Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione
October 30th, 2012
Un alto contenuto di metodo di screening per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni su In vivo Legame proteina e la localizzazione sub-cellulare di complessi di proteine in cellule di mammifero.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i partner di interazione di grab two mediante clonazione dell'espressione di CD NA e osservazione dei cambiamenti nella proteina fluorescente verde marcata con Grab two. Ciò si ottiene preparando prima una libreria di CD NA da lisati batterici come seconda fase. I CDNA vengono trasfettati in cellule renali embrionali umane, il che si tradurrà nell'espressione del costrutto reporter insieme ai geni di interesse.
Successivamente, le piastre trasfettate vengono analizzate al microscopio per visualizzare i cambiamenti nella localizzazione della presa due in tutte le cellule, si ottengono risultati che mostrano il reclutamento mediato dal recettore del fattore di crescita epidermico di GFP marcato. Afferra due endosomi in base alla microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come questi due ibridi è che i partner di interazione di grab two possono essere identificati in una situazione fisiologica che tiene conto della distribuzione subcellulare dei partner di interazione.
Bene, però, questo metodo può essere utilizzato per identificare la trasduzione del segnale da Grab two. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come altre proteine di interesse. La libreria CDNA è fornita di singoli cloni batterici in stock di glicerolo.
In un formato a 96 pozzetti utilizzando il comando reray nel menu di selezione della luce di prelievo rapido Hudson. Prelevare i cloni batterici dalla piastra di origine e inoculare in 1,5 millilitri di ampere in una piastra a 96 pozzetti. Sigillare in ritardo le piastre dei pozzetti profondi con una guarnizione permeabile ai gas e incubare per una notte a 37 gradi Celsius in uno shaker Il giorno seguente, centrifugare le piastre dei pozzetti profondi contenenti i batteri A 2000 RPM per 20 minuti.
Utilizzando gli adattatori per piastre in una centrifuga da tavolo, aspirare i terreni dai pozzetti lasciando intatto il pellet batterico. Quindi, configurare il deck della workstation Tecan Freedom Evo Automation come mostrato qui. Distribuire le soluzioni per la preparazione dei plasmidi nelle vasche da uno a cinque e posizionare una piastra a pozzetti profondi sul ponte.
Posizionare un trogolo multipozzetto con soluzione aluciana adiacente alle punte di carico della piastra a pozzetti profondi nei rack dei puntali. Montare il collettore del vuoto. La piastra di legame plasmidico è posta all'interno del collettore e la piastra filtrante plasmidica è posta sopra il collettore Resus sospendere i pellet con 250 microlitri di soluzione uno.
Il tampone di sospensione Resus mediante pipettaggio su e giù. Assicurarsi che i pellet siano completamente risospesi è fondamentale per il successo di questa procedura. Uno shaker può essere utilizzato se un accarezzamento su e giù non rimette completamente in sospensione il pellet.
Una volta che i pellet sono completamente risospesi, i batteri si trovano aggiungendo 250 microlitri di soluzione al tampone di lisi. Sigillare la piastra e capovolgere per consentire la miscelazione completa. Imposta un timer per due minuti.
Quindi, aggiungi 350 microlitri di soluzione tre. Il tampone di neutralizzazione. Sigillare la piastra e invertire tre volte le linee.
Trasferire i lisati batterici nelle piastre filtranti del plasmide. Applicare il vuoto per cinque minuti. Rimuovere la piastra del filtro e posizionare la piastra di legatura sopra il collettore.
Applicare il vuoto per un minuto. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio aggiuntivo e applicare il vuoto per due minuti. Aggiungere 900 microlitri di soluzione tampone di lavaggio quattro e applicare il vuoto per due minuti.
Successivamente, aggiungere nuovamente 900 microlitri di soluzione tampone di lavaggio quattro e applicare il vuoto per 15 minuti. Posizionare la piastra di raccolta del DNA all'interno del collettore. Aggiungere 100 microlitri di tampone Elucian alla piastra di legatura e incubare per due minuti.
Applicare il vuoto per 10 minuti. Infine, rimuovere la piastra di raccolta e misurare la concentrazione di DNA utilizzando il NanoDrop 8, 000. In genere, ci si può aspettare una resa di circa 100 nanogrammi per microlitro con questo metodo per iniziare questa procedura.
Dopo hec 2 9 3 cellule vengono tripizzate, inizzate e contate. Utilizzare un erogatore automatico per erogare due volte 10 nelle quattro celle in ciascun pozzetto di un Perkin Elmer. Visualizza la piastra, incuba le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per la trasfezione.
Utilizzare il manipolatore di liquidi automatizzato per preparare la seguente miscela in ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti da 100 nanogrammi di GFP. Prendi due DNA plasmidico con 100 nanogrammi di CD NA in 25 microlitri di terreno privo di siero. Quindi, aggiungere 25 microlitri di terreno privo di siero contenente 0,5 microlitri di trasfettazione per pozzetto e avviare il timer per 30 minuti.
