Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente In situ Ibridazione

Questo approccio sperimentale combina l'incorporazione di BRDU con l'ibridazione fluorescente in C due. Analizzare quantitativamente i tempi di replicazione dei cromosomi dei mammiferi. Innanzitutto, incorporare BRDU nelle cellule vive e raccogliere i cromosomi in metafase.

Quindi eseguire il DNA fish combinato con la colorazione sequenziale degli anticorpi BRDU per identificare i singoli cromosomi replicanti. Successivamente, utilizzare la microscopia fotografica per acquisire immagini dei segnali dei pesci e dell'incorporazione di BRDU nelle singole figure mitotiche. Utilizzando il software di visione cito, calcolare l'area e l'intensità dei pixel rappresentati dai segnali BRDU o DPI su ciascun cromosoma isolato.

I risultati possono quantificare e confrontare l'incorporazione di BRDU nei singoli cromosomi riarrangiati e nei loro ologrammi. Poiché il metodo qui descritto valuta le singole cellule, ha la capacità di rilevare i cambiamenti nella replicazione, i tempi sui riarrangiamenti cromosomici che sono presenti solo in una frazione delle cellule di una popolazione rispetto ai protocolli di sequenziamento del DNA e dei microarray ad alto rendimento sviluppati di recente. Questo metodo consente un confronto diretto dei cromosomi omologhi che risiedono all'interno della stessa cellula.

Ha anche la capacità di identificare in modo inequivocabile i riarrangiamenti cromosomici che influenzano la replicazione cromosomica. La tempistica di interi cromosomi che dimostreranno la procedura sarà Leslie Smith. Un ricercatore associato nel mio laboratorio semina le cellule a circa il 70% di confluenza in un piatto di coltura tissutale da 150 millimetri e le pone in un incubatore cellulare per 24 ore al momento opportuno.

Punti prima della raccolta. Rifornire il terreno con un terreno completo fresco contenente 10 microgrammi per millilitro. BRDU. Il periodo di tempo in cui le cellule vengono coltivate in terreni con BRDU varia a seconda del tipo di cellula e della specie.

In genere, la due fasi G dura tra le due e le cinque ore. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra, conservando 10 millilitri in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Sciacquare le celle con 10 millilitri di seno e rimuovere il seno rimanente mediante aspirazione a vuoto.

Quindi aggiungere cinque millilitri di tripsina allo 0,25% e incubare a temperatura ambiente fino a quando le cellule non si staccano dalla piastra. Raccogliere le cellule e trasferire la sospensione nei 10 millilitri di terreno riservato. Pellettare le celle mediante centrifugazione, aspirare tutto tranne 0,5 millilitri di terreno.

Ora sospendere accuratamente le cellule utilizzando un passato di pipetta per gonfiare osmoticamente le cellule, aggiungere tre gocce di cloruro di potassio da 75 millimolari riscaldato a 37 gradi Celsius e mescolare la sospensione cellulare con un passato di pipetta. Quindi incorporare altri 0,5 millilitri di soluzione ipotonica. Portare ora il volume totale della soluzione ipotonica a cinque millilitri e mescolare mediante pipettaggio.

Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 20-45 minuti a seconda del tipo di cellula. Incubare le provette inclinate per mantenere le cellule in sospensione. Quindi centrifugare a 400 volte G per 10 minuti.

Aspirare tutto tranne 0,5 millimetri di surnatante e utilizzare una pipetta di agitazione passata per sospendere delicatamente la tavolozza cellulare. Le cellule osmoticamente gonfie saranno fragili a questo punto, quindi è necessario prestare attenzione a non interrompere le membrane citoplasmatiche. Successivamente, aggiungere tre gocce di rumore dell'auto, fissativo e mescolare delicatamente.

Dopo aver incorporato altri 0,5 millilitri di fissativo, portare il volume del fissativo a cinque millilitri e pipettare in una sospensione cellulare omogenea. Queste celle fisse possono essere conservate al buio a meno 20 gradi Celsius per diversi mesi. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione, aspirare il fissativo e risospendere il pellet in 10 volumi di fissativo tenendo un microscopio ghiacciato bagnato.

