Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli odori biologicamente efficaci in senso complesso attraverso registrazioni nel cervello del calabrone. Ciò si ottiene raccogliendo in primo luogo il senso dell'effetto comportamentale e, in secondo luogo, preparando il gascromatografo e i sistemi di registrazione multicanale per l'esperimento. Il terzo passo consiste nel preparare e sezionare il cervello del calabrone per le registrazioni neurali nell'antenna del lobo di fabbrica.

L'esperimento viene quindi condotto inserendo gli elettrodi nel lobo di un'antenna e misurando le risposte ai volatili soffiati mediante l'analisi dell'attività neurale in risposta al senso complesso e ai loro singoli costituenti. È possibile identificare odori biologicamente attivi ottenuti mediante gascromatografia. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche come G-C-E-A-G, è la sensibilità dei neuroni di carico dell'antenna e la capacità di caratterizzare come i neuroni nel cervello rispondono a specifici volatili floreali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi analitiche elettrofisiologiche e chimiche combinate sono difficili da apprendere a causa della tecnica di registrazione della preparazione elettrofisiologica e delle fasi necessarie per la raccolta dei volatili dello spazio di testa. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sull'elaborazione olfattiva dei bombi, può essere applicata anche ad altri sistemi come fattori di malattia come zanzare o insetti baciatori o parassiti delle colture come afidi o falene. Per questa procedura, hanno preparato un elettrodo di riferimento in filo di tungsteno su un micro manipolatore su un secondo.

I micro manipolatori hanno un elettrodo multicanale, come un filo a spirale, un tede o un elettrodo multicanale in silicio collegato a un preamplificatore hanno un gascromatografo con un'uscita su una tabella BNC schermata. L'uscita del rivelatore GCs è interfacciata con l'amplificatore e il sistema di acquisizione dati in modo tale che sia i segnali neurali che quelli GC siano sincronizzati. In questo esempio, il gas di trasporto GC è l'elio e si trova in una colonna DB a cinque GC.

Il GC utilizza un ingresso split list con la temperatura impostata su 200 gradi Celsius e la temperatura del rivelatore a ionizzazione di fiamma è impostata su 230 gradi Celsius. Dopo che i campioni sono stati riscaldati nel gc, l'effluente della colonna viene diviso uno a uno tra il rivelatore a ionizzazione di fiamma e l'antenna B utilizzando un connettore a Y in vetro. In questo esempio, il GC viene utilizzato per fornire sostanze volatili raccolte per assorbimento dinamico dai fiori dell'occhio di Mimus Lewis, un fiore selvatico alpino originario della California.

In alternativa, invece di utilizzare il gc, singoli composti volatili o miscele di composti possono essere erogati mediante impulsi d'aria. Erogato attraverso una siringa di vetro separata contenente un pezzo di carta da filtro su cui sono stati depositati i composti. Gli impulsi d'aria vengono deviati da un flusso d'aria costante utilizzando una valvola azionata da un solenoide controllato da un computer.

Iniziare le preparazioni tagliando a circa un centimetro dall'estremità di un puntale per pipetta da un millilitro. Posizionare un calabrone alla base del puntale della pipetta e spingerlo delicatamente verso l'estremità opposta del puntale fino a quando solo la testa è esposta. Usando la cera dentale fusa, crea uno stampo attorno alla testa esposta.

La cera deve aderire agli occhi composti per immobilizzare completamente la testa, ma non deve entrare in contatto con l'antenna se necessario. Usa piccoli spilli per immobilizzare le antenne. Successivamente, fai un'incisione quadrata simile a una finestra nella capsula della testa usando una lama affilata come un micro bisturi.

Inizia a tagliare direttamente dietro l'antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Taglia una linea retta tra gli occhi. Quindi, tagliare dorsalmente fino a quando la capsula della testa non si curva verso il torace.

Continuare il taglio fino all'estremità opposta della capsula di testa. Infine taglia all'inizio per completare il quadrato. Usa il forcipe per rimuovere la cuticola.

