Perfusione intravascolare di inchiostro nero di carbonio permette la visualizzazione affidabile dei vasi cerebrali

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'anatomia vascolare cerebrale dei topi in modo riproducibile. In primo luogo, i vasi cerebrali vengono colorati con lattice colorato per un confronto successivo con la colorazione all'inchiostro nero di carbonio. Successivamente, gli inchiostri neri di carbonio vengono mescolati e gli animali vengono perfusi con P-B-S-P-F-A e la miscela di inchiostro nero di carbonio attraverso il ventricolo sinistro.

Nell'ultima fase, il cervello viene prelevato e vengono scattate foto per il confronto e l'analisi dei vasi cerebrali colorati. Infine, il software ImageJ viene utilizzato per analizzare i punti anastomotici tra le arterie cerebrali media e anteriore. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia delle malattie cerebrovascolari, in particolare l'ictus, poiché consente di analizzare la densità vascolare e l'angiogenesi.

Ora, questo metodo può fornire informazioni sul sistema vascolare del cervello e può essere applicato anche ad altri sistemi, ad esempio per la visualizzazione dei microvasi nel cuore, nel fegato o nei reni. Dopo aver combinato la lattice con l'inchiostro al nerofumo in un tubo EP, riscaldare la miscela a 37 gradi Celsius in un bagno termico. Utilizzare un ago da 23 a 25 gauge per raccogliere la lattice riscaldata in una siringa da due millilitri.

Quindi sciogliere 12,5 milligrammi di polvere di papina cloridrato in un millilitro di soluzione fisiologica sterile e, dopo aver agitato con il vortex, raccogliere la soluzione ottenuta in una siringa per insulina. Successivamente, staccare l'ago di un'altra siringa sterile per insulina e posizionare l'ago separato all'estremità di un tubo PE 10 lungo 20 centimetri. Quindi collegare il tubo PE 10 all'ago della siringa per insulina contenente la soluzione di cloridrato di papina.

Ora riempire altre due siringhe per insulina con un millilitro di soluzione fisiologica, quindi portare tutte le siringhe insieme agli strumenti chirurgici sterilizzati sulla postazione operatoria prima della anestetizzazione. Pesare il topo, quindi posizionare il topo continuamente anestetizzato in posizione supina. Fissare gli arti e tagliare la cute sopra la vena femorale sinistra.

Ora localizzare la vena femorale e inserire la punta dell'ago collegato al tubo PE 10. Quindi iniettare lentamente la soluzione di papina cloridrato a un ritmo di circa 100 microlitri al minuto e a una dose di 50 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. Dopo l'iniezione, aprire la cavità addominale e quindi perforare il diaframma.

Quindi tagliare le costole per esporre il cuore e clampare l'aorta toracica discendente con pinze arteriose. Successivamente, effettuare un taglio netto sull'atrio destro per drenare il sangue venoso. Poi iniettare due millilitri di soluzione salina nel ventricolo sinistro.

La presenza di aria nelle soluzioni Profil o nella miscela di inchiostro combinata può causare aree vascolari del cervello non colorate. Per garantire il successo, verificare con attenzione che tutte le siringhe siano completamente prive di bolle d'aria. Ora, somministrare delicatamente il contenuto delle siringhe precaricate, una dopo l'altra, per l'iniezione manuale del lattice colorato nell'arco di 18-20 secondi, quindi lasciare l'animale a riposo per cinque minuti.

Successivamente, dopo aver decapitato l'animale, rimuovere l'osso del cranio e le meningi avendo cura di non danneggiare la corteccia o l'architettura vascolare, quindi prelevare con attenzione l'intero cervello. Posizionare il cervello in una piastra per colture cellulari da 60 millimetri contenente da sei a otto millilitri di PFA al 4%, quindi posizionare un righello graduato sotto la piastra utilizzando una fotocamera collegata al microscopio operatorio. Scattare fotografie a un ingrandimento di 25 x delle superfici dorsale e ventrale del cervello, con un angolo di 90 gradi tra l'obiettivo del microscopio e la piastra di Petri.

Per quantificare la distanza originale, iniziare la procedura di colorazione con inchiostro al nerofumo mescolando due aliquote di 100 microlitri di inchiostro herts stemple farba o CB uno con due aliquote di 900 microlitri di inchiostro pelican scribal schwartz o CB due in due provette EP separate da 1,5 millilitro. Raccogliere le miscele di inchiostro in due siringhe per insulina separate da un millilitro. Quindi chiudere le siringhe con il cappuccio e collocarle in un bagnomaria a 37 gradi Celsius, insieme ad altre due siringhe per insulina contenenti ciascuna un millilitro di soluzione salina.

Dopo aver trattato il topo come appena illustrato, utilizzare una leggera pressione per iniettare entrambe le soluzioni di inchiostro nero di carbonio nel ventricolo sinistro in un intervallo di 18-20 secondi per millilitro. Dopo aver rimosso il cervello e scattato le immagini come appena mostrato, collocare il cervello in PFA al 4% per tutta la notte, seguito da un'incubazione in concentrazioni progressivamente crescenti di saccarosio fino a quando il cervello galleggiante si immergerà completamente. Iniziare questo passaggio inducendo un'ischemia cerebrale focale transitoria.