Far scorrere con un angolo di circa 45 gradi. Aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia per diffondere la sospensione cellulare. Inondare il vetrino con il fissativo e scolare l'eccesso.

Quindi stendere lo scivolo su carta assorbente per asciugarlo all'aria. Valutare i campioni per la presenza di spread mitotici utilizzando un microscopio invertito. Aggiungere due microlitri di RNA A da 10 microgrammi per millilitro in due XSSC a ciascun vetrino e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Eseguire tre lavaggi di tre minuti di due XSSC pH 7.0 a temperatura ambiente. Quindi disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo a temperatura ambiente per tre minuti. Ogni aria asciuga i campioni a temperatura ambiente in una provetta micro fuge raffreddata.

Aggiungere quattro microgrammi di nucleotide marcato con substrato di DNA, tampone di traduzione 10 X NIC, miscela DNTP ed enzima di traduzione NIC. Incubare la reazione a 16 gradi Celsius durante la notte a 70 gradi Celsius per 10 minuti per fermare la reazione. Quindi raffreddare con ghiaccio per cinque minuti.

Ora per far precipitare l'etanolo il DNA aggiungere 48 microlitri di acetato di sodio a tre molari, 160 microlitri di 0,25 microgrammi per microlitro catturato 1D NA e 1,2 millilitri di etanolo al 100%. Conservare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per 10 minuti per una notte, precipitare il DNA mediante centrifugazione e lavare il pellet con etanolo al 70%, risospendere la sonda di DNA essiccata all'aria in 40 microlitri di acqua distillata doppia per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per microlitro di DNA posteriore marcato per l'ibridazione simultanea SEP posteriore. Preparare due lettini separati, 1D NA contenenti cocktail di sonde come descritto nel manoscritto allegato.

Denaturare i cocktail della sonda a 75 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti in una culla 1D NA per sequenze ripetitive. Ora combina la sonda posteriore con la sonda S in un rapporto di tre a due per 25 microlitri per campione.

Far scorrere accanto per denaturare i campioni. Immergere i vetrini in ammide al 70% a 72 gradi Celsius e incubare per tre minuti. Disidratare immediatamente i campioni attraverso una serie di etanolo a quattro gradi Celsius per tre minuti.

Ogni aria asciuga i campioni a temperatura ambiente circa 10 minuti prima del completamento della preparazione della sonda. Equilibrare i vetrini su uno scaldavetrini a 45 gradi Celsius. Quindi aggiungere 25 microlitri della miscela di sonda S posteriore.

Ad ogni vetrino posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto e sigillare lungo tutti i bordi con cemento di gomma per la fase di ibridazione. Incubare i campioni per una notte a 37 gradi Celsius in una camera umidificata. Eseguire tre lavaggi post-ibridazione di tre minuti ciascuno in 50% IDE due XSSC pH 7.0 da 38 a 40 gradi Celsius.

La temperatura ottimale dei lavaggi dipende dalla sonda. Se c'è un'elevata ibridazione di fondo, aumenta la temperatura dei lavaggi. Al contrario, se il segnale della sonda è debole e non c'è fondo, diminuire la temperatura dei lavaggi.

Eseguire un lavaggio in tampone PN a temperatura ambiente per tre minuti. Per il rilevamento BRDU, aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco PNM a ciascun vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio, scolare i vetrini su carta assorbente.

Quindi aggiungere 100 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di anticorpo coniugato anti B-R-D-U-F-E e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Eseguire tre lavaggi di tre minuti in tampone PN a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone PN in eccesso da ogni vetrino.

Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di montaggio dappy Antifa. Coprire il vetrino con un tovagliolo di carta e premere sul vetrino coprioggetti per espellere le bolle d'aria e la soluzione di montaggio in eccesso. Cattura le immagini con un microscopio a fluorescenza collegato a una telecamera CCD.