Dopo 30 minuti, trasferire 50 microlitri al trasfetto CDNA in miscela alle cellule. Utilizzando un metodo di erogazione delicato. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, avviare il software Opera. Seleziona la scheda di configurazione e seleziona l'obiettivo 20 volte e il tipo di targa corretto. Assicurarsi che il collare sia impostato sul valore corretto sull'obiettivo per consentire la messa a fuoco con diversi tipi di targa.
Quindi, selezionare la scheda del microscopio. Definire l'esposizione uno come laser fite 4 88 e l'esposizione due come laser UV 365. Attiva il filtro UV su entrambe le esposizioni e assegna l'esposizione.
Uno alla fotocamera uno e l'esposizione. Due a due telecamere. Impostare i tempi di esposizione su 800 millisecondi per l'esposizione, uno e 40 millisecondi per l'esposizione.
Due, selezionare l'esposizione, uno impostare l'altezza di messa a fuoco a zero micron. Selezionare la messa a fuoco una volta messa a fuoco. Esporre la fotocamera uno.
Regola l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e fai clic su prendi altezza. Salva i parametri di esposizione, ripeti per l'esposizione. Due, selezionare la scheda di definizione dell'esperimento, creare il layout e il layout secondario.
Trascina e rilascia il layout pertinente, l'esposizione, l'immagine di riferimento, l'inclinazione, il file di ritaglio e il layout secondario. Salva l'esperimento. Seleziona la scheda esperimento automatico e acquisisci le immagini in condizioni normali.
La presa due è localizzata in tutta la cellula. Dopo la stimolazione di un recettore del fattore di crescita, si trasloca sulla membrana plasmatica e successivamente viene internalizzato negli endosomi. In questa figura, il pannello superiore mostra sei cellule di CO M che sono state trasfettate transitoriamente con GFP grab two e, come previsto, la fluorescenza è distribuita in tutta la cellula.
Tuttavia, nelle cellule trasfettate transitoriamente con GFP, afferrare due più il recettore di superficie cellulare IT EGFR afferrare due si riposiziona in strutture simili agli endosomi, come mostrato nel pannello inferiore. Pertanto, quando si applica una libreria a livello di genoma, ci si può aspettare che possano essere identificate nuove proteine della superficie cellulare legante. Questo metodo non si limita alla rilevazione delle proteine della superficie cellulare.
Ad esempio, la DYNAMIN two della GPA, che è coinvolta nell'endocitosi mediata dalla presa due, induce una traslocazione della presa due. In questo esperimento, la presa GFP due è stata trasfettata con DNM due in cellule T HEC 2 93. Il trasferimento della GFP grab two in strutture simili agli endosomi è illustrato dalle cellule all'interno dei cerchi rossi.
Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoprecipitazione o i saggi biochimici possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se l'interazione è diretta o indiretta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il clonaggio di espressione per identificare le interazioni proteiche subcellulari.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo di screening ad alto contenuto per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti nella segnalazione, adatto per l'automazione su larga scala. Il metodo permette previsioni riguardanti il legame delle proteine in vivo e la localizzazione subcellulare dei complessi proteici nelle cellule di mammiferi.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Trasduzione del segnale
Sfondo
- Comprendere le interazioni proteiche è cruciale per chiarire i percorsi di segnalazione cellulare.
- I metodi tradizionali potrebbero non riflettere accuratamente le condizioni fisiologiche.
- Lo screening ad alto contenuto permette un'analisi automatizzata ed efficiente.
- Il tagging GFP fornisce intuizioni visive sulla localizzazione delle proteine.
Obiettivo dello studio
- Identificare i partner di interazione di Grab2 utilizzando la clonazione dell'espressione CDNA.
- Osservare i cambiamenti nella localizzazione di Grab2 in risposta a stimoli.
- Migliorare i metodi esistenti fornendo un contesto fisiologico per le interazioni proteiche.
Metodi utilizzati
- Preparazione di una libreria CDNA da lisati batterici.
- Trasfezione di cellule di rene embrionale umano con costrutti reporter.
- Analisi delle cellule trasfettate mediante microscopia a fluorescenza.
- Automazione dei processi di preparazione del plasmide e trasfezione cellulare.
Risultati principali
- Il Grab2 marcato con GFP è localizzato in tutta la cellula e si transloca alla membrana plasmatica in seguito a stimolazione.
- L'interazione con il recettore del fattore di crescita epidermico porta all'internalizzazione negli endosomi.
- Il metodo identifica con successo le interazioni proteiche in un contesto fisiologico.
- I risultati indicano potenziali applicazioni per altre proteine di interesse.
Conclusioni
- Il metodo di screening ad alto contenuto è efficace per studiare le interazioni proteiche.
- Questo approccio può essere applicato a vari percorsi di segnalazione oltre Grab2.
- L'automazione migliora l'efficienza e la scalabilità del processo di screening.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
