Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di portare la suite di programmi 3D NA agli scienziati di laboratorio e ad altri per studiare l'organizzazione spaziale del DNA e dell'RNA con strumenti computazionali all'avanguardia. A tale scopo, è necessario scaricare prima il software dal forum 3D NA e installarlo su un computer locale. Il secondo passo consiste nell'analizzare una struttura rappresentativa del DNA a livello dei passaggi della coppia di basi costituenti.

Successivamente, la stessa struttura del DNA viene modificata a livello di passo della coppia di basi e viene quindi ricostruita utilizzando i parametri del passo della coppia di basi appena definiti. Il passo successivo è l'analisi di un ampio insieme di strutture correlate. Il passo finale è l'allineamento di un insieme di strutture di DNA correlate su un sistema di riferimento comune al fine di visualizzare le distorsioni globali delle strutture.

In definitiva, gli strumenti 3D NA vengono utilizzati per esaminare come i passaggi delle singole coppie di basi, compresi quelli legati a farmaci e proteine, contribuiscano al ripiegamento complessivo del DNA e per identificare i siti e le direzioni di distorsioni globali considerevoli. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il software è robusto e ampiamente applicabile a una varietà di diverse strutture contenenti acidi nucleici. Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biochimica e biofisica, come ad esempio come i genomi sono organizzati in tre dimensioni e che tipo di deformazione il DNA può adottare.

Per iniziare l'installazione del pacchetto software, collegarsi ai tre DA website@xthreed. org e fare clic sul collegamento al forum 3D NA All'interno del forum. Seleziona il link di registrazione e segui le istruzioni per creare un nuovo account.

Una volta stabiliti nome utente e password, accedi al forum, seleziona il link per i download nella sezione di benvenuto e, nella nuova pagina, scegli Download 3D NA. Fare doppio clic sul file tar gz per creare una cartella denominata X 3D NA dash V 2.1, che contiene il software 3D NA. Aprire l'applicazione terminale, che in genere si trova in utilità su un Macintosh, e passare alla directory X 3D NA dash V 2.1.

Eseguire lo script di configurazione necessario per il corretto funzionamento di 3D NA. Tutti i comandi utilizzati in questo video possono essere trovati nel protocollo di testo. Quindi, copia le due impostazioni di esportazione delle righe che appaiono stampate sullo schermo.

Se l'utente ha inserito il software nella directory delle applicazioni, le due righe dovrebbero apparire come mostrato qui. Apri l'applicazione di modifica del testo che si trova nella directory delle applicazioni. Nel menu del formato, seleziona Crea testo normale.

Se esiste un file BRC, apri il file in testo, modifica e incolla le impostazioni di esportazione alla fine del file. Se no, il file bash RC esiste, incolla le impostazioni di esportazione in un file vuoto e salva con il nome del file bash RC nella directory home. Affinché le nuove impostazioni siano disponibili, eseguire il file Bash RC appena salvato all'interno del programma terminale.

Questo video mostra l'analisi di una struttura rappresentativa dell'acido nucleico, il DNA legato alla proteina HBB dal batterio Borrelia bergdorf eye. Il primo passo nell'analisi 3D NA è la creazione di un file che elenca tutte le basi accoppiate. Questo viene fatto digitando un comando per applicare il programma Trova para alla struttura atomica memorizzata nel file a NP due, MP due pdb.

Il passo successivo nell'analisi consiste nel determinare i parametri geometrici che caratterizzano la struttura. Il comando analyze prende come input il file della coppia di base e crea diversi file di output che appaiono nella directory di lavoro. I valori geometrici possono quindi essere calcolati digitando, analizzando due MP due bps.

I file di output generati includono due MP due out, che contiene una panoramica dei parametri calcolati e bpco step par, che contiene un elenco dei parametri del corpo rigido oltre all'analisi di una struttura di acido nucleico, il software 3D NA offre la possibilità di costruire un modello strutturale dai parametri del corpo rigido utilizzando il comando di ricostruzione al fine di creare un modello atomico approssimato, che include le coordinate sia per la spina dorsale che per gli atomi di base. Digitare il comando elencato nel testo. Questo comando indica a 3D NA di introdurre una conferma standard della dorsale BDNA nella costruzione di modelli a partire da parametri di corpo rigido.

