Name: Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri la tecnica MACT per la riparazione dei difetti condrali nel ginocchio del coniglio utilizzando condrociti autologhi espansi in vitro e impiantati su una matrice tridimensionale. Questo metodo standardizzato offre risultati promettenti per la medicina rigenerativa.

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Questo progetto è stato finanziato dalla German Research Association (DFG, SE 4578/3-1).

A. Cartilagine Biopsia (Chirurgia in camera; passaggi 1-5 nella camera di preparazione non sterile) <ol><li> Eseguire un controllo finale peso del coniglio (New Zealand White coniglio, femmina, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 6 mesi) per essere in grado di dose droghe correttamente e controllare il peso conseguente alla chirurgia. </li><li> Indurre l&#39;anestesia per il coniglio da una iniezione endovenosa di 10 mg / kg di propofol. </li><li> Dopo l&#39;intubazione, mantenere l&#39;anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg di fentanil per via endovenosa. Monitorare l&#39;anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca. </li><li> Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia. </li><li> Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una garza sterile. </li><li> Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula. </li><li> Aprire l&#39;articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare il taglio di qualsiasi piccola suvasi sanguigni perficial. </li><li> Spostare la rotula lateralmente. </li><li> Ispezionare l&#39;articolazione del ginocchio per eventuali anomalie e lesioni cartilaginee macroscopiche. </li><li> Rimuovere con cautela piccoli pezzi di cartilagine (2-3 mm) fuori della troclea femorale ossis con un bisturi sterile (Figura 1). </li><li> Porre immediatamente queste biopsie cartilaginee in un tubo da 50 ml con terreno completo (DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS) + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per continuare con la cultura in vitro destra dopo l&#39;operazione. </li><li> Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile. </li><li> Riposizionare la rotula nel solco trocleare. </li><li> Chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continua (4-0 Monocryl). Utilizzare materiale di sutura riassorbibile. </li><li> Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo. </li></ol> B. In vitro Cultura <ol><li> Elabora la biopsia cpezzi il più presto possibile dopo l&#39;operazione in una cappa a flusso laminare sterile cultura del tessuto artilage. </li><li> Lavare la sterile raccolto cartilagine 2x in PBS con successiva centrifugazione a 500 xg per 3 min a RT. </li><li> Tagliare cartilagine in pezzi da 1 mm 3, trasferimento ad un Falcon 50 ml e digerire loro su un agitatore per 30 minuti con 10 ml di tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml di PBS per 30 min </li><li> Dopo 30 min, interrompere tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo. Poi, scuotere i pezzi di cartilagine per un altro per 12 ore con collagenasi A (0,21 U / mg) in mezzo privo di siero (DMEM + 1% Pen / Strep). </li><li> Centrifugare la soluzione risultante a 170 xg per 3 min a RT. </li><li> Risospendere pellet cellulare in 5 ml di terreno completo. </li><li> Seed i condrociti isolati su a 25 cm 2 di tessuto cultura palloni in 5 ml di terreno completo e conservare in un umidificata tessuto cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Condrociti crescere ad una densità di 80%. </li><li> Rilasciare le cellule di from boccette di lavaggio in PBS 2x prima di esporre al 0,05% tripsina-EDTA per 3 min. Una volta condrociti staccano, stop tripsinizzazione con l&#39;aggiunta di 10 microlitri terreno completo. </li><li> Centrifugare la sospensione di 300 g (3 min) e risospendere pellet in terreno completo. </li><li> Cellule di semi in fiasche di coltura tissutale (75 cm 2) e Split con un rapporto di 1:3 (~ 5.000 cellule / cm 2) ogni 5 ° giorno o al momento 80% di confluenza. </li><li> Determinare i numeri di cellulare e la vitalità di blu tripano colorazione. </li></ol> C. Cell-semina di Matrix <ol><li> Prima del lavaggio impianto e cellule di rilascio come descritto sopra. Eseguire la conta cellulare e trasferire 5 x 10 4 cellule in una provetta da 1,5 ml. Quindi centrifugare a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in 15 microlitri mezzo completo per una completa saturazione della matrice. </li><li> Tagliare il doppio strato di