A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di Cotyledon Arabidopsis durante la germinazione

Lo scopo del seguente esperimento è quello di visualizzare i primi eventi dello sviluppo epidermico dopo la germinazione dei semi a livello cellulare. Ciò si ottiene rimuovendo prima il rivestimento del seme per consentire una visione chiara del kosin come secondo passo. I kosina sono montati sotto uno strato di terreno di agar che li immobilizza e ne supporta lo sviluppo successivo. L'imaging time-lapse viene eseguito per diversi giorni al fine di osservare la crescita e la divisione delle cellule epidermiche in vivo.

Sono stati ottenuti risultati che mostrano l'espressione genica dinamica e la localizzazione delle proteine in base alla fluorescenza visibile. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le immagini fisse della colorazione di Gus o le fusioni GFP, è che mostra il movimento dinamico delle proteine durante la divisione e la differenziazione cellulare. I semi di Arabidopsis per questo esperimento sono sterilizzati in una soluzione di sterilizzazione dei semi composta per il 33% da candeggina domestica e dallo 0,1% di Triton X 100 posizionare i semi che trasportano i costrutti e i genotipi del reporter fluorescente desiderati in una provetta da 1,7 millilitri e applicare un millilitro di soluzione di sterilizzazione, incubare su un mutatore per 15 minuti.

In una cappa sterile, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione sterilizzante dal tubo lasciando i semi. Risciacquare con un millilitro di acqua sterile. Ripetere quattro volte dopo il quarto risciacquo.

Incubare a quattro gradi Celsius per due o più giorni. Per preparare il terreno di coltura a vetrino, mescolare 20 millilitri di soluzione allo 0,5% di bact in agar in acqua in un pallone da 200 millilitri e nel microonde fino a quando non si saranno sciolti. Fai attenzione quando fai bollire la soluzione.

Chiama la soluzione a circa 60 gradi Celsius. Una soluzione troppo calda o applicata troppo rapidamente può sciogliere la colla o rompere il vetro del vetrino della camera. Quando la soluzione di agar è sufficientemente fredda, raccoglierne un millilitro con una pipetta e applicarlo lentamente sul vetro di copertura all'interno del vetrino della camera.

Aggiungere un secondo millilitro di soluzione di agar. Agar Media dovrebbe ora coprire completamente la parte inferiore del vetrino della camera. Questo mezzo minimo è sufficiente a sostenere lo sviluppo in una pianta di oleina, che contiene i nutrienti immagazzinati per quattro o cinque giorni mantenendo l'umidità e consentendo la diffusione del gas.

Chiama il vetrino con la camera coperta sul piano di lavoro. Per iniziare questa procedura, rimuovere il tubo di semi sterili dalla conservazione a quattro gradi Celsius. Posizionare un fazzoletto di carta sul tavolino di un microscopio da dissezione, inumidirlo con acqua e regolarlo per creare una superficie liscia.

Il tessuto viene utilizzato per stabilizzare i semi durante la dissezione. Pipettare da 20 a 30 semi dalla provetta sul tessuto, facendo attenzione a posizionarli nel campo visivo dell'endoscopio da dissezione. La dissezione della coleadina è l'aspetto più impegnativo di questa procedura.

L'uso di pinze affilate e di basso ingrandimento e la massima attenzione aiuteranno a garantire una dissezione di successo utilizzando pinze affilate. Rimuovere con cura il rivestimento del seme dalla piantina all'interno, sia i tegumenti esterni che quelli interni devono essere rimossi. Quindi, usa un bisturi per tagliare il piombo del lettino libero dall'iper chiazza e dal radicale.

È utile rimuovere l'hyper cot e il radicale per l'imaging perché, se intatto, l'hyper cott si raddrizzerà e si allungherà notevolmente. Spostando il piombo Koss fuori dal campo visivo time-lapse, mantenere il piombo cos sezionato immerso nell'acqua. Ripetere la dissezione del seme fino a raggiungere il numero desiderato di Oleano.

Si consigliano da 15 a 20 dissezioni riuscite prima di montare l'oleano nel vetrino della camera. Per preparare il vetrino della camera per il montaggio del cotan, utilizzare un piccolo vetrino coprioggetto per tagliare il terreno di agar e sollevare l'intero strato dalla base di vetro della camera. Far scorrere la pipetta di cotan sezionato con una quantità minima di acqua dal tubo di supporto nella camera.

Far scivolare sotto lo strato di agar sollevato. Abbassare delicatamente l'agar sulle sedine. Se è presente acqua in eccesso, immergerla con un fazzoletto.

Fare attenzione a non disturbare i sedins quando il montaggio è completo. Gli esemplari non dovrebbero più muoversi facilmente. Posizionare il coperchio sul vetrino della camera e trasferire il vetrino sul tavolino del microscopio.