La cuticola adiacente all'antenna deve essere rimossa, altrimenti ostacolerà l'elettrodo non appena il cervello viene esposto. Immediatamente super fondere il tessuto con soluzione salina per insetti. Assicurarsi che i lobi dell'antenna siano ben esposti.

Quindi utilizzare con attenzione un paio di pinze molto sottili per rimuovere la guaina perineurale immediatamente sopra i lobi dell'antenna. Fai molta attenzione a non perforare il cervello dell'ape con il forcipe. La preparazione delle api è ora pronta per la registrazione elettrofisiologica.

Inizia attaccando l'ape preparata a un morsetto fissato a una base magnetica. Tienilo super fuso con soluzione salina per insetti erogata da un serbatoio con un regolatore di flusso. Ora inserisci l'elettrodo di riferimento nel tessuto cerebrale controlaterale.

Quindi, inserire l'elettrodo multicanale nei lobi dell'antenna dell'ape. Quando gli elettrodi sono in posizione. Attendere da 30 a 60 minuti affinché le registrazioni si stabilizzino.

Durante questo periodo, preparati ai picchi extracellulari dei neuroni anche con la soglia. I singoli canali di registrazione Potrebbe essere necessaria la soglia manuale per alcuni canali a causa di un rumore nei canali di registrazione. Quindi, verificare che la rampa di temperatura della corsa GC sia corretta.

In questo esempio, la temperatura inizia a 50 gradi Celsius per quattro minuti e poi aumenta di 10 gradi al minuto fino a una temperatura finale di 220 gradi Celsius, oppure viene mantenuta per sei minuti. Quando le forme d'onda delle unità nei canali di registrazione sono diventate coerenti, le registrazioni neurali sono considerate stabili. Una volta stabilizzata, caricare la siringa con l'odore floreale dello spazio di testa e iniettare l'odore nella porta di iniezione della testa del gc.

Quindi, al termine dell'esecuzione del GC, iniziare immediatamente la registrazione dagli elettrodi. Lasciare riposare la preparazione per cinque-15 minuti. Quindi iniettare un altro campione nel GC o stimolare la preparazione utilizzando singoli composti volatili o miscele di composti.

Se in qualsiasi momento l'attività spontanea si interrompe o cambia improvvisamente, controllare il gocciolamento di soluzione salina e lasciare riposare la preparazione per 15 minuti. Quindi, se l'attività non riacquista il suo livello precedente, scarta la preparazione. Dopo l'esperimento, fissare il cervello con le sonde ancora nel tessuto, quindi asportare il cervello, eliminare il fissativo e disidratare il cervello.

Le posizioni dei canali di registrazione possono quindi essere identificate mediante microscopia confocale dal profumo floreale mimus Luci. Il numero totale di volatili che stanno saccheggiando. Il GC è tipicamente compreso tra 60 e 70 composti.

Il profumo di Mimus Luci è composto prevalentemente da mono terpenoidi, tra cui la beta miosina e l'alfa pinine. Il resto del profumo è composto da sei volatili di carbonio. Diversi preparati sono stati stimolati con tre microlitri dell'estratto di occhi di Mimus Lewis.

Questa registrazione da una delle otto unità neurali registrate dall'elettrodo multicanale mostra quanto selettivo un neurone compete con specifici volatili. In questo esempio, dine è quel composto mostrato. Ecco le risposte di otto unità neurali.

Circa la metà dell'ensemble non rispondeva. Ciò è sorprendente data la diversità dei composti volatili allusi dallo spazio di testa floreale, ma questo è coerente tra i preparati ed è riportato da altri studi. La velocità di sparo normalizzata delle unità reattive mostra che esiste una forte selettività per un gruppo di odorizzanti.

Gli odori evidenziati dalle frecce hanno suscitato le risposte più robuste. Questi sono la demina e la beta osaina trans. Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il tuo insetto per l'esperimento e quindi condurre l'esperimento utilizzando la gascromatografia con registrazione multicanale.

L'obiettivo quindi è identificare odori comportamentali putativi efficaci in un bouquet complesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi, come i test comportamentali con gli odoranti identificati, possono essere eseguiti per determinare completamente l'efficacia dei volatili nel mediare la risposta comportamentale dell'insetto.