Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo protocollo stabilisce una nuova piattaforma di co-coltura tra assone neuronale e Astroglia per analizzare le interazioni tra neuroni e ggl utilizzando l'imaging ad alta risoluzione. Innanzitutto, assemblare la camera di coltura microfluidica, preparare le colture neuronali e indurre gli assoni neuronali ad entrare nell'altro lato dell'MCP. Successivamente, aggiungere astrociti in coltura per stabilire un sistema di co-coltura compartimentalizzato risultati, tra cui l'imaging time-lapse con microscopia a immunofluorescenza confocale può aiutare a comprendere le interazioni tra assoni, astroglia e assoni neuronali.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo cercato di separare l'effetto del processo neuronale rispetto alla secrezione neuronale alla regolazione GT uno. In genere, gli individui nuovi al metodo avranno difficoltà a indurre l'assone in un'altra parte del compartimento cellulare. Richiede un'alta densità di neuroni sani placcati sul lato neuronale con il neurone placcato vicino ai canali centrali.

Le camere aperte MCP sono progettate per colture compartimentate di diversi tipi di cellule, i rivestimenti in poliuretano e laminina sono necessari per la placcatura di neuroni e astrociti nella co-coltura. Innanzitutto, applicare una soluzione poliuretanica da un milligrammo per millilitro sui piatti sterili con fondo in vetro e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Lavare tre volte le stoviglie con fondo in vetro rivestito con acqua distillata doppia e poi metterle ad asciugare sotto una cappa aspirante sterile.

Quindi, rivestire il piatto con un milligrammo per millilitro, lamirina e asciugare sotto la luce UV per un'ora. Il montaggio dell'MCP sul piatto con fondo in vetro deve essere preparato al momento prima dell'uso. Posizionare la piattaforma di coltura microfluidica con i canali di collegamento centrali sul lato inferiore e formare una tenuta ermetica con il vetro rivestito.

Piatti inferiori. Aggiungere normali mezzi di coltura per neuroni o astrociti su entrambi i lati dell'MCP assemblato. Incubare la camera per due-quattro ore a 37 gradi Celsius e verificare che non vi siano perdite tra l'MCP e il vetro.

Piatto inferiore. Le colture cellulari neuronali Cortico sono preparate al momento da cervelli embrionali di topo di 14-16 giorni. Dopo la dissezione del cervello del topo, rimuovere le meningi dalla corteccia al microscopio da dissezione.

Usa una lama di rasoio per tritare il tessuto in piccoli blocchi di tessuto e posiziona i blocchi di tessuto macinato in una provetta dopo la centrifugazione. Scartare il supporto sopra il pellet e aggiungere lo 0,05%Try per 10 minuti e un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dissociare le cellule mediante delicata tacitazione con una pipetta per pasta lucidata a fuoco.

Passare il campione attraverso un colino da 70 micron per raccogliere una sospensione di cellule neuronali trasparenti utilizzando la placcatura neuronale. Terreno integrato con il 5% di semi FBS. 150 microlitri di neuroni sul lato destro della piastra MCP assemblata.

Un'alta densità di neuroni poiché solo i neuroni che si attaccano nell'area di ritenzione cellulare sono in grado di far crescere gli assoni attraverso i canali centrali nell'altro lato dell'MCP assemblato. Il giorno seguente. Aspirare con cautela il terreno dall'area di placcatura cellulare della camera e sostituire il terreno di placcatura neuronale con una normale coltura neuronale.

Medium, aggiungere 20 nanogrammi per millilitro, fattore neurotrofico derivato gliale o GDNF al lato astrocitario della camera. Questo crea un gradiente chimico che aiuterà a indurre la crescita degli assoni dal lato neuronale attraverso i canali centrali dell'MCP assemblato. Due giorni dopo monitorare gli assoni che entrano nel canale centrale.

