Name: Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente In situ Ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Impara a combinare l'incorporazione di BrdU con la ibridazione in situ fluorescente per analizzare quantitativamente la tempistica di replicazione dei cromosomi nei mammiferi. Questo metodo consente confronti diretti tra cromosomi riarrangiati e normali nella stessa cellula.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Cancer Institute, CA131967.

1. Incorporazione di BrdU (Etichettatura Terminal) <ol><li> Cellule piastra per circa il 70% di confluenza di 150 mm in coltura tissutale piatto 24 ore prima dell&#39;aggiunta di BrdU. </li><li> Sostituire il supporto con nuovi mezzi completi contenenti 20 mg / ml di BrdU (Sigma) ad intervalli di tempo appropriati prima del raccolto. La lunghezza del tempo cellule vengono coltivate in mezzi con BrdU varierà con il tipo di cella e specie, tipicamente la fase G2 dura tra 2 e 5 ore (Figura 1). </li></ol> 2. Harvest Cromosoma di colture monostrato Celle <ol><li> Rimuovere terreni di coltura dalla piastra e raccogliere 10 ml in una provetta da centrifuga 15 ml. Gettare materiale rimanente. </li><li> Risciacquare le cellule una volta con 10 ml Versine [o HBSS (Sigma)]. </li><li> Aggiungere 5 ml di tripsina 0,25% in Versine (o HBSS) alla piastra. Incubare a temperatura ambiente fino a quando le cellule vengono staccate dalla piastra. </li><li> Aggiungi sospensione tripsinizzate cella a tubo contenente i 10 ml di mezzi di comunicazione a partire dal punto 2.1. &lt;/ Li&gt; <li> Centrifugare a 400 xg per 10 minuti per ottenere il pellet. Aspirare il surnatante, lasciando 0,5 ml di supporti più il pellet di cellule. </li><li> Risospendere le cellule a fondo pipettando con una pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungere 3 gocce di soluzione ipotonica (0,075 M KCl (Sigma) riscaldato a 37 ° C); miscelare la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur. Aggiungere 0,5 ml di soluzione ipotonica e miscelare di nuovo con una pipetta Pasteur. Portare il volume di soluzione ipotonica a 5 ml e mescolare nuovamente. Incubare a 37 ° C per 20-45 minuti, a seconda del tipo di cellula. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min. Aspirare il surnatante, lasciando 0,5 ml di supporti più il pellet di cellule. </li><li> Risospendere il pellet di cellule delicatamente muovendo il tubo. Le cellule osmoticamente gonfie sarà fragile, a questo punto, per cui occorre prestare attenzione a non disturbare le membrane citoplasmatiche. </li><li> Aggiungere 3 gocce di fissativo di Carnoy (1:3 acido acetico glaciale: Metanolo); mescolare delicatamente con una pipetta Pasteur pipette. Aggiungere 0,5 ml di fissativo e mescolare pipettando gentilmente con una pipetta Pasteur. Portare il volume di fissativo a 5 ml e mescolare ancora pipettando gentilmente con una pipetta Pasteur. Cellule fisse possono essere conservate al buio a -20 ° C per diversi mesi. </li><li> Centrifugare e aspirare, come al punto 2.8. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in fissativo fresco; stimare il volume del pellet e aggiungere ~ 10 volte il volume del fissativo di Carnoy. </li><li> Aggiungere la sospensione cellulare e goccia a goccia sul bagnato, gelide vetrini da microscopio; tenere il vetrino a un angolo di ~ 45 ° e consentire la sospensione cellulare a scorrere sulla superficie del vetrino. Appoggiare il vetrino piatto su carta assorbente e inondare il vetrino con fissativo e lasciare asciugare all&#39;aria. Controllare vetrini per la presenza di spread mitotiche utilizzando un microscopio invertito. </li></ol> 3. RNasi trattamento e disidratazione etanolo <ol><li> Posto 200 pl di 10 pg / ml RNasi A (Sigma) in 2x SSC a ciascun vetrino; incubare a 37 &amp; deg; C per 1 ora. </li><li> Lavare i vetrini 3 volte con 2x SSC, 7,0 pH a temperatura ambiente per 3 min ciascuna. </li><li> Disidratare diapositive attraverso un (Sigma) serie EtOH (70%, 90% e 100%) a temperatura ambiente per 3 min ciascuna. </li><li> Far asciugare i vetrini a temperatura ambiente. </li></ol> 4. Preparazione di cocktail di misura per BAC Inoltre cromosomica specifica Centromero Enumerazione Probe (CEP) o per le vernici intero cromosoma ibridazione in situ <ol><li> Per la BAC / CEP ibridazione simultanea, preparare due cocktail sonda separata per la pre-ibridazione. Abbiamo trovato che la pre-ibridazione le sonde BAC e CEP separatamente in diversi risultati stringencies in meno background e intensità di segnale maggiore. Abbiamo anche trovato che Fosmids individuali possono anche essere utilizzati al posto di cloni BAC. La formulazione cocktail descritto di seguito rappresenta i volumi per una singola diapositiva. Se l&#39;elaborazione più diapositive utilizzando le sonde stesse semplicemente aumentare la appropr volumi<html> iately. * BAC DNA della sonda cocktail: 11,5 microlitri tampone di ibridazione (50% formammide (Sigma) / 2x SSC / destrano solfato (Sigma)) 2 microlitri dH 2 O 2,5 microlitri BAC/Cot1 DNA in dH 2 O (vedi sotto per l&#39;etichettatura di protocollo) volume di 15 microlitri totale * CEP sonda cocktail: 7 CEP microlitri tampone di ibridazione (65% Formamide/2x SSC / destrano solfato) 2 microlitri dH 2 O 1 DNA microlitri CEP/Cot1 (acquistato prelabeled con Spectrum Orange/Cy3/Texas Rosso) 10 microlitri di volume totale * Dopo la denaturazione e pre-ibridazione (punto 5.1) mix BAC sonda con CEP sonda ad un rapporto 3:2 25 cocktail sonda pl / diapositive e mescolare. O </li><li> Aliquotare 20 pl / slide di sonda tutto vernice Cromosoma (Cy3/Texas rosso) in una provetta. Procedere alla denaturazione e pre-ibridazione passo. </li></ol>&quot;&gt; 5. Slide e sonda Denaturazione e ibridazione in situ <ol><li> Denaturare sonda cocktail (s) a 75 ° C per 10 min. Pre-ibridizzano a 37 ° C per 30 minuti per consentire la Cot1 DNA di ibridarsi a sequenze ripetitive e prevenire ibridazione successiva alla metafase cromosomi. </li><li> Diapositive denaturate in vaschette Coplin nel 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 a 72 ° C per 3 min. </li><li> Immediatamente disidratare diapositive attraverso una serie EtOH (70%, 90% e 100%) in vaschette Coplin a 4 ° C per 3 min ciascuna. </li><li> Lasciare i vetrini per asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Pre-riscaldare vetrini a 45 ° C sul vetrino più caldo per gli ultimi 10 minuti della sonda pre-hybridzation (passo 5.1). Mescolare pre-ibridizzati cocktail sonda se necessario, e aggiungere 25 ul per ogni diapositiva, posizionare con cura un coprioggetto su ogni diapositiva e la guarnizione lungo tutti i bordi con mastice. Incubare per una notte a 37 ° C in una camera umidificata per evitare l&#39;evaporazione. </li></ol><ol><li> Lavare i vetrini in vaschette Coplin 3 volte nel 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 a 38-40 ° C per 3 minuti ciascuno. La temperatura dei lavaggi può variare tra sonde. Se c&#39;è ibridazione fondo elevato è possibile aumentare la temperatura dei lavaggi. Viceversa, se il segnale è debole e non c&#39;è sfondo allora si può diminuire la temperatura di questi lavaggi. </li><li> Lavare i vetrini 1 volta in tampone PN a temperatura ambiente per 3 min, e procedere alla fase di rilevamento BrdU. </li></ol> 7. BrdU rilevamento <ol><li> Vetrini con tampone di blocco PNM per 10 min (200 pl / vetrino) a temperatura ambiente al buio. </li><li> Scaricare diapositive attivando bordo su un tovagliolo di carta. Aggiungere 100 ml di anti-BrdU-FITC (50 pg / ml Roche o Millipore) in tampone PNM per 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in tampone PN a temperatura ambiente per 3 min ciascuna. </li><li> Drenareeccesso di tampone PN sulle diapositive uno alla volta ruotando sul bordo su un tovagliolo di carta. Aggiungere 20 microlitri DAPI / antifade soluzione di montaggio (Invitrogen). Coprire il vetrino con un tovagliolo di carta e premere verso il basso sul vetrino per far fuoriuscire le bolle d&#39;aria e l&#39;eccesso di soluzione di montaggio. Procedere con l&#39;analisi delle immagini. </li></ol> 8. Catturare Immagini e Quantificazione incorporazione BrdU <ol><li> Le immagini vengono acquisite con un microscopio a fluorescenza Olympus BX61 e Olympus CCD, obiettivo 100x, filtro automatico ruote e software Cytovision (Applied Imaging). BrdU viene catturato con un FITC filtro; vernici cromosomiche (Texas Red, Metasystems o Cytocell), BAC (Cy3) e CEP (Vysis Spectrum Orange) sonde sono state acquisite utilizzando un rosso Texas o Cy3 filtro; DAPI viene catturato con un filtro DAPI (vedi le figure 2 e 3). </li><li> Cromosomi individuali di interesse sono identificati con BAC / CEP o cromosoma sonde specifiche vernici (Figure 2B e 3B). Utilizzandoil software Cytovision, ciascun cromosoma di interesse &quot;cut-out&quot; dalla diffusione metafase nel suo complesso, una linea disegnata attraverso il lungo la lunghezza del cromosoma dal braccio corto a braccio lungo (Figure 2C e 3C). Il software Cytovision viene utilizzato per quantificare il profilo di intensità di pixel lungo la lunghezza di ciascun cromosoma. Il software Cytovision calcola l&#39;area occupata dai pixel e quantifica l&#39;intensità dei pixel rappresentate dai segnali BrdU o DAPI di ciascun cromosoma isolato. L&#39;intensità dei pixel media rappresentata da ciascun cromosoma viene quindi moltiplicata per l&#39;area occupata da quei pixel per ottenere il numero totale di pixel (Tabella 1 e Figura 4). Inoltre, questo protocollo permette la visualizzazione delle ultime regioni replicazione dei cromosomi. Di conseguenza, il modello a bande di incorporazione di BrdU permette l&#39;individuazione delle regioni replicazione attiva di cromosomi, e differenze di temporizzazione replica tra chromosome coppie sono visti come differenze in questo pattern di bande (figure 2 e 3). Infine, le differenze nei modelli di legame può essere paragonato a mappe replica noti temporizzazione per ciascun cromosoma 6,7, che consente una stima della differenza temporale tra replica cromosomi omologhi o bracci cromosoma 4. Ad esempio, i due cromosoma 6 è in Figura 3A presentano una differenza in bande schema di&gt; 2 ore rispetto ai tempi di replica normale del cromosoma 6 4. Inoltre, una procedura simile a quella descritta qui è stato usato con successo per lo studio della temporizzazione replica asincrona tra i cromosomi X inattiva ed attiva 8,9. I cromosomi X attivi e inattivi sono stati identificati utilizzando vernici cromosoma X. Le immagini sono state acquisite utilizzando Quips mFISH software (Vysis) e il numero di pixel occupati dai cromosomi X e il numero di pixel occupati da fluorescentemente laBeled BrdU sono stati poi calcolati utilizzando NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Nick Traduzione di BAC del DNA per l&#39;etichettatura fluorescente (Vysis) <ol><li> Aggiungere la seguente miscela di sonde refrigerate una provetta per microcentrifuga: 70 microlitri (4 mg DNA) in dH 2 O 10 microlitri 0,2 mM dUTP-arancione o verde 20 pl 0,1 mM dTTP 20 pl 10x Nick Traduzione Buffer 40 microlitri NT dNTP (meno dTTP) 40 ml nick traduzione enzima 200 microlitri di volume totale Incubare @ 16 ° CO / N. Fermare la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 10 min. Raffreddare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Precipitare il DNA con etanolo aggiungendo la seguente miscela di sonde: 200 microlitri soluzione della sonda 48 microlitri 3 M NaOAc 160 microlitri Cot1DNA (0,25 mg / ul) 1200 microlitri EtOH 100% </li><li> Conservare a -80 ° C per 10 min a O / N. </li><li> Spin in fredda a 12.000 xg per 20 min. Decantare EtOH. Lavare 1 volta con il 70% EtOH. Spin come prima. Decantare EtOH. Asciugare solo fino evapora EtOH. Risospendere in 40 microlitri dH 2 O per la concentrazione finale di 100 ng / ml di BAC DNA. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
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<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
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<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La preparazione degli spread cromosoma è un passo fondamentale per il successo di replica-timing saggio descritto qui. L&#39;inclusione di una fase di pretrattamento Colcemid prima del trattamento ipotonico può facilitare la frequenza e la diffusione delle cellule mitotiche. Abbiamo tipicamente esporre le cellule ad colcemdi per 1-3 ore prima del raccolto, e utilizzare Colcemid ad una concentrazione finale di 10 ug / ml. Tuttavia, l&#39;inclusione di una fase di pretrattamento Colcemid può modificare la lunghezza di G2 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 pg / pl </td></tr><tr><td> Nick Traduzione Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Arancione dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varia </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP ibridazione tampone </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP ibridazione tampone </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Cromosoma painti </td><td> MetaSystems Gruppo </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio di imaging del software di sistema </td><td> Applied Imaging </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Macchina fotografica digitale </td><td> Olimpo </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> RICETTE IN ibridazione in situ Soluzioni Formammide 70% Formamide/2x SSC 35 ml di formammide * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 con HCl (Sigma) * E &#39;importante utilizzare formammide che è stato conservato a -20 ° C. Prolungata conservazione a temperatura ambiente genera acido formico e il w pHill essere troppo bassa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH a 7,0 con HCl (Sigma) SSC 20x, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na citrato (Sigma) dH 2 O a volume PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Effettuare una soluzione 0,1 M di fosfato di sodio ogni (Filtro sterilizzare e conservare in 500 ml aliquote). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g di NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O a volume 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g di NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O a volume. PN: Regolare il pH di 0,1 M Na 2 HP0 4 a pH 8,0 con 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtro sterilizzare e aggiungere 1 ml di NP-40. PNM 50 ml 1.25 g non grassi del latte secco (Sigma) 25 ml tampone PN (ricetta sopra) Mescolare per 15-20 minuti mescolando costantemente. Spin 2 volte a 400 xg per 10 min. Utilizzare il surnatante, e fare attenzione a non disturbare proteine ​​del latte precipitate. </td></tr></tbody></table>