Un modello a doppia elica con i parametri del corpo rigido presenti nella struttura H-B-B-D-N-A può quindi essere costruito digitando l'apposito comando. Il file par del passo bpco può essere modificato per generare una struttura modificata. Qui vengono modificati gli angoli di rollio estremi che si formano nei due punti di maggiore flessione.

La struttura viene quindi costruita con il set modificato di parametri step come file di input. I due modelli possono essere visualizzati con un visualizzatore molecolare standard in contrasto con l'analisi di una singola struttura contenente acido nucleico. Questa parte del video mostrerà come analizzare un ampio insieme di strutture in un insieme di file, iniziando con i nomi MD underscore set one PDB e terminando con un numero.

Il primo passo nell'analisi è l'identificazione delle basi accoppiate ottenute eseguendo il programma di ricerca della coppia come prima, poiché l'intero insieme di strutture condivide lo stesso schema di accoppiamento delle basi, è necessario eseguire la ricerca della coppia una volta su un file rappresentativo qui, il file termina con 1001. In questo modo vengono generate le informazioni sull'accoppiamento di base e memorizzate nel file MD al set one BPS PS. Il passaggio successivo trova i parametri geometrici dell'intero insieme di strutture utilizzando l'insieme ncore Command X 3D. Analizzare. Quindi i parametri del corpo rigido desiderati possono essere estratti dal file di output generale MD al set one out.

Questa operazione viene eseguita utilizzando l'estrazione dell'ensemble Command X three DCO. Gli angoli di rollio vengono estratti e viene creato un file di testo separato da virgole degli angoli di rollio. Questo file può essere letto in altri programmi per ulteriori analisi e tracciature.

La versione più recente di 3D NA ha una nuova funzionalità che consente all'utente di guardare più strutture da una prospettiva comune. Il comando X three DCO ensemble reorient sovrappone una raccolta di strutture correlate su una coppia di basi comune o su un passo di coppia di basi, come nei protocolli precedenti. Il primo passo è calcolare l'accoppiamento di basi del DNA con il programma di ricerca della coppia.

In questo caso, il file di input è costituito da due KEK pdb, il file contenente le 10 strutture del CIA coli, O operatore 3D NA legato al copricapo della proteina LAC Repressore. Il riorientamento dell'insieme Command X three DCO allineerà i singoli modelli in una struttura multi-modello su un piano di riferimento comune. Questo comando richiede come input sia il file PDB che il file di associazione di base del passaggio precedente.

Nel comando è inclusa anche l'identità del passo della coppia di basi rispetto al quale sono allineate tutte le strutture. L'interfaccia web di W 3D NA include alcune funzioni popolari del pacchetto software 3D NA. Questa parte del video attira l'attenzione sulla capacità di costruire modelli tridimensionali di DNA decorato con proteine con il server web.

Il primo passo per costruire un modello di DNA decorato con proteine è visitare il sito Web W 3D NA situato in W tre d.rutgers.edu. La selezione della ricostruzione dal menu in alto a sinistra della pagina attiva le funzionalità di costruzione del modello online. Il passaggio successivo consiste nel selezionare il collegamento al modello di DNA proteico legato che si trova nella casella leggermente ombreggiata al centro della nuova pagina.

Questa selezione attiverà un menu a discesa, che consente all'utente di specificare il numero di proteine legate. La selezione del numero di proteine legate porta a una nuova pagina di specifica. L'utente può quindi digitare o incollare nella sequenza desiderata.

Nella casella di testo, al centro della nuova pagina, c'è un menu a discesa sotto la casella di testo per selezionare la conferma elicoidale delle regioni non legate del DNA. C'è una casella di testo nella parte inferiore della pagina delle specifiche per inserire le posizioni di legame e i nomi dei file delle proteine legate. La posizione di legame specifica la posizione del centro del frammento legato alla proteina sulla sequenza di DNA.

Nella parte inferiore della pagina delle specifiche, c'è una casella che consente all'utente di generare un'anteprima del DNA legato alla proteina. In questo caso, la casella viene selezionata e si fa clic sul pulsante Continua. Questa azione genera una pagina di revisione in cui sono elencati i parametri selezionati, nonché gli eventuali errori che potrebbero essersi verificati dalla sovrapposizione dei siti di associazione selezionati.

