In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo
20 settembre 2012
Procedure semplici e riproducibili sono descritte per la realizzazione di tre assemblee collagene strutturalmente distinti da un tipo comune, disponibile in commercio ho monomero collagene. Tipo nativo, fibroso spaziatura lungo o segmentale collagene spaziatura lungo può essere costruito variando le condizioni a cui i 300 nm di lunghezza e diametro di 1.4 nm blocco monomero edificio è esposto.
L'obiettivo generale di queste procedure è mostrare come il monomero di collagene possa essere utilizzato in modo riproducibile per ottenere tre tipi diversi di strutture di collagene di ordine superiore. Il collagene nativo viene prodotto aumentando il pH della soluzione di monomero di collagene, mentre il collagene fibroso a spaziatura lunga viene ottenuto combinando il monomero di collagene con la glicoproteina acida alfa-1 e la spaziatura lunga segmentale.
Il collagene viene prodotto mescolando il monomero di collagene con un TP. Infine, la microscopia a forza atomica viene utilizzata per caratterizzare i tre diversi tipi di strutture del collagene che si formano. Il vantaggio principale di questi protocolli rispetto alle procedure pubblicate in precedenza è che sono più semplici e altamente riproducibili nella formazione delle strutture di collagene desiderate. Questi protocolli sono stati sviluppati nel nostro laboratorio negli ultimi 10 anni, sfruttando una fonte commerciale affidabile di monomero di collagene come materiale di partenza. A dimostrare la procedura sarà Calvin Chang, uno studente laureando del mio laboratorio, al fine di creare fibre di collagene native con una marcatura a bande chiare di 67 nanometri.
Iniziare preriscaldando un blocco termico a 37 °C. Successivamente, preparare la soluzione tampone in una provetta da microcentrifuga aggiungendo quattro µL di una soluzione di monomero di collagene a tre mg/mL e mescolare bene. La soluzione risultante dovrebbe essere limpida e incolore.
Posizionare la miscela sul blocco riscaldante preriscaldato a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore al fine di formare le fibrille di collagene native. La soluzione finale dovrebbe risultare leggermente torbida e conterrà principalmente fibrille di collagene native per preparare il collagene a spaziatura longitudinale fibrosa. Per prima cosa, inserire un millilitro di una soluzione di monomero di collagene a tre milligrammi per millilitro in una membrana con cutoff del peso molecolare compreso tra 12 e 14 kilodalton.
Successivamente, dializzare contro 400 millilitri di acqua, cambiando l'acqua quattro volte nell'arco di 24 ore. Successivamente, combinare 20 microlitri del monomero di collagene dializzato con 20 microlitri di acqua ultrapura e 20 microlitri di alfa-1-glicoproteina acida a 3 milligrammi per millilitro in acqua in un tubo da microcentrifuga e mescolare.
Lasciare assemblare il collagene spaziale fibroso del polmone a temperatura ambiente per un periodo di 30 minuti. Durante questo tempo, la soluzione diventerà da chiara a torbida, formando collagene con spaziatura lunga di tipo patologico. Per prima cosa, preparare il tampone acido in una provetta da microcentrifuga.
Aggiungere 40 microlitri di 10 milligrammi per millilitro, un TP in acqua, alla soluzione tampone e mescolare. Infine, aggiungere bene 33 microlitri di una soluzione di monomero di collagene a 3 milligrammi per millilitro in 0,01. Acido cloridrico normale e mescolare per combinare.
Lasciare assemblare il collagene con spaziatura lunga segmentale a temperatura ambiente per un periodo di due ore. La soluzione finale sarà limpida in questa preparazione, a differenza delle altre due forme di collagene descritte. Per ottenere una superficie piana e pulita per la microscopia a forza atomica o per una FM, attaccare un pezzo di nastro adesivo a un substrato di FM costituito da MICA e staccare almeno uno strato.
Controllare il nastro per confermare la rimozione di un intero strato. Una volta ottenuta una superficie adeguata, applicare 20 microlitri della soluzione di collagene FI sul substrato di mica e lasciare in posa per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, rimuovere i fibrilli in eccesso risciacquando con acqua lungo il bordo del substrato di MICA e lasciando scorrere l'acqua sul campione per 10-15 secondi.
Non aggiungere acqua direttamente nell'area del campione. Quindi asciugare la superficie utilizzando un flusso delicato di gas azoto a partire da un bordo del substrato, avendo cura di non dirigere il flusso al centro del campione.
