Studio del danno al DNA con Checkpoint Xenopus Uovo Estratti

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il checkpoint del danno al DNA utilizzando estratti di uova di xip come sistema modello. Preparare innanzitutto un estratto a bassa velocità a partire da uova di xip. Successivamente, preparare cromatina spermatica danneggiata mediante trattamenti che inducono danno al DNA, come MMS e luce UV.

Preparare anche la struttura che imita il danno al DNA. Un T 70 procede ad attivare il checkpoint del danno al DNA nell'LSE con la cromatina spermatica danneggiata o con un T 70. Infine, i risultati ottenuti dagli immunoblot possono fornire informazioni sul checkpoint del danno al DNA mediato da a TR nell'estratto uovo di xenopus.

Ciao a tutti. Sono CH Y del dipartimento di biologia dell'UNC Charlotte. Oggi vi mostreremo come l'estratto di pus venga utilizzato come sistema modello per studiare il segnale del punto di controllo del danno.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'instabilità dinamica, ad esempio in che modo viene attivato il checkpoint del danno al DNA. Questo protocollo riguarda la preparazione di estratti di uova opus e di reagenti in grado di indurre il checkpoint del danno al DNA, nonché l'analisi del checkpoint del danno al DNA e di xap. Queste tecniche possono essere adattate a diverse modalità di danneggiamento del DNA, inclusi quattro NQO ed etoposide.

Per studiare il checkpoint del danno al DNA, iniziamo. Per preparare le femmine di *Xenopus laevis* per la deposizione delle uova, iniettare nei sacchi linfatici dorsali 100 unità di PMSG per via sottocutanea. Dopo aver atteso almeno due giorni dal trattamento di induzione, stimolare la deposizione delle uova iniettando in ciascuna rana preparata 500 unità di gonadotropina corionica umana per via sottocutanea nel sacco linfatico dorsale. Incubare le rane iniettate per 14-20 ore in contenitori separati contenenti due litri di soluzione di Ringer modificata di Marc.

Rimuovere le rane dai contenitori e versare via la soluzione MMR fino a quando ne rimangono circa 100 millilitri. Successivamente, trasferire le uova dai contenitori in un becher da 250 millilitri e rimuovere la gelatina dalle uova aggiungendo circa ogni 30 secondi 100 millilitri di cisteina al 2% a pH 7,8. Agitare delicatamente le uova con una pipetta di Pasteur di vetro capovolta dal diametro di 0,7 centimetri, quindi decantare e sostituire con cisteina fresca due volte.

Il processo di detersione sarà completato in circa cinque-quindici minuti. Quando le uova formeranno uno strato più condensato sul fondo del becher, dopo aver scartato la soluzione di cisteina, lavare le uova tre volte con soluzione 0,25 XMMR. Agitare le uova con una pipetta di vetro e ispezionarle alla ricerca di uova bianche rigonfie difettose che tendono ad accumularsi al centro del becher.

Rimuovere le uova difettose con una pipetta da pascolo. Successivamente, lavare le uova tre volte con il buffer di lisi per uova. Rimuovere eventuali ulteriori uova difettose, quindi versare le uova in un tubo falcon da 14 millilitri.

Compattare le uova mediante centrifugazione per 55 secondi a 188 volte G. Utilizzando una centrifuga clinica da banco con un rotore a cestelli oscillanti, rimuovere l'eccesso di puffer al di sopra dello strato di uova. Ora, per ogni millilitro di uova compattate, aggiungere 0,5 microlitri di aprotinina, leptina o AL a 10 milligrammi per millilitro e 0,5 microlitri di citochina B o cyto B a 5 milligrammi per millilitro; centrifugare le uova a 16.500 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando la centrifuga super veloce Sarva RC sei plus con un rotore HB sei a cestelli oscillanti, dopo la centrifugazione, i componenti si frazionano in tre strati nel tubo: estratto lipidico e pigmento del tuorlo, dall'alto verso il basso rispettivamente. Pungere il lato del tubo falcon nella parte inferiore dello strato centrale di estratto con un ago da 21 gauge.

Rimuovere con attenzione l'ago, poiché l'ago di puntura potrebbe essere ostruito dalla plastica. Inserire un nuovo ago da 21 gauge collegato a una siringa da un millilitro nel sito di puntura. Per raccogliere l'estratto.

Aspirare lentamente l'estratto, evitando bolle d'aria e contaminazione con gli strati lipidici e del pigmento del tuorlo. Trasferire gli estratti in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri raffreddata. Per ogni millilitro di estratto uovo, aggiungere 10 microlitri di 10 milligrammi per millilitro.

