Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

Questo approccio sperimentale combina l'incorporazione di BRDU con l'ibridazione fluorescente in situ. Per analizzare quantitativamente i tempi di replicazione dei cromosomi mammiferi. Innanzitutto, incorporare BRDU in cellule vive ed isolare i cromosomi in metafase.

Quindi eseguire l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) del DNA combinata con una colorazione sequenziale dell'anticorpo anti-BRDU per identificare i singoli cromosomi replicanti. Successivamente, utilizzare la microscopia fotografica per acquisire immagini dei segnali FISH e dell'incorporazione di BRDU in singole figure mitotiche. Mediante il software CytoVision, calcolare l'area e l'intensità dei pixel rappresentati dai segnali BRDU o DPI su ciascun cromosoma isolato.

I risultati possono quantificare e confrontare l'incorporazione di BRDU nei singoli cromosomi riarrangiati e nei loro olosomi. Poiché il metodo qui descritto valuta singole cellule, è in grado di rilevare variazioni nel tempo di replicazione associate a riarrangiamenti cromosomici presenti solo in una frazione delle cellule di una popolazione, a differenza dei recenti protocolli ad alto rendimento basati su microarray e sequenziamento del DNA. Questo metodo consente un confronto diretto tra cromosomi omologhi presenti nella stessa cellula.

Ha inoltre la capacità di identificare in modo univoco le riarrangiamenti cromosomici che influenzano la replicazione cromosomica. Il momento di esecuzione per interi cromosomi che illustra la procedura sarà Leslie Smith. Un ricercatore associato nel mio laboratorio semini le cellule a circa il 70% di confluenza in una piastra per colture cellulari da 150 millimetri e le collochi nell'incubatore cellulare per 24 ore al momento appropriato.

Punti precedenti al prelievo. Rinnovare il mezzo con mezzo completo fresco contenente 10 microgrammi per millilitro di BRDU. La durata della coltura cellulare in presenza di BRDU varia a seconda del tipo cellulare e della specie.

Normalmente, la fase G2 dura da due a cinque ore. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra, conservando 10 millilitri in un tubo conico da 15 millilitri per centrifuga. Lavare le cellule con 10 millilitri di sine e rimuovere il residuo di sine mediante aspirazione a vuoto.

Quindi aggiungere cinque millilitri di tripsina 0,25% e incubare a temperatura ambiente fino al distacco delle cellule dalla piastra. Raccogliere le cellule e trasferire la sospensione in 10 millilitri di mezzo riservato. Centrifugare per formare il pellet cellulare, quindi aspirare tutto il mezzo tranne 0,5 millilitri.

Ora risospendere completamente le cellule utilizzando una pipetta per farle gonfiare osmoticamente; aggiungere tre gocce di cloruro di potassio 75 millimolare, riscaldato a 37 gradi Celsius, e mescolare la sospensione cellulare con una pipetta. Successivamente, aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di soluzione ipotonica. Portare ora il volume totale della soluzione ipotonica a cinque millilitri e mescolare mediante pipettaggio.

Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per 20-45 minuti, a seconda del tipo di cellule. Incubare i tubi in posizione inclinata per mantenere le cellule in sospensione. Quindi centrifugare a 400 ×g per 10 minuti.

Aspirare tutto tranne 0,5 millimetri del soprannatante e utilizzare una pipetta Pasteur per risospendere delicatamente il pellet cellulare. A questo punto, le cellule gonfiate osmoticamente saranno fragili, quindi è necessario fare attenzione a non danneggiare le membrane citoplasmatiche. Successivamente, aggiungere tre gocce di carnois, fissativo, e mescolare delicatamente.

Dopo aver aggiunto ulteriori 0,5 millilitri di fissativo, portare il volume del fissativo a cinque millilitri e pipettare per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Queste cellule fissate possono essere conservate al buio a meno 20 gradi Celsius per diversi mesi. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione, aspirare il fissativo e risospendere il pellet in 10 volumi di fissativo mantenuto su ghiaccio bagnato e freddo al microscopio.