Esaminare il campione al microscopio ottico a un ingrandimento di 200 x per osservare la distanza longitudinale nativa e fibrosa. I campioni di collagene mostrano aggregati di fibro, mentre il collagene con distanza longitudinale segmentale non è visibile. Le caratteristiche uniche dei diversi tipi di collagene vengono osservate al meglio.
Utilizzando un AFM, eseguire una scansione iniziale di 100 per 100 micrometri quadrati, quindi ingrandire per effettuare scansioni di 10 per 10 micrometri quadrati e, infine, di due per due micrometri quadrati. Per osservare la periodicità a bande del collagene polmonare nativo e fibroso. Il collagene presentava le caratteristiche più fini del collagene di spaziatura segmentale polmonare.
Per campioni di collagena nativa, eseguire la microscopia a forza atomica in modalità a contatto intermittente utilizzando una sonda a FM in silicio per rilevare lo spaziamento longitudinale fibroso e lo spaziamento segmentale lungo. Per i campioni di collagena, eseguire la microscopia a forza atomica in modalità a contatto e utilizzare sonde a FM in nitruro di silicio per ottenere i migliori risultati. Verificare almeno altre due aree sul campione di collagena per assicurarsi che le scansioni iniziali siano rappresentative.
La elevata risoluzione spaziale della microscopia a forza (FM) è ideale per caratterizzare le diverse preparazioni di collagene descritte in questo video. Essa distingue facilmente le fibre di collagene native, il collagene con spaziatura longitudinale fibrosa e il collagene con spaziatura longitudinale segmentale; tecniche di microscopia ottica come la microscopia a contrasto di interferenza differenziale mostrano le fibre ma non sono in grado di rivelare le caratteristiche su scala nanometrica, che differenziano i tre tipi di collagene preparati con questi metodi. In un campione tipico, una scansione quadrata casuale di 100 per 100 micrometri effettuata mediante FM mostra almeno alcune fibrille lunghe da cinque a 50 micron, singolarmente separate.
Il collagene fis può essere facilmente identificato in questa fase; ingrandendo con una dimensione di scansione quadrata di 10 micrometri si osserva che tutti i fis presentano bande. Per misurare con precisione la periodicità delle bande, è preferibile ingrandire fino a una dimensione di scansione quadrata di due per due micrometri. L'ingrandimento con una dimensione di scansione quadrata di 10 per 10 micrometri mostra che tutte le fibrille presentano bande.
Per misurare con precisione la periodicità delle bande, è preferibile ingrandire fino a un'area di scansione quadrata di due per due micrometri. Il periodo delle bande aumenta quando il collagene viene preparato secondo la procedura del collagene con spaziatura lunga, producendo ripetizioni di 270 nanometri lungo la lunghezza della fibra. In un campione tipico, una scansione quadrata casuale di 100 per 100 micrometri effettuata mediante microscopia a forza (FM) mostra almeno alcune fibrille.
La periodicità delle bande può essere osservata ingrandendo un'area quadrata di 10 per 10 micrometri ed è facilmente misurabile con un'acquisizione quadrata di due per due micrometri. Infine, il collagene con spaziatura longitudinale segmentale non forma affatto fibre, ma segmenti singoli. In un campione tipico, un'acquisizione quadrata casuale di 100 per 100 micrometri effettuata mediante microscopia a forza (FM) mostra molti puntini individuali.
Uno scan quadrato di 10 per 10 micrometri più ravvicinato mostra diversi cristalliti di SLS e uno scan quadrato di 2 per 2 micrometri mostra la struttura più fine di un cristallo di SLS. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare costrutti di collagene FLS e SLS maturi e omogenei a partire da monomero di collagene disponibile in commercio. Il collagene è un materiale biocompatibile utile come substrato o come impalcatura per la coltivazione di cellule e tessuti.
Questa procedura ti permetterà di ottenere strutture di collagene desiderabili per queste e altre applicazioni.
Panoramica
Questo articolo descrive procedure semplici e riproducibili per creare tre tipi distinti di strutture di collagene da un monomero di collagene Tipo I comune. I metodi consentono la formazione di collagene nativo, collagene fibroso a spaziatura lunga e collagene segmentale a spaziatura lunga variando le condizioni del monomero di collagene.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Biologia Strutturale
- Ricerca sul Collagene
Sfondo
- Il collagene è una proteina strutturale vitale in vari tessuti biologici.