Cicloesimidina: un microlitro di 10 milligrammi per millilitro. Una pronina leptina, un microlitro di cinque milligrammi per millilitro di citochina B, un microlitro di DTT uno molare e 0,33 microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Ole miscelato capovolgendo delicatamente l'estratto di uovo almeno 10 volte. L'estratto a bassa velocità deve essere utilizzato entro quattro ore poiché la qualità dell'LSE è compromessa.

Dopo quattro ore o un scongelamento libero, sciogliere i due oligonucleotidi sintetici in acqua alla concentrazione di due microgrammi per microlitro. Aggiungere 100 microlitri di ciascun oligo in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitro e incubare per cinque minuti in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius. Rimuovere il blocco termoregolato con il tubo contenente la miscela di oligo e lasciar raffreddare a temperatura ambiente; porzionare aliquote da 10 microlitri per conservarle a meno 20 gradi Celsius.

Il campione di AL è ora un duplex A T 70 a una concentrazione finale di due microgrammi per microlitro. Preparare la cromatina spermatica normale come descritto da Tudor e Walter fino a 0,5 millilitri di cromatina. Aggiungere 5,5 microlitri di MMS 9,1 molare.

Posizionare il tubo del campione su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 30 minuti utilizzando la centrifuga clinica IE CCL due con rotore a cestelli oscillanti e adattatori per tubi. Centrifugare il campione a 686 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e lavare il pellet in 0,5 millilitri di tampone X contenente B-S-A-D-T-T-A proin e leptina.

Ripetere questo processo tre volte e risospendere il pellet in 0,5 millilitri di tampone x. Determinare la concentrazione della cromatina spermatica mediante emocitometro.

Quindi diluire il campione a 100.000 spermatozoi per microlitro e conservare aliquote da cinque microlitri a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere la quantità desiderata di cromatina spermatica normale sulla superficie di un pezzo di param e inserire il campione in un incrociatore UV. Impostare il parametro energetico desiderato e iniziare a danneggiare la cromatina spermatica mediante luce UV.

Utilizzare immediatamente la cromatina spermatica trattata con raggi UV per indurre il checkpoint del danno al DNA nell'estratto a bassa velocità preparato. Combinare 50 microlitri di LSE, un microlitro di miscela energetica e due microlitri di cromatina spermatica danneggiata. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 90 minuti, assicurandosi di agitare delicatamente il tubo ogni 10 minuti dopo almeno 30 minuti.

Incubazione, dispensare un microlitro di miscela di reazione su un vetrino e aggiungere un microlitro di soluzione di nuclear dice. Posizionare un coprioggetto e verificare la formazione dei nuclei mediante microscopio a fluorescenza. Tipicamente, si formeranno nuclei rotondeggianti dopo 30 minuti di incubazione, indicando che la replicazione del DNA è iniziata.

Inoltre, valutare 10 microlitri della miscela di reazione mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti check one. Combinare 50 microlitri di LSE, un microlitro di miscela energetica e 1,6 microlitri di soluzione stock di toto micina in un tubo da microcentrifuga. Quindi aggiungere 1,25 microlitri di una delle seguenti soluzioni: duplex di DNA T 70 a due microgrammi per microlitro oppure acqua, come controllo negativo.

Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 90 minuti e agitare delicatamente i tubi di reazione ogni 10 minuti. Aggiungere ora 10 microlitri della miscela di reazione in 90 microlitri di buffer campione per l'analisi western blot di controllo di una proteina. La cromatina spermatica danneggiata o la struttura che imita il danno al DNA attivano in modo efficace un checkpoint del danno al DNA mediato da TR check one nel sistema di estratto di uovo xop, rispetto al controllo in cui il danno è indotto da MMS.

Verificare una fosforilazione in Syrian 3 44, che è un indicatore dell'attivazione della chinasi TR. Analogamente, una T 70 come struttura che imita un danno al DNA induce anche la fosforilazione della check one. Una volta acquisita padronanza, la preparazione dell'LSE può essere completata in circa un'ora.

Poiché la qualità dell'estratto diminuisce dopo circa quattro ore, velocità ed efficienza sono essenziali. Questi metodi possono essere abbinati ad altri approcci per rispondere a domande fondamentali riguardo il segnale del checkpoint del danno al DNA. Ad esempio, può essere eseguito un esaurimento immunologico per verificare se una proteina bersaglio è richiesta nel checkpoint del danno al DNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare il checkpoint del danno al DNA utilizzando estratto di uova di Xenopus come sistema modello. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.