cromosoma timing replica combinazione con fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Replicazione del DNA di mammifero avvia in siti multipli lungo cromosomi in momenti diversi durante la fase S, seguendo un programma di replica temporale. La specifica dei tempi di replica è pensato per essere un processo dinamico regolato da stimoli tessuto-specifiche e di sviluppo che sono sensibili alle modificazioni epigenetiche. Tuttavia, i meccanismi che regolano dove e quando la replicazione del DNA inizia lungo cromosomi rimane poco chiaro. Cromosomi omologhi di solito replicare in modo sincrono, ma ci sono eccezioni a questa regola. Per esempio, in cellule di mammifero femmina uno dei due cromosomi X diventa tardiva replica attraverso un processo noto come inattivazione X 1. Insieme a questo ritardo nella temporizzazione replica, stimato a 2-3 ore, la maggior parte dei geni diventano trascrizionalmente tacere su un cromosoma X. In aggiunta, una discreta azione cis locus, noto come il centro inattivazione X, regola questo processo di inattivazione X, compresi thinduzione e dei tempi di replica ritardata sul cromosoma X inattivo intero. Inoltre, alcuni riarrangiamenti trovano nelle cellule tumorali e cellule esposte a radiazioni ionizzanti visualizzare un significativo ritardo nella temporizzazione replica di&gt; 3 ore che interessa l&#39;intero cromosoma 2,3. Un recente lavoro del nostro laboratorio indicano che l&#39;alterazione di discreta azione cis autosomica risultato loci in un fenotipo estremamente tardiva replica che interessa l&#39;intero cromosoma 4. Ulteriori studi &#39;di ingegneria cromosomica&#39; indicano che alcuni riarrangiamenti cromosomici che interessano molti risultati diversi cromosomi in questa anomala replica-timing fenotipo, suggerendo che tutti i cromosomi di mammifero contengono discrete cis-che agiscono loci che controllano tempistica corretta replicazione dei cromosomi individuali 5. Qui, presentiamo un metodo per l&#39;analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica combinato con ibridazione in situ fluorescente. Questometodo consente un confronto diretto di temporizzazione replica tra cromosomi omologhi all&#39;interno della stessa cella, ed è stato adattato da 6. Inoltre, questo metodo consente l&#39;identificazione univoca di riarrangiamenti cromosomici che correlano con modifiche nei tempi di replica che interessano l&#39;intero cromosoma. Questo metodo ha dei vantaggi rispetto recentemente sviluppato un elevato throughput di micro-array o sequenza protocolli che non è possibile distinguere tra alleli omologhi presenti sul riarrangiati e poco risistemato cromosomi. Inoltre, poiché il metodo descritto qui valuta singole cellule, si può rilevare variazioni di temporizzazione sulla replicazione cromosomica riarrangiamenti cromosomici che sono presenti in una frazione di cellule in una popolazione.