Posizionare il vetrino a un angolo di circa 45 gradi. Aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia per distribuirla uniformemente. Ricoprire il vetrino con il fissativo ed eliminare l'eccesso.

Quindi posizionare il vetrino orizzontalmente su carta assorbente per farlo asciugare all'aria. Valutare i campioni alla ricerca di allargamenti mitotici utilizzando un microscopio invertito. Aggiungere due microlitri di 10 microgrammi per millilitro di RNAs A in due XSSC su ogni vetrino e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Eseguire tre lavaggi di tre minuti ciascuno con due XSSC a pH 7,0 a temperatura ambiente. Quindi disidratare i campioni mediante una serie di etanoli a temperatura ambiente per tre minuti. Successivamente, far asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente in un microtubo refrigerato.

Aggiungere quattro microgrammi di substrato di DNA con nucleotide marcato, tampone di traduzione NIC 10X, mix di DNTP e enzima di traduzione NIC. Incubare la reazione a 16 gradi Celsius durante la notte, quindi riscaldare a 70 gradi Celsius per 10 minuti per arrestare la reazione. Successivamente, raffreddare in ghiaccio per cinque minuti.

Ora, per precipitare l'acido desossiribonucleico con etanolo, aggiungere 48 microlitri di acetato di sodio tre molar, 160 microlitri di 0,25 microgrammi per microlitro di cot 1D NA e 1,2 millilitri di etanolo al 100%. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius per 10 minuti fino a tutta la notte per precipitare il DNA mediante centrifugazione e lavare il pellet con etanolo al 70%. Sospendere il sonda di DNA essiccato all'aria in 40 microlitri di acqua bidistillata per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per microlitro di DNA marcato per l'ibridazione simultanea back SEP. Preparare due cocktail di sonda separati contenenti cot 1D NA come descritto nel manoscritto allegato.

Denaturare i cocktail di sonde a 75 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per bloccare il cot 1D NA alle sequenze ripetitive. Ora combinare la sonda di blocco con la sonda S in un rapporto di tre a due, utilizzando 25 microlitri per campione.

Fai scivolare accanto per denaturare i campioni. Immergi i vetrini in 70% formammide in due XSSC a 72 gradi Celsius e incuba per tre minuti. Disidrata immediatamente i campioni mediante una serie di etanolo a quattro gradi Celsius per tre minuti.

Lasciare asciugare all'aria ogni campione a temperatura ambiente per circa 10 minuti prima del completamento della preparazione della sonda. Equilibrare i vetrini su un termopiatto regolato a 45 gradi Celsius. Quindi aggiungere 25 microlitri della miscela della sonda back S.

Posizionare delicatamente un coprioggetto su ogni vetrino e sigillarne tutti i bordi con cemento di gomma per la fase di ibridazione. Incubare i campioni per tutta la notte a 37 gradi Celsius in una camera umidificata. Eseguire tre lavaggi post-ibridazione di tre minuti ciascuno in 50%IDE due XSSC pH 7,0 a una temperatura compresa tra 38 e 40 gradi Celsius.

La temperatura ottimale dei lavaggi dipende dalla sonda. Se si verifica un'elevata ibridazione di fondo, aumentare la temperatura dei lavaggi. Al contrario, se il segnale della sonda è debole e non è presente alcun fondo, ridurre la temperatura dei lavaggi.

Eseguire un lavaggio con tampone PN a temperatura ambiente per tre minuti. Per la rilevazione di BRDU, aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante PNM su ciascun vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi asciugare i vetrini su carta assorbente.

Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo coniugato anti B-R-D-U-F-E a 50 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Eseguire tre lavaggi di tre minuti ciascuno in tampone PN a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone PN in eccesso da ogni vetrino.

Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di montaggio dappy Antifa. Coprire il vetrino con un tovagliolo di carta e premere delicatamente sul coprioggetto per eliminare le bolle d'aria e l'eccesso di soluzione di montaggio. Acquisire le immagini mediante un microscopio a fluorescenza collegato a una telecamera CCD.