Secondo un protocollo standard di occlusione intraluminale dell'arteria cerebrale media, al termine del periodo di riperfusione, colorare la vascolarizzazione con l'inchiostro CB uno e CB due come appena dimostrato, quindi colorare l'intero cervello con una soluzione di TTC al 2% a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Per l'identificazione del volume dell'infarto, l'area infartuata rimarrà bianca, mentre l'area non ischemica diventerà rossa. Acquisire le immagini come appena dimostrato per analizzare l'anatomia macroscopica dei vasi cerebrali, iniziando con l'apertura di un'immagine della superficie colorata del cervello.

Con il software ImageJ, i cervelli perfusi con lattice colorato possono mostrare gradi variabili di colorazione dei vasi situati sulla superficie ventrale. Al contrario, la perfusione con CB1 più CB2 colorerà tutti i vasi sia sulle superfici ventrale che dorsale. Impostare la scala in millimetri, indicare i punti anastomotici tra l'arteria cerebrale anteriore, o ACA, e l'arteria cerebrale media, o MCA, per creare una linea immaginaria che colleghi tutti questi punti anastomotici.

Ora, misurare la distanza tra la linea anastomotica e la linea mediana a quattro e poi a sei millimetri dal polo frontale del cervello. Dopo aver analizzato tre o quattro immagini per animale, calcolare il valore medio. Confrontare i valori tra i diversi gruppi di animali per identificare la variabilità all'interno dell'anatomia cerebrovascolare.

Negli animali C57 black six J, la linea anastomotica tra l'arteria cerebrale anteriore (ACA) e l'arteria cerebrale media (MCA) può essere tracciata più vicina alla linea mediana a quattro millimetri rispetto a sei millimetri caudalmente dal polo frontale, mentre nei topi knock-out per l'apolipoproteina E non si osserva una differenza significativa a questo riguardo. Al contrario, la linea anastomotica nei topi SV129 si trova più distante e più parallela alla linea mediana, sia a quattro che a sei millimetri caudalmente dal polo frontale, per l'analisi dell'anatomia vascolare. In condizioni ischemiche, identificare il margine dell'infarto come il bordo del tessuto di colore rosso e bianco, che rappresenta rispettivamente il tessuto metabolicamente attivo e il tessuto necrotico; misurare quindi la distanza del margine dell'infarto dalla linea mediana a quattro millimetri e a sei millimetri caudalmente dal polo frontale del cervello.

Il protocollo descritto qui supera i limiti tecnici della visualizzazione convenzionale, basata sul lattice, della vascolarizzazione cerebrale nei roditori. Come mostra la prima immagine dopo la perfusione con lattice colorato, solo i vasi di grandi dimensioni sulla superficie ventrale vengono colorati, lasciando l'intera superficie dorsale non colorata. Al contrario, la perfusione con CB uno più CB due determina un riempimento sufficiente sia dei vasi piccoli che di quelli grandi in modo uniforme.

La colorazione è stabile per sette giorni senza alcun cambiamento nella qualità. Utilizzando il programma Image J, la distanza dei punti anastomotici tra l'ACA e l'MCA dalla linea mediana può essere analizzata in tutti i diversi gruppi di topi, che sono stati perfusi con inchiostri per valutare le differenze nell'anatomia vascolare regionale. Sebbene l'eliminazione di un POE non influisca sulla struttura anatomica dei vasi cerebrali nei topi C57BL/6J, si può osservare una differenza significativa tra i ceppi C57BL/6J e SV129.

Negli modelli sperimentali di ictus nei roditori, la colorazione con TTC è ampiamente utilizzata per la visualizzazione del volume di infarto. La colorazione con CB one più CCB two è applicabile anche in condizioni ischemiche per osservare i cambiamenti strutturali nella vascolatura e dimostra una elevata stabilità quando combinata con la colorazione al TTC. Si noti la visualizzazione contemporanea dei vasi cerebrali e del volume di infarto nei cervelli ischemici indotti da diverse durate di ischemia cerebrale e diversi punti temporali di riperfusione.

L'analisi dei punti anastomotici tra l'arteria cerebrale anteriore (a c) e l'arteria cerebrale media (MCA) dopo 45 o 90 minuti di ischemia, associati a periodi di riperfusione di un giorno o cinque giorni, mostra come previsto che la differenza media tra la linea mediana e i punti anastomotici non presentava differenze significative tra i gruppi. Inoltre, la distanza media era nello stesso intervallo rispetto agli animali non ischemici. Tuttavia, la distanza dalla linea mediana al margine dell'infarto differiva significativamente tra i gruppi, riflettendo l'aumento del volume dell'infarto con gradi più elevati di danno da ischemia-riperfusione.

Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo dell'ictus sperimentale per esplorare le aree vascolari nel cervello del topo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare l'anatomia del sistema cerebrovascolare nei topi, perfondendo il cervello con inchiostri lattici o neri, e di come analizzare i tessuti cerebrali colorati risultanti con l'aiuto del software Image J.