- Diversi tipi di strutture di collagene hanno proprietà e applicazioni uniche nella ricerca e nella medicina.
- La riproducibilità nell'assemblaggio del collagene è cruciale per la coerenza sperimentale.
- La microscopia a forza atomica viene utilizzata per caratterizzare le strutture di collagene.
Obiettivo dello studio
- Fornire protocolli per l'assemblaggio riproducibile di strutture di collagene.
- Dimostrare l'uso di una fonte commerciale affidabile di monomero di collagene.
- Confrontare le caratteristiche di diversi tipi di collagene utilizzando la microscopia a forza atomica.
Metodi utilizzati
- Preparazione di soluzioni di collagene a pH e condizioni variabili.
- Dialisi e miscelazione con proteine specifiche per diversi tipi di collagene.
- Utilizzo della microscopia a forza atomica per la caratterizzazione strutturale.
- Microscopia ottica per l'osservazione iniziale delle fibrille di collagene.
Risultati principali
- Formazione con successo di collagene nativo, collagene fibroso a spaziatura lunga e collagene segmentale a spaziatura lunga.
- Caratteristiche distinte osservate per ogni tipo di collagene utilizzando la microscopia a forza atomica.
- Riproducibilità dei metodi dimostrata in un periodo di 10 anni.
- Chiara differenziazione dei tipi di collagene basata sulle caratteristiche strutturali.
Conclusioni
- I protocolli descritti semplificano il processo di assemblaggio del collagene.
- La microscopia a forza atomica fornisce informazioni ad alta risoluzione sulle strutture di collagene.
- Questi metodi possono essere applicati in vari contesti di ricerca che coinvolgono il collagene.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reproducible synthesis of defined collagen architectures enables mechanistic de-risking in extracellular matrix modeling and biomaterials development. The ability to generate uniform native, fibrous long spacing, and segmental long spacing collagen from a defined monomer supports target validation in tissue engineering and fibrosis research. These methods provide predictive confidence in scaffold design by reducing structural heterogeneity in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of collagen self-assembly mechanisms and hierarchical structure formation.
- Operational Value: Provides a defined system to isolate variables in fibrillogenesis studies.
- Translational Value: Supports hypothesis testing on how collagen spacing influences cell adhesion and signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized collagen substrates with quantifiable banding periodicities for consistent ligand presentation.
- Operational Value: Enables AFM-based structural screening to assess compound effects on fibril morphology.
- Translational Value: Facilitates assay reproducibility across labs by minimizing batch-to-batch variability in collagen preparations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Creates disease-relevant collagen mimics to model pathological matrix remodeling in fibrosis and cancer.
- Operational Value: Allows preclinical evaluation of therapeutics targeting collagen cross-linking or assembly.
- Translational Value: Supports biomarker alignment by correlating structural changes with functional outcomes in tissue models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where defined extracellular matrix components are needed to assess target engagement and phenotypic responses.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of collagen-integrin interactions and mechanotransduction pathways.
- Screening: Enables standardization of collagen-coated surfaces for reproducible compound screening in 3D culture systems.
- Analytics: Provides quantitative nanoscale structural readouts via AFM to compare collagen states across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical by offering tunable matrix models that reflect disease-altered collagen architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology for generating consistent collagen structures across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of structural ambiguity in collagen-based models increases confidence in target-mechanism linkages.
- Operational Value: High reproducibility minimizes resource waste from failed batches and improves assay throughput.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on predictable matrix behavior rather than variable biomaterial performance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in matrix-targeted therapies by providing reliable preclinical validation tools.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, dialysis techniques, and atomic force microscopy operation.
- Depends on access to AFM with appropriate probes (silicon nitride for long spacing types, silicon for native) and mica substrate preparation.
- Necessitates standardization of buffer conditions, incubation times, and protein concentrations across users and sites.
- Adaptation to other collagen types or sources would require re-optimization of assembly conditions.
- Practical limitation: Segmental long spacing collagen does not form continuous fibers, restricting use in applications requiring fibrillar scaffolds.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Preparation of Native Collagen Fibrils
1:45
Preparation of Fibrous Long Spacing Collagen
2:35
Preparation of Segmental Long Spacing Collagen
3:19
Atomic Force Microscopy Characterization of Collagen Fibrils
5:10
Results: AFM Verification of Collagen Fibril Type
7:15
Conclusion
