Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i partner d'interazione di grab two mediante clonazione espressiva di CD NA e osservazione dei cambiamenti nella proteina fluorescente verde marcata con grab two. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando una libreria di CD NA da lisati batterici come secondo passaggio. I CD NA vengono trasfettati in cellule renali embrionali umane, il che porterà all'espressione del costrutto reporter insieme ai geni di interesse.

Successivamente, le piastre trasfettate vengono analizzate al microscopio opera al fine di visualizzare i cambiamenti nella localizzazione di grab two all'interno delle cellule. I risultati ottenuti mostrano il reclutamento mediato dal recettore del fattore di crescita epidermico di grab two marcato con GFP verso gli endosomi, sulla base della microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sistema two-hybrid, è che i partner d'interazione di grab two possono essere identificati in una situazione fisiologica che tenga conto della distribuzione subcellulare dei partner d'interazione.

Benché questo metodo possa essere utilizzato per identificare la trasduzione del segnale mediata da Grab due, può essere applicato anche ad altri sistemi, come altre proteine di interesse. La libreria di cDNA è fornita sotto forma di singole colonie batteriche in stock glicerolati.

In un formato a 96 pozzetti, utilizzare il comando re ray nel menu picker di Hudson Rapid pick light. Trasferire le colonie batteriche dalla piastra sorgente e inoculare in 1,5 millilitri di lb amp in una piastra a 96 pozzetti profondi. Sigillare ermeticamente le piastre a pozzetti profondi con un sigillo permeabile ai gas e incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius in un agitatore. Il giorno successivo, centrifugare le piastre a pozzetti profondi contenenti i batteri a 2000 RPM per 20 minuti.

Utilizzando adattatori per piastre in una centrifuga da banco, aspirare il mezzo lasciando intatto il pellet batterico. Successivamente, configurare il deck della workstation automatizzata Tecan Freedom Evo come mostrato qui. Distribuire le soluzioni per la preparazione del plasmide nei serbatoi da uno a cinque e posizionare una piastra a pozzetti profondi sul deck.

Posizionare un serbatoio multipozzetta con soluzione di alucina accanto alla piastra a pozzetti profondi; caricare le punte nei rack delle punte. Assemblare il manifold a vuoto. La piastra di legame del plasmide viene posizionata all'interno del manifold e la piastra filtrante per il plasmide viene posta sopra il manifold. Ri-sospendere i pellet con 250 microlitri di soluzione uno.

Sospendere il pellet nel buffer Resus mediante pipettaggio su e giù. È fondamentale assicurarsi che i pellet siano completamente risospesi per il successo di questa procedura. Si può utilizzare un agitatore se il pipettaggio su e giù non risospende completamente il pellet.

Una volta che i pellet sono completamente risospesi, si aggiungono 250 microlitri di soluzione al tampone di lisi per rompere i batteri. Chiudere la piastra e capovolgerla per consentire un mescolamento completo. Impostare un timer per due minuti.

Successivamente, aggiungere 350 microlitri della soluzione tre, ovvero il tampone di neutralizzazione. Sigillare la piastra e capovolgerla tre volte.

Trasferire i lisati batterici nelle piastre filtranti per plasmidi. Applicare il vuoto per cinque minuti. Rimuovere la piastra filtrante e posizionare la piastra di legame sopra il manifold.

Applicare il vuoto per un minuto. Aggiungere 500 microlitri di ulteriore tampone di lavaggio ed applicare il vuoto per due minuti. Aggiungere 900 microlitri di soluzione di lavaggio numero quattro ed applicare il vuoto per due minuti.

In seguito, aggiungere 900 microlitri di soluzione tampone di lavaggio quattro e applicare il vuoto per 15 minuti. Posizionare la piastra di raccolta del DNA all'interno del manifold. Aggiungere 100 microlitri di tampone Elucian sulla piastra di legame e incubare per due minuti.

Applicare il vuoto per 10 minuti. Infine, rimuovere la piastra di raccolta e misurare la concentrazione di DNA utilizzando il NanoDrop 8,000. Tipicamente, con questo metodo si può ottenere un rendimento di circa 100 nanogrammi per microlitro all'inizio di questa procedura.

Dopo che le cellule HEK 293 sono state tripsinizzate e contate, utilizzare un distributore automatico per dispensare due volte 10 alla quattro cellule in ogni pozzetto di una piastra Perkin Elmer View. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per la trasfezione.

Utilizzare il manipolatore automatico di liquidi per preparare la seguente miscela in ogni pozzetto di una piastra rotonda a 96 pozzetti: 100 nanogrammi di GFP. Prelevare due plasmidi di DNA con 100 nanogrammi di DNA CD in 25 microlitri di mezzo privo di siero. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di mezzo privo di siero contenente 0,5 microlitri di transfectin per pozzetto, quindi avviare il cronometro per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, trasferire 50 microlitri della miscela di transfezione di cDNA nelle cellule. Utilizzare un metodo di dispensazione delicato. Incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Per iniziare l'acquisizione delle immagini, avviare il software opera. Selezionare la scheda di configurazione e scegliere l'obiettivo 20 volte e il tipo corretto di piastra. Assicurarsi che il collare sia impostato sul valore corretto sull'obiettivo per consentire la messa a fuoco con diversi tipi di piastra.

Successivamente, selezionare la scheda del microscopio. Definire l'esposizione uno come laser fite 4 88 e l'esposizione due come laser UV 365. Attivare il filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare l'esposizione.

Uno alla telecamera uno e all'esposizione. Due alla telecamera due. Impostare i tempi di esposizione a 800 millisecondi per l'esposizione uno e a 40 millisecondi per l'esposizione.

Due, selezionare l'esposizione, impostare l'altezza del fuoco a zero micron. Selezionare il fuoco una volta messo a fuoco. Esporre la fotocamera uno.

Regolare l'altezza del fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e fare clic su acquisisci altezza. Salvare i parametri di esposizione, ripetere per l'esposizione. Due, selezionare la scheda definizione dell'esperimento, creare il layout e il sottolayout.

Trascinare e rilasciare il layout, l'esposizione, l'immagine di riferimento, la distorsione, il file di ritaglio e il sottolayout pertinenti. Salvare l'esperimento. Selezionare la scheda esperimento automatico e acquisire le immagini in condizioni normali.

Grab due è localizzato in tutta la cellula. Alla stimolazione di un recettore per un fattore di crescita, si trasloca verso la membrana plasmatica e successivamente viene internalizzato negli endosomi. In questa figura, il pannello superiore mostra cellule CO M sei transfectate in modo transitorio con GFP grab due, e come previsto, la fluorescenza è distribuita in tutta la cellula.

Tuttavia, nelle cellule transfezionate in modo transitorio con GFP grab due più il recettore della superficie cellulare IT EGFR grab due si riposiziona in strutture simili a endosomi, come mostrato nel pannello inferiore. Pertanto, applicando una libreria a livello genomica, si può prevedere l'identificazione di nuove proteine di superficie cellulare leganti grab due. Questo metodo non è limitato al rilevamento di proteine di superficie cellulare.

Ad esempio, la DYNAMIN due della GPA, che è coinvolta nell'endocitosi mediata da grab due, induce una traslocazione di grab due. In questo esperimento, grab due GFP è stato cotrasfettato con DNM due in cellule HEC 2 93 T. La rilocalizzazione di grab due GFP in strutture simili a endosomi è illustrata dalle cellule all'interno dei cerchi rossi.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoprecipitazione o i saggi biochimici possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se l'interazione è diretta o indiretta. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il cloning per espressione al fine di identificare interazioni proteiche a livello subcellulare.