Un esempio di analisi replica temporizzazione per cromosoma umano 6 è mostrato in Figura 2. Cellule contenenti una delezione del gene ASAR6 4, situato in 6q16.1, sono stati esposti a BrdU per 5 ore, le cellule raccolte per mitotici e trattati per FISH con sonda cromosoma 6 vernice (Vysis) e per incorporazione di BrdU. Notare che vi è una differenza significativa nella configurazione BrdU bande tra i due 6, che è coerente con un ritardo nella temporizzazione replica di&gt; 2 ore per uno dei il...

Un metodo per l&#39;analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica è descritto. Il metodo utilizza incorporazione di BrdU in combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per valutare la tempistica replicazione dei cromosomi di mammifero. Questa tecnica permette il confronto diretto dei cromosomi riarrangiati e un-riarrangiato all&#39;interno della stessa cella.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Questo approccio sperimentale combina l'incorporazione di BRDU con l'ibridazione fluorescente in situ. Per analizzare quantitativamente i tempi di replicazione dei cromosomi mammiferi. Innanzitutto, incorporare BRDU in cellule vive ed isolare i cromosomi in metafase.Quindi eseguire l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) del DNA combinata con una colorazione sequenziale dell'anticorpo anti-BRDU per identificare i singoli cromosomi replicanti. Successivamente, utilizzare la microscopia fotografica per acquisire immagini dei segnali FISH e dell'incorporazione di BRDU in singole figure mitotiche. Mediante il software CytoVision, calcolare l'area e l'intensità dei pixel rappresentati dai segnali BRDU o DPI su ciascun cromosoma isolato.I risultati possono quantificare e confrontare l'incorporazione di BRDU nei singoli cromosomi riarrangiati e nei loro olosomi. Poiché il metodo qui descritto valuta singole cellule, è in grado di rilevare variazioni nel tempo di replicazione associate a riarrangiamenti cromosomici presenti solo in una frazione delle cellule di una popolazione, a differenza dei recenti protocolli ad alto rendimento basati su microarray e sequenziamento del DNA. Questo metodo consente un confronto diretto tra cromosomi omologhi presenti nella stessa cellula.Ha inoltre la capacità di identificare in modo univoco le riarrangiamenti cromosomici che influenzano la replicazione cromosomica. Il momento di esecuzione per interi cromosomi che illustra la procedura sarà Leslie Smith. Un ricercatore associato nel mio laboratorio semini le cellule a circa il 70% di confluenza in una piastra per colture cellulari da 150 millimetri e le collochi nell'incubatore cellulare per 24 ore al momento appropriato.Punti precedenti al prelievo. Rinnovare il mezzo con mezzo completo fresco contenente 10 microgrammi per millilitro di BRDU. La durata della coltura cellulare in presenza di BRDU varia a seconda del tipo cellulare e della specie.Normalmente, la fase G2 dura da due a cinque ore. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra, conservando 10 millilitri in un tubo conico da 15 millilitri per centrifuga. Lavare le cellule con 10 millilitri di sine e rimuovere il residuo di sine mediante aspirazione a vuoto.Quindi aggiungere cinque millilitri di tripsina 0,25% e incubare a temperatura ambiente fino al distacco delle cellule dalla piastra. Raccogliere le cellule e trasferire la sospensione in 10 millilitri di mezzo riservato. Centrifugare per formare il pellet cellulare, quindi aspirare tutto il mezzo tranne 0,5 millilitri.Ora risospendere completamente le cellule utilizzando una pipetta per farle gonfiare osmoticamente; aggiungere tre gocce di cloruro di potassio 75 millimolare, riscaldato a 37 gradi Celsius, e mescolare la sospensione cellulare con una pipetta. Successivamente, aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di soluzione ipotonica. Portare ora il volume totale della soluzione ipotonica a cinque millilitri e mescolare mediante pipettaggio.Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 20-45 minuti, a seconda del tipo di cellule. Incubare i tubi in posizione inclinata per mantenere le cellule in sospensione. Quindi centrifugare a 400 ×g per 10 minuti.Aspirare tutto tranne 0,5 millimetri del soprannatante e utilizzare una pipetta Pasteur per risospendere delicatamente il pellet cellulare. A questo punto, le cellule gonfiate osmoticamente saranno fragili, quindi è necessario fare attenzione a non danneggiare le membrane citoplasmatiche. Successivamente, aggiungere tre gocce di carnois, fissativo, e mescolare delicatamente.Dopo aver aggiunto ulteriori 0,5 millilitri di fissativo, portare il volume del fissativo a cinque millilitri e pipettare per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Queste cellule fissate possono essere conservate al buio a meno 20 gradi Celsius per diversi mesi. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione, aspirare il fissativo e risospendere il pellet in 10 volumi di fissativo mantenuto su ghiaccio bagnato e freddo al microscopio.Posizionare il vetrino a un angolo di circa 45 gradi. Aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia per distribuirla uniformemente. Ricoprire il vetrino con il fissativo ed eliminare l'eccesso.Quindi posizionare il vetrino orizzontalmente su carta assorbente per farlo asciugare all'aria. Valutare i campioni alla ricerca di allargamenti mitotici utilizzando un microscopio invertito. Aggiungere due microlitri di 10 microgrammi per millilitro di RNAs A in due XSSC su ogni vetrino e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.Eseguire tre lavaggi di tre minuti ciascuno con due XSSC a pH 7,0 a temperatura ambiente. Quindi disidratare i campioni mediante una serie di etanoli a temperatura ambiente per tre minuti. Successivamente, far asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente in un microtubo refrigerato.Aggiungere quattro microgrammi di substrato di DNA con nucleotide marcato, tampone di traduzione NIC 10X, mix di DNTP e enzima di traduzione NIC. Incubare la reazione a 16 gradi Celsius durante la notte, quindi riscaldare a 70 gradi Celsius per 10 minuti per arrestare la reazione. Successivamente, raffreddare in ghiaccio per cinque minuti.Ora, per precipitare l'acido desossiribonucleico con etanolo, aggiungere 48 microlitri di acetato di sodio tre molar, 160 microlitri di 0,25 microgrammi per microlitro di cot 1D NA e 1,2 millilitri di etanolo al 100%. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius per 10 minuti fino a tutta la notte per precipitare il DNA mediante centrifugazione e lavare il pellet con etanolo al 70%. Sospendere il sonda di DNA essiccato all'aria in 40 microlitri di acqua bidistillata per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per microlitro di DNA marcato per l'ibridazione simultanea back SEP. Preparare due cocktail di sonda separati contenenti cot 1D NA come descritto nel manoscritto allegato.Denaturare i cocktail di sonde a 75 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per bloccare il cot 1D NA alle sequenze ripetitive. Ora combinare la sonda di blocco con la sonda S in un rapporto di tre a due, utilizzando 25 microlitri per campione.Fai scivolare accanto per denaturare i campioni. Immergi i vetrini in 70% formammide in due XSSC a 72 gradi Celsius e incuba per tre minuti. Disidrata immediatamente i campioni mediante una serie di etanolo a quattro gradi Celsius per tre minuti.Lasciare asciugare all'aria ogni campione a temperatura ambiente per circa 10 minuti prima del completamento della preparazione della sonda. Equilibrare i vetrini su un termopiatto regolato a 45 gradi Celsius. Quindi aggiungere 25 microlitri della miscela della sonda back S.Posizionare delicatamente un coprioggetto su ogni vetrino e sigillarne tutti i bordi con cemento di gomma per la fase di ibridazione. Incubare i campioni per tutta la notte a 37 gradi Celsius in una camera umidificata. Eseguire tre lavaggi post-ibridazione di tre minuti ciascuno in 50%IDE due XSSC pH 7,0 a una temperatura compresa tra 38 e 40 gradi Celsius.La temperatura ottimale dei lavaggi dipende dalla sonda. Se si verifica un'elevata ibridazione di fondo, aumentare la temperatura dei lavaggi. Al contrario, se il segnale della sonda è debole e non è presente alcun fondo, ridurre la temperatura dei lavaggi.Eseguire un lavaggio con tampone PN a temperatura ambiente per tre minuti. Per la rilevazione di BRDU, aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante PNM su ciascun vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi asciugare i vetrini su carta assorbente.Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo coniugato anti B-R-D-U-F-E a 50 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Eseguire tre lavaggi di tre minuti ciascuno in tampone PN a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone PN in eccesso da ogni vetrino.Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di montaggio dappy Antifa. Coprire il vetrino con un tovagliolo di carta e premere delicatamente sul coprioggetto per eliminare le bolle d'aria e l'eccesso di soluzione di montaggio. Acquisire le immagini mediante un microscopio a fluorescenza collegato a una telecamera CCD.Utilizzare l'obiettivo 100x, la ruota automatica dei filtri e il software Cyto Vision per acquisire BRDU mediante un filtro fitzy e i cromosomi marcati e le sonde centromeriche mediante un filtro side three o Texas red. Utilizzare inoltre un filtro dappy per la colorazione dei nuclei. Identificare i singoli cromosomi di interesse con sonde EP o sonde specifiche per cromosoma mediante il software Cyto Vision.Ritagliare ciascun cromosoma di interesse dall'assetto metafasico come un'unità unica. Copiare e incollare le immagini dei cromosomi DPI e FITZY in una nuova finestra. Selezionare l'icona del grafico nel menu degli strumenti, che consente di generare un grafico rappresentante l'area e l'intensità della colorazione Fitz e dappy lungo ciascun cromosoma singolo.Questo viene fatto tracciando una linea lungo tutta la lunghezza del cromosoma, dal braccio corto a quello lungo. Nel menu degli strumenti, selezionare l'icona dei dati e generare una tabella che mostri l'area e l'intensità calcolate per ZI e dpi. Successivamente, selezionare i segnali ZI e DPI per i cromosomi di interesse.Quindi fare clic sui pulsanti intensità e area sull'icona della tabella. Il software genera una misurazione numerica di pixel per pollice quadrato per ogni segnale. Successivamente, l'intensità media dei pixel di ciascun cromosoma viene moltiplicata per l'area occupata da tali pixel.Per ottenere il numero totale di pixel per la visualizzazione delle regioni cromosomiche che si replicano più recentemente, valutare il profilo di incorporazione di BRDU per le regioni cromosomiche attivamente replicanti. Quindi calcolare le differenze nei tempi di replicazione tra coppie di cromosomi in base alle differenze nel profilo di bandeggiatura di BRDU. I cromosomi nelle cellule di mammifero si replicano secondo un programma temporale, nel quale la replicazione precoce e tardiva avviene rispettivamente all'inizio e alla fine della fase S.Una fase S tipica nelle cellule di mammifero dura da otto a dieci ore, e la fase G2 di solito dura da due a cinque ore. In questo sistema sperimentale, il BRDU viene aggiunto per periodi di tempo crescenti per etichettare le ultime porzioni dei cromosomi che si replicano; queste cellule presentano una delezione del gene umano ASAR6 localizzato in 6q16.1. Dopo un trattamento di cinque ore con BRDU, le cellule mitotiche sono state raccolte ed elaborate per rilevare l'incorporazione di BRDU e mediante ibridazione fluorescente in situ utilizzando una sonda cromosoma 6 "paint"; i due cromosomi 6 mostrano tre etichette fluorescenti.La differenza significativa nel profilo di bandeggio di BRDU è coerente con il ritardo nei tempi di replicazione di oltre due ore per uno dei cromosomi sei. Il software Cyto vision mostra i profili di intensità del segnale differente per DPI e BRDU sui due cromosomi sei, indicativi di una replicazione asincrona. Inoltre, vi è una differenza significativa nella quantità totale di incorporazione di BRDU rispetto a un'analisi simile della colorazione DPI.L'inclusione di una sonda inversa contenente il gene umano AR sei evidenzia il singolo cromosoma sei che presenta una delezione sul suo braccio lungo in questa cellula. Curiosamente, si osserva un incorporamento più intenso di BRDU e un modello di bandeggiatura più esteso rispetto al cromosoma sei non-ED. Quando gli strisci mitotici di sette cellule diverse sono stati analizzati per la quantificazione della differenza nei tempi di replicazione tra i cromosomi sei.I livelli di BRDU mostrano una differenza superiore a due volte rispetto ai valori totali di pixel tra le coppie cromosomiche sei eliminate e quelle non-ED. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita correttamente in tre giorni. Speriamo che ora abbiate una chiara comprensione di come misurare la replicazione, il momento di replicazione dei cromosomi omologhi presenti all'interno della stessa cellula e di come identificare in modo univoco riarrangiamenti cromosomici correlati a modifiche nella replicazione.Tempistica di interi cromosomi.