Utilizzando l'obiettivo 100 x e la ruota portafiltri automatica e il software di visione citoscopica, Capture BRDU utilizzando un filtro fitzy e le sonde cromosomiche, posteriori e centromeriche utilizzando un filtro rosso a tre lati o Texas. Utilizzare anche un filtro dappy per la colorazione dei nuclei. Identifica i singoli cromosomi di interesse con le sonde di vernice specifiche per cromosomi o EP posteriori nel software cyto vision.

Taglia ogni cromosoma di interesse dalla diffusione della metafase nel suo insieme. Copia e incolla le immagini dei cromosomi DPI e FITZY in una nuova finestra. Seleziona l'icona del grafico nel menu degli strumenti, che consente la generazione di un grafico che rappresenta l'area e l'intensità della colorazione Fitz e dappy lungo ogni singolo cromosoma.

Questo viene fatto tracciando una linea attraverso la lunghezza del cromosoma dal braccio corto al braccio lungo. Nel menu degli strumenti, selezionare l'icona dei dati e generare una tabella che mostra l'area e l'intensità calcolate per ZI e dpi. Quindi, seleziona i segnali ZI e DPI per i cromosomi di interesse.

Quindi fare clic sui pulsanti dell'intensità e dell'area sull'icona della tabella. Il software genera una misurazione numerica di pixel per pollice quadrato per ogni segnale. Successivamente, l'intensità media dei pixel di ciascun cromosoma viene moltiplicata per l'area occupata da quei pixel.

Per ottenere il numero totale di pixel per la visualizzazione delle ultime regioni di replicazione dei cromosomi, valutare il modello di bandit di incorporazione di BRDU per le regioni di riproduzione attiva dei cromosomi. Quindi calcola le differenze nei tempi di replicazione tra le coppie di cromosomi in base alle differenze nel modello di bande BRDU. I cromosomi nelle cellule di mammifero si replicano secondo un programma temporale con replicazione precoce e tardiva che si verificano rispettivamente all'inizio e alla fine della fase S.

Una tipica sasi nelle cellule di mammifero dura da otto a 10 ore e G due è in genere da due a cinque ore. In questo sistema sperimentale, BRDU viene aggiunto per periodi di tempo crescenti per marcare le ultime porzioni dei cromosomi che si replicano queste cellule contengono una delezione dell'umano come un gene R sei situato a sei Q 16.1. Dopo un trattamento di cinque ore con le cellule mitotiche BRDU sono state raccolte e processate per l'incorporazione di BRDU e l'ibridazione fluorescente in C 2 utilizzando una sonda a vernice del cromosoma sei, i due cromosomi sei mostrano tre etichette fluorescenti.

La differenza significativa nel modello di bande BRDU è coerente con il ritardo nei tempi di replicazione superiore a due ore per uno dei cromosomi sei. Il software di visione Cyto rappresenta i profili di intensità del segnale di differenza per DPI e BRDU sui due cromosomi sei, indicativi di replicazione asincrona. Inoltre, vi è una differenza significativa nella quantità totale di incorporazione di BRDU rispetto a un'analisi simile della colorazione DPI.

L'inclusione di una sonda posteriore contenente l'essere umano come gene AR sei evidenzia il singolo cromosoma sei contenente una delezione sul suo lungo braccio in questa cellula. È interessante notare che c'è un'incorporazione BRDU più intensa e un modello di bande più esteso dell'incorporazione di BRDU rispetto al cromosoma sei non ED. Quando le diffuse mitotiche da sette cellule diverse sono state elaborate per la quantificazione della differenza di tempo di replicazione tra i cromosomi sei.

I livelli di BRDU mostrano una differenza maggiore del doppio tra i valori totali dei pixel per i sei cromosomi eliminati e non ED. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in tre giorni. Ci auguriamo che ora tu abbia una buona comprensione di come misurare la replicazione, la tempistica dei cromosomi omologhi che risiedono all'interno della stessa cellula e di identificare in modo inequivocabile i riarrangiamenti cromosomici correlati con le alterazioni della replicazione.

Tempistica di interi cromosomi.