Name: Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Impara a isolare i linfociti dal tratto genitale murino mediante digestione enzimatica e gradiente Percoll. Questa tecnica consente la caratterizzazione citometrica e applicazioni in immunologia riproduttiva.

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Ci piace ringraziare NIH per le sovvenzioni di finanziamento R01-AI026328 (KAK) e R01-AI079004 (KAK).

1. Rimozione del tratto genitale <ol><li> Eutanasia il mouse secondo le linee guida approvate. Fai incisione bassa linea mediana e ritrarre la pelle. </li><li> Isolare e rimuovere tutto tratto genitale, da ovidotto all&#39;apertura vaginale. </li><li> Aprire l&#39;intero tratto longitudinale con le forbici. </li><li> Tagliare il tratto genitale con belle forbici chirurgiche in pezzi sottili (circa &lt;1 mm) in una capsula di Petri con RPMI-10/EDTA completa (vedere la formula di seguito) e mescolare il tessuto in 125 ml matraccio a temperatura ambiente su un agitatore magnetico fissato per 15 min. Questa procedura viene ripetuta due volte e poi il surnatante, che contiene epitelio e altri detriti, viene scartato. </li><li> Versare il contenuto del matraccio attraverso un colino cellula (40μm). Lavare i residui EDTA con terreno completo. Completa RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% di siero fetale bovino (FBS), inattivato al calore, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml 1M HEPES. Completa RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (come sopra) con E 5 micronDTA </li></ol> 2. La digestione dei tessuti del tratto genitale <ol><li> Trasferire pezzi di tessuto in un pallone nuovo con 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (vedi ricetta sotto) e digerire il tessuto a 37 ° C per 1 ora su un agitatore magnetico impostato agitare energicamente il tessuto. Completa RPMI-10/collagenase: Giusto prima dell&#39;uso, ricostituire collagenasi di tipo VIII (Sigma; conservare a -20 ° C, o secondo le istruzioni del produttore.), Aggiungere nel RPMI/10 completa ad una concentrazione finale di 450-500U/ml. </li><li> Dopo la prima digestione, raccogliere surnatanti con filtro da 100 micron delle cellule, mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Trasferire il tessuto non digerito in un pallone nuovo e ripetere il punto 2,1 per altre due volte utilizzando fresco RPMI-10/collagenase completo per un totale di 3 digestioni separate. A questo punto, non visibili pezzi di tessuto devono essere in soluzione. </li><li> Piscina tutti i surnatanti insieme da un campione e raccogliere con filtro da 100 micron cella. Gira la cElls verso il basso. Pellet cellulari saranno separati utilizzando gradienti Percoll. </li></ol> 3. Separare le cellule del tratto genitale con gradienti Percoll <ol><li> Preparare ciascuna concentrazione di Percoll prima dell&#39;uso: <ul><li> 100% isotonica Percoll: mix 9:01 magazzino Percoll (Pharmacia BiOTCH) vs 10x PBS. pH a 7,4 utilizzando HCl. </li><li> Percoll soluzione al 40%: miscelare 40 ml di Percoll isotonico 100% e 60 ml di RPMI completo. </li><li> Percoll soluzione al 70%: miscelare 70 ml del 100% Percoll isotonico con 30 ml di RPMI completo. </li></ul></li><li> Risospendere ogni pellet di cellule dal punto 6 in soluzioni Percoll 40%. Un volume uguale di Percoll 70% sarà utilizzato per fare i gradienti. Ci sono due modi per impostare i tubi di gradiente: <ol><li> Under-strato: aggiungi sospensione cellulare con il 40% in un tubo Percoll primo gradiente, poi accuratamente sotto-strato Percoll 70%. </li><li> Over-strato: aggiungere 70% Percoll nel tubo, poi lentamente e con cautela carico massimo di 40% Percoll contenente le celle deltop. </li></ol></li><li> Gradiente campioni saranno centrifugati @ 900 xg, temperatura ambiente, per 20 minuti con il freno. </li><li> I linfociti saranno al livello di interfaccia tra il 40% e strati di Percoll 70%. Cautela raccogliere il livello di interfaccia, lavare con RPMI 1:3 e spin down a 740 xg. I linfociti saranno nel pellet cellulare e sono pronti per un ulteriore uso. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Un esempio di isolamento dei linfociti di topo tratto genitale e citometria a flusso (FACS) analisi è illustrato nella figura 1. Tratto genitale è stato rimosso da Chlamydia muridarum intravaginale del mouse infettato 7 giorni dopo l&#39;infezione. Due vie genitali sono stati raggruppati insieme in modo da avere linfociti sufficienti per esame funzionale e fenotipo mediante FACS. Tessuti sezionati sono stati trattati con la digestione e passaggi di isolamento come descritto sopra. La sospensione singola cellula è stato colorato per vari fluorocromo coniugatoanticorpi monoclonali contro CD3 del mouse, CD4 e CD8. La figura 1 mostra una dot-plot presentazione di cellule CD4 positive T contro le cellule T CD8 positivi gate sui linfociti T CD3 positivi. La nostra procedura in grado di esaminare i linfociti isolati da vie genitali di modelli di malattia diversi per valutare diverse caratteristiche funzionali delle cellule immunitarie e fenotipica in malattie diverse in modello murino. Questi includono diverse cellule immunitarie, come le cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili NK, NKT, cellule T (Ag-specifiche cellule T), cellule B ecc 3-10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Linfociti Figura 1. Sono stati isolati dal tratto genitale di topi infettati con Chlamydia muridarum, utilizzando il metodo qui presentato. Dopo la procedura di separazione completa, i linfociti sono stati colorati con fluorocromi coniugati CD3, CD4 e CD8. I dati erano quadrante gate sui linfociti CD3 +,mostrando CD4 + CD8 + con rispetto e la percentuale di cellule chiuse.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo, si mostra come preparare i linfociti da vie genitali del mouse ed è facilmente padronanza. Il punto più critico di questo processo è di mantenere la vitalità cellulare, mantenendo le cellule in ghiaccio. La quantità di cellule da questo metodo dipende dalla tecnica, manipolazione abilità, lo stato infettivo del mouse (ingenua o giorni dopo l&#39;infezione), il patogeno (batterica, virale, fungina) e la sezione del tratto riproduttivo murino esaminati (ovidotto, utero, segmento vaginale o l&#39;inte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma Life Sciences </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Scienze </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco da Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Superfici mucose, anche nel tratto gastrointestinale, urogenitale e respiratorio, fornire portali di ingresso per i patogeni, come virus e batteri 1. Mucose sono anche siti induttivi nell&#39;ospite per generare immunità contro patogeni, come i cerotti Peyers nel tratto intestinale e nasale associata tessuto linforeticolare nel tratto respiratorio. Questa caratteristica unica porta immunità mucosale come un giocatore fondamentale del sistema difesa ospite. Molti studi si sono concentrati sui siti della mucosa gastrointestinale e respiratorio. Tuttavia, vi è stata piccola indagine riproduttivi siti mucosali. La mucosa del tratto genitale è il sito di infezione primaria per le malattie sessualmente trasmissibili (MST), comprese le infezioni batteriche e virali. Malattie a trasmissione sessuale sono una delle sfide più critiche per la salute di fronte al mondo di oggi. Centri per il Controllo e la Prevenzione stima che ci sono 19 milioni di nuovi infetti ogni anno negli Stati Uniti. STDs costato il sistema sanitario degli Stati Uniti 17 miliardi dollari ogni anno 2, e gli individui dei costi ancora di più in immediate conseguenze per la salute e per tutta la vita. Per far fronte a questa sfida, una maggiore comprensione di riproduzione immunità mucosale è necessario e isolare i linfociti è una componente essenziale di questi studi. Qui, vi presentiamo un metodo per isolare in modo riproducibile da linfociti murini vie genitali femminili per gli studi immunologici che possono essere modificati per adattarsi ad altre specie. Il metodo descritto di seguito è basato su un mouse.