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Biologia

Fonte: Schumacher, D., e Sogaard-Andersen, L. Imaging a fluorescenza delle cellule vive dell'intero ciclo cellulare vegetativo del batterio sociale a lenta crescita Myxococcus xanthus. J. Vis. Esp. (2018)Questo video dimostra l'uso dell'imaging delle cellule vive per tracciare le origini cromosomiche marcate con fluorescente durante la divisione cellulare batterica. Cattura la dinamica della segregazione cromosomica utilizzando microscopia a contrasto di fase a tempo e fluorescenza.

Imaging a time-lapse della segregazione cromosomica in batteri marcati con fluorescenza

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Abbiamo sviluppato un protocollo di ibridazione fluorescente in situ (FISH) facilmente personalizzabile e specifico per il filamento combinato con l'immunofluorescenza. Ciò consente un esame dettagliato della dinamica dell'RNA con una visione simultanea della struttura della cromatina, dell'organizzazione nucleare e della regolazione trascrizionale a livello di singola cellula.

Veloce fluorescente In Situ Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione

Qui, presentiamo un metodo semplice per eseguire l'ibridazione in situ del DNA a fluorescenza (DNA ISH) per visualizzare sequenze eterocromatiche ripetitive su cromosomi montati su vetrini. Il metodo richiede un numero minimo di reagenti ed è versatile per l'uso con sonde corte o lunghe, tessuti diversi e per la rilevazione con segnali basati sulla fluorescenza o non sulla fluorescenza.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

Descriviamo qui un sistema che utilizza un blocco proteico in vivo reversibile sito-specifico per bloccare e collassare le forcelle di replicazione in Escherichia coli. La creazione del blocco di replicazione viene valutata mediante microscopia a fluorescenza e l'elettroforesi su gel di agarosio bidimensionale neutro-neutro viene utilizzata per visualizzare gli intermedi di replicazione.

Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato  Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Questo protocollo descrive un'applicazione di fluorescenza a singola molecola in ibridazione situ (smFISH) per misurare la cinetica in vivo della sintesi e della degradazione dell'mRNA.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina.  Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).

Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri

Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Impara a combinare l'incorporazione di BrdU con la ibridazione in situ fluorescente per analizzare quantitativamente la tempistica di replicazione dei cromosomi nei mammiferi. Questo metodo consente confronti diretti tra cromosomi riarrangiati e normali nella stessa cellula.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

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