale da una lesione.

Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death utilizzando la microscopia confocale laser UV convenzionale. J. Vis. Exp. (2017) In questo video, esploriamo la tecnica dell'ablazione laser UV ad alta intensità per indirizzare e studiare con precisione i singoli neuroni nel pesce zebra transgenico. Dimostriamo come preparare, immobilizzare e visualizzare le risposte neuronali, evidenziando le dinamiche cellulari della lesione e del recupero.

Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

Questo articolo descrive un metodo per creare una lesione meccanica del vaso negli embrioni di zebrafish. Questo modello di lesione fornisce una piattaforma per lo studio dell'emostasi, dell'infiammazione correlata alla lesione e della guarigione delle ferite in un organismo ideale per la microscopia in tempo reale.

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Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

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Un modello di criolesione per lo studio della rigenerazione muscolare scheletrica del peduncolo caudale nel pesce zebra adulto

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Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Impara a indurre lesioni laser controllate nel muscolo scheletrico embrionale di Danio rerio per studiare i processi di rigenerazione. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione miofibrillare post-lesione tramite microscopia confocale.

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