Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli odoranti biologicamente attivi in una miscela complessa analizzando le registrazioni effettuate nel cervello del bombice. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo i campioni odorosi che producono effetti comportamentali, e in secondo luogo preparando il cromatografo a gas e i sistemi di registrazione multicanale per l'esperimento. Il terzo passaggio consiste nel preparare e dissezionare il cervello del bombice per effettuare le registrazioni neurali nel lobo antennale.

L'esperimento viene quindi condotto inserendo gli elettrodi in un lobo antennale e misurando le risposte ai composti volatili erogati, analizzando l'attività neurale in risposta a odori complessi e ai loro singoli costituenti. Gli odoranti biologicamente attivi possono essere identificati mediante cromatografia gassosa. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come la G-C-E-A-G, risiede nella sensibilità dei neuroni del carico antennale e nella capacità di caratterizzare come i neuroni cerebrali rispondono a specifici composti volatili floreali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi combinate di analisi elettrofisiologica e chimica analitica sono difficili da apprendere a causa della tecnica di registrazione della preparazione elettrofisiologica e dei passaggi necessari per raccogliere le sostanze volatili dello spazio di testa. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul trattamento olfattivo dei bombi, può essere applicata anche ad altri sistemi, come fattori di malattia come zanzare o triatomini, o parassiti delle colture come afidi o falene. Per questa procedura, preparare un elettrodo di riferimento realizzato con filo di tungsteno su un micromanipolatore in un secondo momento.

Il micromanipolatore è dotato di un elettrodo multicanale, come un filo avvolto, un elettrodo tede o un elettrodo multicanale in silicio, collegato a un preamplificatore che dispone di un gascromatografo con uscita su un tavolo schermato BNC. L'uscita del rilevatore del gascromatografo è interfacciata con l'amplificatore e il sistema di acquisizione dati in modo che i segnali neurali e quelli del gascromatografo siano sincronizzati. In questo esempio, il gas trasportatore del gascromatografo è elio ed è presente in una colonna gascromatografica DB5.

Il GC utilizza un'iniettore a divisione con la temperatura impostata a 200 gradi Celsius e un rivelatore a ionizzazione di fiamma con la temperatura impostata a 230 gradi Celsius. Dopo che i campioni sono stati riscaldati nel gc, l'effluente dalla colonna viene suddiviso in parti uguali tra il rivelatore a ionizzazione di fiamma e l'antenna B mediante un connettore a Y in vetro. In questo esempio, il GC viene utilizzato per veicolare i composti volatili raccolti mediante assorbimento dinamico dai fiori di Mimus Lewis eye, una pianta spontanea alpina originaria della California.

In alternativa, invece di utilizzare il gc, singoli composti volatili o miscele di composti possono essere somministrati mediante impulsi d'aria. Iniettati attraverso una siringa di vetro separata contenente un pezzo di carta da filtro su cui sono stati depositati i composti. Gli impulsi d'aria vengono deviati da un flusso d'aria costante mediante una valvola attivata da un solenoide e controllata da un computer.

Iniziare le preparazioni tagliando circa un centimetro dall'estremità di una punta per pipetta da un millilitro. Inserire un bombice alla base della punta per pipetta e spingerlo delicatamente verso l'estremità opposta fino a quando sarà esposta soltanto la testa. Utilizzando cera da dentista fusa, creare uno stampo intorno alla testa esposta.

La cera deve aderire agli occhi composti per immobilizzare completamente la testa, ma non deve entrare in contatto con le antenne, se necessario. Utilizzare piccoli perni per immobilizzare le antenne. Successivamente, praticare un'incisione a forma di finestra quadrata nel capuscolo usando una lama affilata, come un microbisturi.

Inizia a tagliare direttamente dietro l'antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Pratica una linea retta tra gli occhi. Successivamente, taglia in senso dorsale fino a quando la capsula cranica si incurva verso il torace.

Continuare il taglio fino all'estremità opposta della capsula cefalica. Infine, tornare al punto di partenza per completare il quadrato. Utilizzare la pinzetta per rimuovere la cuticola.

È necessario rimuovere la cuticola adiacente all'antenna, altrimenti ostacolerà l'elettrodo non appena il cervello sarà esposto. Subito dopo, irrorare abbondantemente il tessuto con soluzione salina per insetti. Assicurarsi che i lobi antennali siano ben esposti.