Una volta che gli assoni entrano nel canale centrale, di solito entrano nell'altro lato entro un giorno. Gli assoni sono normalmente intatti per almeno una settimana dopo essere entrati nell'altro lato. Dopo aver dissociato il cervello da P uno a tre sbuffi di topo, semino astrociti in piatti di 10 centimetri rivestiti di poliuretano.

Coltura, le cellule durante la notte riforniscono quotidianamente il terreno di coltura degli astrociti per i due giorni successivi, e poi una volta ogni tre giorni dopo sette giorni quando gli astrociti hanno formato un 90% di cellule di raccolta monostrato confluenti utilizzando la tripsina Circa cinque giorni dopo che i neuroni sono stati placcati aspirati dal GDNF. Quindi seminare 150 microlitri di astrociti risospesi nel lato sinistro dell'MCP assemblato. Quando gli assoni stanno per entrare o sono appena entrati dopo la riplaccatura degli astrociti, gli assoni che sono entrati nel lato sinistro dell'MCP assemblato interagiscono direttamente con gli astrociti, sia per contatto assonale diretto che per rilascio di fattori solubili.

Monitorare gli astrociti per l'attaccamento all'area di ritenzione cellulare. Immunocolorare le cellule nel sistema di co-coltura compartimentalizzato per visualizzare proteine specifiche come quelle coinvolte nell'interazione tra gli assoni e gli astrociti. Il sistema di co-coltura di neuroni e astrociti compartimentati consente solo ai processi neuronali, in particolare agli assoni, di interagire selettivamente con gli astrociti.

Qui descriviamo l'attivazione trascrizionale indotta dagli assoni del trasportatore del glutammato dell'astroglia. Questi studi utilizzano topi transgenici, che ospitano un'espressione di un reporter di fluorescenza EGF sotto il controllo del promotore genomico GT one. Un'alta densità di neuroni viene coltivata nell'area di ritenzione cellulare dell'MCPA assemblato, la vista ingrandita mostra gli assoni che attraversano i canali centrali ed entrano nell'altro lato con la colorazione della tubulina beta tre che rivela il cono di crescita dell'assone.

Il sistema MCP consente il monitoraggio dei fasci di assoni mentre crescono attraverso il canale centrale ed entrano nell'altro lato. È emersa la colorazione immunos per GT 1 che identifica gli astrociti nel lato gliale del sistema MCP. L'immagine mostra il contatto tra gli assoni e gli astrociti positivi del GLT 1.

L'espressione del reporter EGFP è correlata all'attivazione endogena del promotore GT one, all'espressione proteica e all'attività funzionale. La valutazione dell'attività del promotore GT 1 in singoli astrociti in C 2 mostra un aumento significativo dell'immunoreattività GLT 1 nel sistema di co-coltura compartimentato. È importante sottolineare che il sistema MCP consente immagini time-lapse per monitorare i cambiamenti dinamici.

Ad esempio, questi dati mostrano l'attivazione del promotore GT 1 indotta dall'assone con gli astrociti EGFP GT one posteriori e i neuroni wild type un giorno dopo la placcatura degli astrociti. Minimo, si osserva fluorescenza EGFP. L'intensità dell'EGFP aumenta significativamente 48 ore dopo la co-coltura, quando gli assoni sono ben inseriti nel lato degli astrociti e interagiscono direttamente con gli astrociti.

Il trattamento con kinina sul lato neuronale dell'MCP assemblato ha indotto la morte delle cellule neuronali. È interessante notare che ha anche stimolato la retrazione e la degenerazione degli assoni, nonché la diminuzione della fluorescenza assonale dell'EGFP. Questi cambiamenti dinamici dell'intensità di fluorescenza dell'EGFP in risposta agli assoni hanno dimostrato chiaramente che l'attività del promotore di Astroglia GT one è modulata dall'interazione con gli assoni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire il sistema di coltura di base utilizzando la piattaforma di coltura microfluidica Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in pochi giorni.