Un modo efficace per isolare i linfociti di topo tratto genitale è descritto. Questo metodo si avvale di digestione enzimatica e la separazione gradiente Percoll per consentire l&#39;isolamento efficiente. Questa tecnica è anche adattabile a per l&#39;uso in altre specie

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Le superfici mucose, comprese quelle dei tratti gastrointestinale, urogenitale e respiratorio, costituiscono porte d'ingresso per i patogeni, come i virus e...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i linfociti dal tratto riproduttivo del topo. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto l'intero tratto genitale e tritando il tessuto in piccoli pezzi per liberare i linfociti dal tessuto. Il tessuto finemente tritato viene digerito con collaghenasi otto e agitato vigorosamente a 37 gradi Celsius.Con un agitatore magnetico, i linfociti vengono quindi isolati mediante gradiente di densità cellulare. Infine, i linfociti possono essere caratterizzati mediante citometria a flusso. L'applicazione di questa tecnica si estende alla diagnosi e al trattamento delle malattie riproduttive. Poiché questo metodo ci consente di comprendere il comportamento dei linfociti tissutali, che spesso differiscono dai linfociti isolati dal sistema circolante.Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul sistema della mucosa riproduttiva, può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli della mucosa intestinale e respiratoria. Dopo l'eutanasia di un topo femmina, utilizzare forbici chirurgiche per praticare un'incisione mediana bassa, quindi aprire la pelle. Spostare delicatamente gli intestini di lato, identificare l'ucs e quindi isolare e

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Immunologia e Infezioni

Isolamento dei linfociti utilizzando il kit di Miltenyi MAC è un modo affidabile per purificare le cellule da tutta omogenati di tessuto linfoide. Cellule purificate utilizzando il sistema Miltenyi sono tipicamente ≥ 96% puro. Qui, le misure prese per isolare cellule T CD4 +, uno dei tanti kit offerto da Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei linfociti da un cerotto di Peyer di topo raccolto. I linfociti isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

Isolamento dei linfociti da un cerotto di Peyer di topo

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

L'isolamento delle cellule stromali dei linfonodi è una procedura a più fasi che include la digestione enzimatica e la disaggregazione meccanica per ottenere cellule reticolari fibroblastiche, cellule linfatiche ed endoteliali del sangue. Nella procedura descritta, una breve digestione è combinata con la disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la degradazione del marcatore di superficie delle cellule stromali linfonodali vitali.

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Descriviamo qui un protocollo per isolare le cellule mieloidi dalla pelle di topo e drenare i linfonodi dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti di Plasmodium. La citometria a flusso delle cellule raccolte fornisce un test affidabile per caratterizzare la risposta infiammatoria della pelle e drenante dei linfonodi al parassita.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

C'è un crescente interesse per la caratterizzazione quantitativa dei linfociti intestinali a causa del crescente riconoscimento che queste cellule svolgono un ruolo critico in una varietà di malattie intestinali e sistemiche. In questo protocollo, descriviamo come isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti dell'intestino tenue per la successiva caratterizzazione citofluorimetrica.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

I linfociti sono i principali attori nelle risposte immunitarie adattative. Qui, presentiamo un protocollo di purificazione dei linfociti per determinare le funzioni fisiologiche delle molecole desiderate nell'attivazione dei linfociti in vitro e in vivo. Le procedure sperimentali descritte sono adatte per confrontare le capacità funzionali tra linfociti di controllo e linfociti geneticamente modificati.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

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In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l'isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.

Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

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