collagene patibolo per le dimensioni esatte del difetto trocleare da una biopsia sterilepugno. </li><li> Posto matrice in un piatto di coltura tissutale di dimensioni appropriate (come piastre da 24 pozzetti). </li><li> Piastrare sul lato poroso, cellula-adesivo della matrice. Questo scoraggia migrazione cellulare lontano dalla matrice. </li><li> Lascia cellula-teste di serie matrici senza ulteriore mezzo di coltura cellulare all&#39;interno di un incubatore per 1 ora per consentire la piena aderenza dei condrociti. </li><li> Poi, posto cellula-matrice-costrutti in contenitori di coltura (ad esempio piastre da 24 pozzetti) con terreno fresco completo. Fare attenzione a non lavare le cellule fuori della matrice, anche se forte aderenza è previsto. </li><li> Ora, cellula-matrice-costrutti possono essere adottate per la sala operatoria per il re-impianto. </li></ol> D. matrix-assisted trapianto autologo di condrociti <ol><li> Eseguire artrotomia parapatellare al ginocchio controlaterale come descritto sopra (A. 1-8). </li><li> Creare due isolati difetti condrali nel solco trocleare con un operatin aria sterileg trapano (3,6 mm di diametro). </li><li> Pulire il difetto e sciacquare con soluzione salina sterile. </li><li> Occorre prestare attenzione a non aprire la cavità midollare, in qualsiasi momento. Se necessario, sigillare il fondo dei difetti con cauterizzazione elettrica contro sanguinamento. </li><li> Impiantare le matrici seminate con i condrociti in coltura con la porosa lato rivolto verso il basso (Figura 2). Poi press-fit nei fori e lavare la superficie circostante. </li><li> Sigillare le matrici impiantati con un po &#39;di colla di fibrina (Tissucol Duo S) per assicurare la fissazione sicura. </li><li> Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e applicare la gamma completa di movimento al ginocchio un paio di volte. </li><li> Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare la presenza di qualsiasi evento o segno di fissazione instabile. Le matrici devono essere tenute ancora in vigore. </li><li> Sostituire nuovamente la rotula e terminare l&#39;operazione con chiusura della ferita in strati e spray medicazione come descritto sopra. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato fornisce un consolidato 9,12,13 e facilmente riproducibile tecnica per isolare i condrociti autologhi per la successiva proliferazione e re-impianto in difetti della cartilagine creato artificialmente in ginocchio coniglio. L&#39;uso di condrociti autologhi per il rimodellamento e la riparazione di lesioni della cartilagine articolare è già in uso clinico fornire risultati soddisfacenti a lungo termine 6. Problemi importanti come per esempio l&#...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nome del reagente/dell'attrezzatura&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Azienda&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numero di catalogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Commenti&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>0,21 U/mg</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FCS)</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>3702-P103009</td><td></td></tr><tr><td>Propofolo</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2213</td><td>10.000 U/ml/10.000 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Etilene (70%)</td><td>Merck KgaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25 %/0,02 %</td><td>Biochrom AG</td><td>L2163</td><td>in PBS senza Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Delta Select GmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di NaCl (0,9%)</td><td>Bbraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Superficie di crescita 60,1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147,8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tubi da centrifuga (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Sterilizzati con raggi gamma</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>Soluzione di Blu di Tripano 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8154</td><td></td></tr><tr><td>Medicazione spray (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>Permeabile al vapore acqueo</td></tr><tr><td>Chondro-Gide&amp;Ograve;</td><td>Geistlich Pharma AG</td><td>30915.5</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia</td><td>pfm medical ag</td><td>48351</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S</td><td>Baxter</td><td>3419627</td><td>0,5 ml</td></tr></tbody></table>

matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Difetti della cartilagine articolare sono considerati un problema sanitario importante in quanto la cartilagine articolare ha una limitata capacità di auto-rigenerazione 1. Lesioni cartilaginee non trattate portano a dolore in corso, influenzare negativamente la qualità della vita e di predisporre per l&#39;artrosi. Durante gli ultimi decenni, diverse tecniche chirurgiche sono state sviluppate per il trattamento di tali lesioni. Tuttavia, finora non è stato possibile ottenere una riparazione completa in termini di copertura del difetto di cartilagine ialina articolare o di fornire recupero a lungo termine soddisfacenti 2-4. Pertanto, le lesioni della cartilagine articolare rimane un obiettivo primario per le tecniche rigenerative come Tissue Engineering. A differenza di altre tecniche chirurgiche, che spesso portano alla formazione di tessuto fibroso o fibrocartilagineo, Tissue Engineering mira a ripristinare completamente la struttura complessa e le proprietà della cartilagine articolare originale utilizzando il potenziale condrogenico delle cellule trapiantate. Ralcune recenti sviluppi hanno aperto possibilità promettenti per le terapie rigenerative della cartilagine. Il primo approccio basato cellulare per il trattamento di cartilagine a tutto spessore o lesioni osteocondrali è stata eseguita nel 1994 da Lars Peterson e Mats Brittberg pioniere clinico impianto di condrociti autologhi (ACI) 5. Oggi, la tecnica è clinicamente ben consolidata per il trattamento dei grandi difetti della cartilagine ialina del ginocchio, il mantenimento di buoni risultati clinici anche 10 o 20 anni dopo l&#39;impianto 6. Negli ultimi anni, l&#39;impianto di condrociti autologhi subito una progressione rapida. L&#39;uso di un tridimensionale collageno-matrice artificiale su cui le cellule vengono successivamente reimpiantate diventata sempre più popolare 7-9. MACT compone di due procedure chirurgiche: in primo luogo, al fine di raccogliere condrociti, una biopsia cartilagine deve essere eseguita da una zona di cartilagine non sostengono pesi tgiunto egli ginocchio. Poi, condrociti vengono estratti, purificati e ampliato per un numero di cellule sufficiente in vitro. I condrociti sono poi seminate su una matrice tridimensionale e possono essere successivamente reimpiantati. Quando si prepara un impianto tissutale, tasso di proliferazione e la capacità di differenziazione sono cruciali per una rigenerazione dei tessuti di successo 10. L&#39;uso di una matrice tridimensionale come vettore cella è pensato per supportare queste caratteristiche cellulari 11. Il seguente protocollo riassumerà e dimostrare una tecnica per l&#39;isolamento di condrociti da biopsie cartilagine, la loro proliferazione in vitro e loro semina su un 3D-matrice (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Svizzera). Infine, l&#39;impianto degli cellula-matrice-costrutti in artificialmente creati difetti condrali del ginocchio di coniglio sarà descritto. Questa tecnica può essere utilizzata come ambiente sperimentaleper ulteriori esperimenti di riparazione della cartilagine.