Quindi, utilizzare con attenzione un paio di pinzette molto fini per rimuovere la guaina perineurale immediatamente al di sopra dei lobi antennali. Prestare molta attenzione a non perforare il cervello dell'ape con le pinzette. Il preparato dell'ape è ora pronto per la registrazione elettrofisiologica.

Iniziare fissando l'ape preparata a una pinza collegata a una base magnetica. Mantenerla perfusione continua con soluzione salina per insetti erogata da un serbatoio dotato di un regolatore di flusso. Inserire ora l'elettrodo di riferimento nel tessuto cerebrale controlaterale.

Successivamente, inserire l'elettrodo multicanale in un lobo antennale dell'ape. Quando gli elettrodi sono in posizione, attendere da 30 a 60 minuti affinché le registrazioni si stabilizzino.

In questo periodo, prepararsi a rilevare i potenziali extracellulari dei neuroni applicando anche un'analisi per soglia. Potrebbe essere necessaria una sogliatura manuale per alcuni canali a causa del rumore nei canali di registrazione. Successivamente, verificare che la rampa di temperatura della corsa in gascromatografia sia corretta.

In questo esempio, la temperatura parte da 50 gradi Celsius per quattro minuti e poi aumenta di 10 gradi al minuto fino a una temperatura finale di 220 gradi Celsius, oppure viene mantenuta per sei minuti. Quando le forme d'onda delle unità nei canali di registrazione diventano costanti, le registrazioni neurali sono considerate stabili. Una volta stabilizzate, caricare la siringa con l'odore del capolino raccolto nello spazio di testa e iniettare l'odore nel porto di iniezione in testa del gc.

Quindi iniziare immediatamente la registrazione dagli elettrodi non appena la corsa in gascromatografia è terminata. Lasciare riposare il preparato per cinque-quindici minuti. Successivamente, iniettare un altro campione nella gascromatografia oppure stimolare il preparato utilizzando singoli composti volatili o miscele di composti.

Se in qualsiasi momento l'attività spontanea dovesse cessare improvvisamente o modificarsi, verificare il gocciolamento della soluzione salina e lasciare riposare il preparato per 15 minuti. Se l'attività non dovesse tornare al livello precedente, scartare il preparato. Al termine dell'esperimento, fissare il cervello lasciando i microelettrodi nel tessuto, quindi escindere il cervello, rimuovere il fissativo e disidratare il cervello.

Le posizioni dei canali di registrazione possono quindi essere identificate mediante microscopia confocale a partire dal profumo floreale di mimus Luci. Il numero totale di composti volatili viene recuperato. Il CG è tipicamente composto da 60 a 70 composti.

L'odore di Mimus Luci è composto principalmente da monoterpenoidi, tra cui beta myosin e alpha pinine. La parte restante dell'odore è costituita da composti volatili a sei atomi di carbonio. Diverse preparazioni sono state stimolate con tre microlitri dell'estratto oculare di Mimus Lewis.

Questa registrazione, proveniente da una delle otto unità neurali registrate tramite l'elettrodo multicanale, mostra quanto un neurone possa essere selettivo nei confronti di composti volatili specifici. In questo esempio, il composto mostrato è il dine. Di seguito sono riportate le risposte di otto unità neurali.

Circa metà dell'ensemble non ha risposto. Questo risultato è sorprendente alla luce della diversità di composti volatili rilevati nello spazio gassoso del fiore, ma è coerente tra diverse preparazioni ed è riportato anche da altri studi. Il tasso di scarica normalizzato delle unità responsivi mostra una marcata selettività verso un gruppo di odoranti.

Gli odoranti evidenziati dalle frecce hanno provocato le risposte più intense. Si tratta della demina e del trans beta osain. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare l'insetto per l'esperimento e quindi eseguire l'esperimento utilizzando la cromatografia gassosa con registrazione multicanale.

L'obiettivo è quindi identificare odoranti putativamente efficaci dal punto di vista comportamentale all'interno di un bouquet complesso. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se svolta correttamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come test comportamentali con gli odoranti identificati, possono essere effettuati per determinare pienamente l'efficacia dei composti volatili nel mediare la risposta comportamentale dell'insetto.