Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Un modo efficace per isolare i linfociti di topo tratto genitale è descritto. Questo metodo si avvale di digestione enzimatica e la separazione gradiente Percoll per consentire l'isolamento efficiente. Questa tecnica è anche adattabile a per l'uso in altre specie

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i linfociti dal tratto riproduttivo del topo. Ciò si ottiene rimuovendo prima l'intero tratto genitale e tritando il tessuto in piccoli pezzi per liberare i linfociti dal tessuto. Il tessuto finemente tritato viene digerito con collagenasi otto e agitando vigorosamente il tessuto a 37 gradi Celsius.

Con un'agitazione magnetica, i linfociti vengono quindi isolati in base al gradiente per chiamata. In definitiva, i linfociti possono essere caratterizzati mediante citometria a flusso Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi e la terapia delle malattie riproduttive. Poiché questo metodo ci permette di comprendere il comportamento dei linfociti tissutali, che spesso sono diversi dai linfociti che isolati dal sistema circolante.

Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul sistema della mucosa riproduttiva, può essere applicato anche ad altri sistemi come i sistemi della mucosa intestinale e respiratoria. Dopo l'eutanasia di una topolina, usa le forbici chirurgiche per praticare un'incisione bassa sulla linea mediana e poi apri la pelle. Spostare delicatamente l'intestino da parte, identificare l'ucs, quindi isolare e rimuovere l'intero tratto genitale dall'ucs all'apertura vaginale.

Metti il tratto genitale in una capsula di Petri. Usa un paio di forbici per aprire l'intero tratto in senso longitudinale. Quindi trasferire il tessuto in una piastra di Petri con terreno RPMI 10 completo.

Ora taglia il tratto genitale in pezzi sottili, quindi trasferisci i pezzi in una fiaschetta contenente RPMI 10 e EDTA completi. Posizionare il pallone su un'agitazione magnetica e mescolare il tessuto due volte per 15 minuti a temperatura ambiente ogni volta per eliminare le cellule epiteliali dopo l'ultimo periodo di agitazione, scartare il surnatante e quindi versare i pezzi di tessuto attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri. Lavare via i residui di EDTA con un mezzo completo.

Ora trasferisci i pezzi di tessuto filtrato in un nuovo pallone con RPMI 10 fresco e collagenasi e digerisci i pezzi a 37 gradi Celsius sull'agitazione magnetica impostata per mescolare energicamente il tessuto dopo un'ora, versa il surnatante attraverso un colino cellulare da 100 micrometri in un tubo conico fresco da 50 millilitri e mantieni la sospensione cellulare filtrata sul ghiaccio. Aggiungere RPMI 10 fresco con collagenasi al pallone originale e mescolare il fazzoletto altre due volte utilizzando ogni volta RPMI 10 completo e collagenasi freschi. Dopo la terza digestione, nella soluzione non devono essere presenti pezzi di tessuto visibili.

Ora, riunisci i surnatanti delle tre digestioni. Far girare le celle per cinque minuti a 410 Gs e quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante. Iniziare sospendendo nuovamente il pellet cellulare in una soluzione fresca al 40% per chiamata.

Aggiungere la sospensione cellulare con il 40% per chiamata in un tubo sfumato, quindi stendere con cura e uguale volume di appena preparato. 70% per chiamata. Centrifugare ora i campioni di gradiente per 20 minuti a temperatura ambiente con la pausa.

Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura i linfociti nello strato di interfaccia tra i gradienti di perolo. Quindi lavare le celle recuperate con RPMI da uno a tre per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, dopo aver eliminato il supponante, risospendere i linfociti nella soluzione appropriata secondo la procedura sperimentale desiderata.

Questo dot plot è un esempio di una popolazione di linfociti che è stata isolata dal tratto genitale di un topo infetto per via intravaginale da clamidia uredermica. Sette giorni dopo l'infezione, la sospensione a singola cellula è stata bloccata su linfociti positivi CD tre e analizzata per le cellule che esprimono CD quattro e CD otto dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada al ricercatore per esplorare la funzione dei linfociti riproduttivi e le caratteristiche cellulari in un modello di malattia virale del topo che imita le malattie umane.