La tecnica chirurgica descritta permette un isolamento di successo e l&#39;impianto di condrociti autologhi in un difetto condrale artificiale. Il setup sperimentale ha comportato una integrazione dell&#39;impianto nella cartilagine circostante. Dopo 12 settimane in vivo, il difetto condrale stato riempito da tessuto di riparazione con una superficie omogenea e intatta, che ha ridotto sforzo di taglio e danneggiamento dell&#39;impianto (Figura 4). Inoltre, nessuna i...

Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti condrali in ginocchio di coniglio è descritto. L&#39;impianto di condrociti autologhi seminate su una matrice è un metodo ben accettato per il rimodellamento e la riparazione di lesioni della cartilagine articolare che fornisca risultati soddisfacenti a lungo termine. Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti (MACT) offre un metodo standardizzato di impianto e clinicamente stabilita.

Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio

I difetti della cartilagine articolare sono considerati un grave problema di salute poiché la cartilagine articolare possiede una limitata capacità di autoregenerazione 1. Se non trattati...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere una tecnica sperimentale per il trattamento di difetti condrali nell'articolazione del ginocchio del coniglio. Questo viene realizzato innanzitutto eseguendo una biopsia della cartilagine dall'articolazione del ginocchio per raccogliere condrociti autologhi. Il secondo passaggio consiste nell'estrarre, purificare ed espandere in vitro i condrociti prelevati fino a un numero cellulare sufficiente.Successivamente, i condrociti vengono posizionati su una matrice tridimensionale. Nell'ultima fase, la matrice tridimensionale viene impiantata in un difetto condrale che è stato praticato nel ginocchio controlaterale del coniglio. Alla fine, dopo 12 settimane in vivo, gli impianti possono essere valutati macroscopicamente, mostrando un tessuto di riparazione con una superficie omogenea e integra di buona qualità.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione della cartilagine articolare e potrebbe facilitare l'analisi sperimentale della terapia con fattori di crescita, dell'induzione genica e delle modifiche alle proprietà meccaniche. Dopo aver anestetizzato il coniglio, rasare il ginocchio da operare con un paio di forbici elettriche. Successivamente, aspirare il pelo e disinfettare accuratamente il ginocchio rasato, coprendo il resto dell'animale con una medicazione sterile.Successivamente, palpare la rotula. Eseguire un'incisione cutanea medialmente alla rotula, quindi aprire l'articolazione del ginocchio mediante un'artrotomia para-rotulea mediale in condizioni sterili, spostare lateralmente la rotula e quindi utilizzare un bisturi sterile. Per staccare con attenzione piccoli frammenti di cartilagine lunghi due-tre millimetri dalla troclea dell'osso femorale.Posizionare immediatamente i prelievi di cartilagine in un tubo da 50 millilitri contenente mezzo completo, quindi sciacquare le lesioni con soluzione salina sterile. Utilizzare pinze per rimuovere eventuali frammenti di cartilagine rimasti. Ora riposizionare la rotula nella scanalatura trocleare e chiudere la ferita a strati con punti singoli a bottoniera e un punto cutaneo assorbibile continuo.Infine, sigillare la ferita con una medicazione spray permeabile al vapore acqueo. Iniziare questo passaggio lavando due volte il cartilagine sterile raccolto in PBS, seguito da centrifugazione per tre minuti a 500 ×g e a temperatura ambiente. Successivamente, tagliare il cartilagine in pezzi di un millimetro cubo.Trasferirli in un nuovo tubo conico da 50 millilitri, quindi digerire i frammenti con 10 millilitri di tripsina, EDTA e 10 millilitri di PBS su un agitatore. Dopo 30 minuti, arrestare la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di mezzo completo. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e aggiungere mezzo senza siero con collagenasi A. Quindi agitare i frammenti per altre 12 ore.Ora centrifugare la soluzione ottenuta, quindi risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo completo. Seminare i citi isolati in fiaschi da coltura tissutale da 25 centimetri quadrati con cinque millilitri di mezzo completo e coltivare le cellule in un incubatore per colture tissutali umidificato a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Quando le colture hanno raggiunto una densità dell'80%, lavare i citi due volte con PBS. Successivamente, esporli a tripsina-EDTA allo 0,05% per tre minuti.Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di mezzo completo per arrestare l'azione della tripsina. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet nel mezzo completo e quindi seminare le cellule in fiaschi da coltura tessutale da 75 centimetri quadrati. Dopo aver raccolto le cellule da una coltura in vitro come appena illustrato, contare e trasferire successivamente cinque volte 10 alla quarta cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare, risospendere il pellet in 15 microlitri di mezzo completo per una saturazione completa della matrice. Quindi tagliare un impalcatura di collagene bilaminare alle dimensioni esatte del difetto trocleare e posizionare la matrice in una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, seminare i condrociti sul lato poroso adesivo per cellule della matrice per favorire la migrazione cellulare lontano dalla matrice.Quindi incubare le matrici cellulari senza ulteriore coltura cellulare. Mezzo per un'ora per consentire l'adesione completa dei condrociti. Infine, posizionare i costrutti di matrice cellulare in una nuova piastra a 24 pozzetti con mezzo completo e fresco.Dopo aver eseguito un'artrotomia para-patellare al ginocchio controlaterale come appena dimostrato, iniziare il trapianto utilizzando un trapano chirurgico sterile a energia pneumatica per creare due difetti condrali isolati di diametro di 3,6 millimetri nella solco trocleare. Successivamente, risciacquare i difetti con soluzione fisiologica sterile, avendo cura di non aprire la cavità midollare.Ora impiantare le matrici seminate con condrociti con il lato poroso rivolto verso il basso, quindi utilizzare una piccola quantità di colla di fibrina per sigillare le matrici impiantate e assicurarne una fissazione stabile. Riposizionare la rotula nella troclea ed applicare alcune volte l'intera ampiezza di movimento all'articolazione del ginocchio. Successivamente, mantenendo le matrici in posizione, spostare nuovamente la rotula lateralmente per verificare eventuali segni di fissazione.Dopo aver riposizionato la rotula, terminare nuovamente l'operazione con la chiusura della ferita per strati e una medicazione spray come appena dimostrato. Dopo 12 settimane in vivo, il difetto condrale era stato riempito da tessuto di riparazione con una superficie omogenea e integra, che ha ridotto lo stress di taglio e i danni all'impianto. Inoltre, non è stata osservata alcuna ipertrofia né calcificazione dell'impianto.Il tessuto di riparazione ha mostrato una qualità rigida e solida, paragonabile a quella del tessuto cartilagineo sano circostante. Inoltre, non si è verificata alcuna delaminazione dell'innesto. La freccia rossa indica il difetto condrale preforato a 12 settimane dall'impianto con condrociti autologhi.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare condrociti autologhi per la successiva proliferazione in vitro e di come seminare tali cellule su una matrice 3D per il reimpianto in difetti cartilaginei artificialmente creati nel ginocchio di un coniglio. Per una ulteriore dimostrazione della tecnica di creazione di difetti cartilaginei in un modello sperimentale differente, si prega di consultare anche il nostro articolo collegato su Jovi, intitolato Trattamento dei difetti osteocondrali nell'articolazione del ginocchio del coniglio mediante impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina.

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Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di...

Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

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