L'utente può selezionare il pulsante Indietro se è necessario apportare modifiche o il pulsante di compilazione per procedere. La pagina successiva mostra un'immagine statica del complesso proteico del DNA nella sua disposizione più estesa e consente la visualizzazione interattiva online via web. L'utente può anche scaricare un file contenente le coordinate atomiche.

Gli strumenti software 3D NA vengono utilizzati di routine per analizzare le strutture degli acidi nucleici. I valori dei parametri del corpo rigido rivelano distorsioni nella struttura tridimensionale, come i due siti di estrema flessione del DNA nella scanalatura principale con ampi angoli di rollio positivi che si trovano ai passi 13 e 22. Nel complesso cristallino del DNA con la Borrelia Bergdorf, proteina RHBB.

La capacità del software di ricostruire strutture a partire da queste quantità rende possibile determinare in che modo le singole basi e le coppie di basi contribuiscono al ripiegamento molecolare complessivo. Come illustrato qui, la flessione globale del DNA indotta dall'HBB riflette più delle due distorsioni di ruolo estreme sopra menzionate. Il DNA rimane altamente curvo quando viene ricostruito con questi gradini della coppia di basi raddrizzati.

Ciò avviene quando i due valori più grandi del ruolo sono stati impostati su zero. La nuova capacità di esaminare un gran numero di strutture correlate consente di estrarre sia modelli di sequenza che di modelli dipendenti dal tempo nelle disposizioni spaziali di molecole di DNA e RNA simulate. Ad esempio, il rivestimento di colore giallo degli angoli di rollio tra coppie di basi successive in due grandi insiemi di strutture di DNA simulate rivela la flessione preferenziale di queste molecole ai gradini delle coppie di basi purinetiche del Permiano.

I valori più alti di rollio raffigurati in rosso che persistono per brevi periodi alle estremità del DNA suggeriscono una fusione localizzata e un riginocchio della struttura a doppia elica. I modelli variazionali di altri parametri del corpo rigido, come gli angoli e le distanze tra basi complementari, possono aiutare a decifrare le precise distorsioni strutturali. La capacità del software 3D NA di riorientare molecole correlate in un sistema di riferimento comune rivela le caratteristiche della struttura complessiva nascoste in molti dei file memorizzati nella banca dati delle proteine.

Ad esempio, l'allineamento convenzionale di strutture correlate sulla base di un adattamento quadratico medio degli atomi corrispondenti produce una serie di percorsi spaziali simili che si sovrappongono approssimativamente l'uno all'altro. Qui, i 10 modelli basati su NMR dell'Esia coli, O operatore NA 3D legato ai pezzi di testa della proteina repressore LAC, La sovrapposizione delle stesse strutture su un sistema di coordinate comune sulla coppia di cinque basi terminali prime di ciascun duplex rivela notevoli distorsioni della struttura globale in cui le molecole si flettono in direzioni notevolmente diverse. La variabilità strutturale può influenzare la facilità con cui la proteina repressore LAC di CIA coli lega O tre e induce un loop tra O tre e operatori sequenzialmente distanti nell'operazione LAC. Come illustrato qui, il posizionamento preciso di una proteina architettonica come l'HBB di Borrelia burgdorferi può avere un effetto drammatico sul ripiegamento complessivo del DNA.

Se due copie della struttura nota ad alta risoluzione sono separate da 43 coppie di basi, un frammento di DNA da 81 coppie di basi si chiude in una configurazione stretta, quasi circolare. Se le due proteine sono separate da altre cinque coppie di basi, il DNA segue un percorso serpeggiante aperto. Le disposizioni molto diverse del duplex decorato con proteine mostrano come la spaziatura delle proteine architettoniche possa influenzare la ciclizzazione o il looping del DNA dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale degli acidi nucleici per esplorare le interazioni tra le proteine del DNA, l'RNA, il ripiegamento e la progettazione di nanoparticelle al fine di ottenere una migliore comprensione dei difetti dello sviluppo e delle malattie come il cancro e progettare nuove terapie.