Prima dell'imaging, impostare il microscopio confocale invertito per visualizzare il fluorismo desiderato. I parametri LSM 700 sono per l'eccitazione GFP di 488 nanometri e la raccolta. Con un filtro passa banda da 440 a 530 nanometri e per eccitazione RFP a 555 nanometri e raccolta.

Con un filtro passa banda da 570 a 610 nanometri con un obiettivo 20 volte. Concentrati sull'ingresso ACO e sposta l'obiettivo al centro della camera. Scorri in modalità di acquisizione, modifica lo zoom a 0,5 e le dimensioni del fotogramma a 48 x 48 pixel.

Selezionare la casella di controllo delle posizioni e scansionare l'immagine panoramica, quindi aumentare il numero di riquadri orizzontali e verticali da 30 a 35. Fare clic sul pulsante di scansione per avviare la scansione. Al termine della scansione, fare clic sul pulsante delle posizioni sotto la scheda delle dimensioni e posizionare il mirino su ogni bocchettone per osservare.

Ispezionare gli esemplari montati per verificare che non siano danneggiati. Eliminare le posizioni corrispondenti all'elettrocatetere danneggiata per lasciare solo campioni adatti per l'imaging. Successivamente, impostare una serie Z che comprende l'epidermide di piombo di tutti i campioni.

Fare clic sulla casella di controllo Zack. Seleziona ogni posizione nell'elenco delle posizioni e fai clic sul pulsante Sposta a. Concentrati sul piano superiore del piombo cos nell'epidermide e fai clic sul primo pulsante di impostazione sotto Zack.

Mettere a fuoco la posizione più bassa in cui l'epidermide è utilmente visibile. E fai clic sul pulsante Imposta ultimo. Fare clic sul pulsante accanto a ottimale, che mostra il miglior spessore della fetta Z da impostare.

Controlla ogni ingresso kos per confermare che queste impostazioni comprendano tutti i campioni. I parametri Z non possono essere impostati per singole posizioni. Nel software Zen 2009 qui utilizzato, le serie temporali impostate con la risoluzione desiderata e gli intervalli di lunghezza da 15 a 30 minuti per tre giorni sono efficaci per la dinamica delle proteine nella divisione cellulare epidermica, ma gli intervalli possono essere modificati secondo necessità.

Fare clic sulla casella di controllo serie temporali in serie temporali, impostare i cicli per il numero di immagini desiderate digitando nel campo di testo, impostare l'intervallo su 30 e utilizzare il menu a discesa per selezionare MIN per iniziare la scansione multiposizione XY, ZT, modificare le dimensioni del fotogramma alla risoluzione desiderata e raccogliere l'inizio dell'esperimento. Si noti che il numero di posizioni deve essere limitato dalle specifiche di scansione. Se il tempo di scansione totale è maggiore dell'intervallo desiderato, i punti temporali non saranno corretti.

Utilizzando questo sistema, è possibile un massimo di sei posizioni simultanee quando si esegue l'imaging di GFP e RFP a 59 fette Z in un intervallo di 30 minuti. Di seguito è riportato un esempio di un insieme di punti temporali informativi raccolti con questo metodo. Le membrane cellulari sono marcate con RFP e GFP fusa una proteina polare sotto il suo promotore nativo.

Le immagini della serie A mostrano che la GFP polare appare inizialmente distribuita uniformemente, poi circa due ore prima delle divisioni asimmetriche indicate dalle punte di freccia. La GFP polare si separa dal sito dell'OID meister incipiente nella serie B dopo l'iniziale divisione asimmetrica indicata dalla punta della freccia a 47 ore. La GFP polare scompare in entrambe le cellule.

Implicando una rapida transizione allo stato di cellula madre di guardia da parte del meris oide, la cellula madre di guardia indicata dall'asterisco si divide simmetricamente e si differenzia per formare cellule di guardia stomatiche, mentre la cellula cisto riacquista l'espressione polare di GFP presumibilmente precedendo una successiva divisione asimmetrica. Qui è mostrato un video registrato semplificato della localizzazione della GFP polare durante l'amplificazione e la spaziatura di una cellula precursore stomatica. Inizialmente, la GFP polare appare uniformemente nella cellula entro 39 ore dalla germinazione.

Si polarizza fortemente poco prima di una divisione a 40 ore, posizionando una cameriera più piccola all'estremità opposta della cella. La cellula più grande a destra riacquista anche l'identità della linea stomatica e entro 45 ore la localizzazione della GFP polare si sposta adiacente al precursore stomatico. La divisione a 47 ore produce un nuovo steroide a destra orientato lontano dal vecchio stamoide me a sinistra dal primo stamoide me.

Il risultato finale è che due stomi sono separati da una cellula. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il time lapse a lungo termine di una coleadina germinante per valutare l'espressione genica e la localizzazione delle proteine nell'epidermide durante lo sviluppo.