Utilizzare l'obiettivo 100x, la ruota automatica dei filtri e il software Cyto Vision per acquisire BRDU mediante un filtro fitzy e i cromosomi marcati e le sonde centromeriche mediante un filtro side three o Texas red. Utilizzare inoltre un filtro dappy per la colorazione dei nuclei. Identificare i singoli cromosomi di interesse con sonde EP o sonde specifiche per cromosoma mediante il software Cyto Vision.

Ritagliare ciascun cromosoma di interesse dall'assetto metafasico come un'unità unica. Copiare e incollare le immagini dei cromosomi DPI e FITZY in una nuova finestra. Selezionare l'icona del grafico nel menu degli strumenti, che consente di generare un grafico rappresentante l'area e l'intensità della colorazione Fitz e dappy lungo ciascun cromosoma singolo.

Questo viene fatto tracciando una linea lungo tutta la lunghezza del cromosoma, dal braccio corto a quello lungo. Nel menu degli strumenti, selezionare l'icona dei dati e generare una tabella che mostri l'area e l'intensità calcolate per ZI e dpi. Successivamente, selezionare i segnali ZI e DPI per i cromosomi di interesse.

Quindi fare clic sui pulsanti intensità e area sull'icona della tabella. Il software genera una misurazione numerica di pixel per pollice quadrato per ogni segnale. Successivamente, l'intensità media dei pixel di ciascun cromosoma viene moltiplicata per l'area occupata da tali pixel.

Per ottenere il numero totale di pixel per la visualizzazione delle regioni cromosomiche che si replicano più recentemente, valutare il profilo di incorporazione di BRDU per le regioni cromosomiche attivamente replicanti. Quindi calcolare le differenze nei tempi di replicazione tra coppie di cromosomi in base alle differenze nel profilo di bandeggiatura di BRDU. I cromosomi nelle cellule di mammifero si replicano secondo un programma temporale, nel quale la replicazione precoce e tardiva avviene rispettivamente all'inizio e alla fine della fase S.

Una fase S tipica nelle cellule di mammifero dura da otto a dieci ore, e la fase G2 di solito dura da due a cinque ore. In questo sistema sperimentale, il BRDU viene aggiunto per periodi di tempo crescenti per etichettare le ultime porzioni dei cromosomi che si replicano; queste cellule presentano una delezione del gene umano ASAR6 localizzato in 6q16.1. Dopo un trattamento di cinque ore con BRDU, le cellule mitotiche sono state raccolte ed elaborate per rilevare l'incorporazione di BRDU e mediante ibridazione fluorescente in situ utilizzando una sonda cromosoma 6 "paint"; i due cromosomi 6 mostrano tre etichette fluorescenti.

La differenza significativa nel profilo di bandeggio di BRDU è coerente con il ritardo nei tempi di replicazione di oltre due ore per uno dei cromosomi sei. Il software Cyto vision mostra i profili di intensità del segnale differente per DPI e BRDU sui due cromosomi sei, indicativi di una replicazione asincrona. Inoltre, vi è una differenza significativa nella quantità totale di incorporazione di BRDU rispetto a un'analisi simile della colorazione DPI.

L'inclusione di una sonda inversa contenente il gene umano AR sei evidenzia il singolo cromosoma sei che presenta una delezione sul suo braccio lungo in questa cellula. Curiosamente, si osserva un incorporamento più intenso di BRDU e un modello di bandeggiatura più esteso rispetto al cromosoma sei non-ED. Quando gli strisci mitotici di sette cellule diverse sono stati analizzati per la quantificazione della differenza nei tempi di replicazione tra i cromosomi sei.

I livelli di BRDU mostrano una differenza superiore a due volte rispetto ai valori totali di pixel tra le coppie cromosomiche sei eliminate e quelle non-ED. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita correttamente in tre giorni. Speriamo che ora abbiate una chiara comprensione di come misurare la replicazione, il momento di replicazione dei cromosomi omologhi presenti all'interno della stessa cellula e di come identificare in modo univoco riarrangiamenti cromosomici correlati a modifiche nella replicazione.

Tempistica di interi cromosomi.