Name: Studio del danno al DNA con Checkpoint Xenopus Uovo Estratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara a studiare il checkpoint del danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. Questo metodo permette di analizzare l'attivazione del checkpoint mediato da ATR-Chk1 e i meccanismi di riparazione del DNA.

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Questo lavoro è sostenuto in parte con fondi forniti da The University of North Carolina a Charlotte, Wachovia fondo di base per eccellenza della facoltà, e una borsa di studio NIGMS (R15GM101571).

1. LSE Preparazione <ol><li> Rane donna (Xenopus laevis) sono iniettati due volte per la raccolta delle uova. La prima iniezione (priming) è 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina) a rana. Le rane devono essere adescato almeno due giorni prima di uova induce posa e rane innescato sono utilizzabili per un massimo di due settimane. Per prime rane, iniettare per via sottocutanea pMsg nei sacchi linfatici dorsali utilizzando una siringa da 3 ml e 27 ago G. </li><li> Per indurre la deposizione delle uova, iniettare 500 U hCG (gonadotropina corionica umana) a rana innescato per via sottocutanea nei sacchi linfatici dorsali utilizzando un ago 27 G. Incubare rane iniettati in diversi contenitori contenenti 2 litri di soluzione 1x Marc modificato Ringer (MMR). Lasciare rane 14-20 ore per deporre le uova prima della raccolta. </li><li> Rimuovere le rane dai secchi e versare fuori la soluzione MMR fino a circa 100 ml è di sinistra. Ottenere le uova dai secchi trasferendo le uova in un becher da 250 ml. </li><li> Uova Dejelly aggiungendo 100 ml del 2% cisteina (regolarepH a 7,8 con 10 M KOH). Agitare delicatamente le uova con una pipetta Pasteur di vetro invertita (0,7 cm di diametro) circa ogni 30 sec. Decantare e sostituire con cisteina fresco due volte durante l&#39;incubazione. Il processo dejellying è completa in circa 5-15 min quando le uova formare uno strato più condensata sul fondo del bicchiere. </li><li> Eliminare la soluzione di cisteina e lavare le uova tre volte con MMR 0,25 x. Swirl le uova nella soluzione da una pipetta di vetro. &quot;Bad&quot; uova sono determinate mediante una semplice ispezione visiva e sono di colore bianco &quot;gonfio&quot; in apparenza. I &quot;cattivi&quot; uova si accumulano al centro del bicchiere dopo vorticoso. Rimuovere &quot;cattivi&quot; uova da una pipetta Pasteur. </li><li> Lavare le uova con Lysis Buffer Egg (ELB) tre volte. Rimuovere eventuali altri &quot;cattivi&quot; uova da una pipetta Pasteur. Versare le uova in una provetta 14 ml Falcon. </li><li> Gira il tubo Falcon per 55 sec a 188 xg (1.100 rpm) con il CL2 IEC clinico tavolo centrifuga con rotore oscillante per compattare le uova. Rimuovere il tampone in eccesso dalsopra lo strato di uovo. Aggiungere 0,5 ml di Aprotinina / magazzino leupeptina e 0,5 l di brodo Citocalasina B per ml di uova compattati. </li><li> Centrifugare uova a 16.500 xg (10.000 rpm) per 15 min a 4 ° C utilizzando il RC6 Sorvall più centrifuga supervelocità con HB6 rotore oscillante. Dopo centrifugazione, le uova sono frazionati in tre strati nel tubo: lipide, estratto, e tuorlo / pigmento dall&#39;alto verso il basso, rispettivamente. Forare il lato del tubo Falcon nella porzione inferiore dello strato centrale estratto con un ago 21 G. Rimuovere con attenzione l&#39;ago come l&#39;ago puntura può essere ostruito da materiale plastico. Inserire un ago da 21 G fresco attaccato ad una siringa da 1 ml nel sito di puntura per raccogliere l&#39;estratto. Lentamente aspirare l&#39;estratto in siringa per evitare bolle d&#39;aria e la contaminazione con il tuorlo e lipidi / pigmento strati. </li><li> Posizionare gli estratti in un freddo 1,5 ml microcentrifuga tubo. Per ogni millilitro di estratto di uova, aggiungere le seguenti soluzioni madre chimiche al didicata concentrazione finale (mostrato tra parentesi): (1) 10 cicloeximide microlitri (100 mcg / ml), (2) 1 microlitri Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml ciascuna), (3) 1 ml Citocalasina B (5 pg / ml ), (4) 1 microlitri di ditiotreitolo (1 mM), e (5) 0,33 Nocodazole microlitri (3 mg / ml). Capovolgere l&#39;uovo estrarre almeno 10 volte con delicatezza. Questa è la LSE, che deve essere fatta fresca e utilizzato entro 4 ore. La qualità della LSE è compromessa dopo 4 ore o di congelamento-scongelamento. </li></ol> 2. Trattamento della cromatina sperma con Approcci danneggiare il DNA <ol><li> Preparare cromatina spermatozoi normali secondo il metodo descritto in precedenza 13. </li><li> Preparare MMS trattato con cromatina spermatica <ol><li> Risospendere cromatina spermatozoi normali in 0,5 ml di tampone di X. </li><li> Aggiungi ~ 5,5 ml di MMS (9,1 M in magazzino) a 500 microlitri risospeso cromatina ad una concentrazione finale di 100 mM. </li><li> Incubare cromatina spermatozoi in provetta a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione. </li><li> Gira la mtubo icrocentrifuge a 686 xg (2.100 rpm) per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando la centrifuga IEC CL2 clinica con rotore oscillante e adattatori per provette. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di tampone di X più BSA (3%), DTT (0,1 mM) e Aprotinina / leupeptina (10 pg / ml). </li><li> Ripetere i punti (4) e (5) due volte per lavare la cromatina spermatica. </li><li> Determinare la concentrazione di spermatozoi con cromatina un emocitometro e diluire a 100.000 spermatozoi / pl. Salva aliquote di 5 pl in congelatore -80 ° C per un ulteriore uso. </li></ol></li><li> Preparare UV trattato con cromatina spermatica <ol><li> Aggiungere la quantità desiderata (es. 10 pl) della cromatina spermatica normale sulla superficie di un pezzo di Parafilm. </li><li> Posizionare il Parafilm in un reticolante UV. Impostare il parametro energia desiderata, a seconda del tuo esperimento, e iniziare a danneggiare la cromatina degli spermatozoi attraverso la luce UV. Ad esempio, ci vogliono circa 21 secondi per raggiungere 1000 J / m 2. </li><li> Dopo UV irradiazione, UV trattato con cromatina sperma devono essere aggiunte a estratti di uova immediatamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di una struttura di DNA Damage-imitazione (AT70) <ol><li> Sciogliere due oligonucleotidi sintetici poli-(dA) 70 (designato come A70) e poli-(dT) 70 (designato come T70) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / microlitro, rispettivamente. </li><li> Aggiungere 100 pl di A70 e 100 pl di T70 una provetta 1,5 ml microcentrifuga. Bollire mista soluzione sintetica oligo per 5 min a 95 ° C in un heatblock. </li><li> Prendete il blocco secco bagno fuori (con il tubo contenente miscela in esso), e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente su un banco di laboratorio. Questa regolazione della temperatura dura circa 45-60 min. </li><li> La miscela raffreddata è AT70 con una concentrazione finale di 2 mg / mL. Magazzino 10 pl di AT70 aliquote in congelatore a -20 ° C per un ulteriore uso. </li></ol> 4. Attivazione della Checkpoint danno al DNA in cromatina LSE con sperma danneggiato o di un danno al DNA-Imitazione Struttura <ol><li> Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con cromatina degli spermatozoi danneggiati <ol><li> Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e integrare con 1 ml di miscela di energia e 2 ml di cromatina degli spermatozoi danneggiati (concentrazione finale ~ 4.000 spermatozoi / reazione microlitri). </li><li> Incubare la provetta di reazione a temperatura ambiente per 90 min e aspirare il tubo ogni 10 min. </li><li> Dispensare 1 ml di miscela di reazione su un vetrino da microscopio integrato con 1 ml di soluzione colorante nucleare dopo 30 minuti di incubazione. Posizionare un vetrino sopra la miscela di reazione e controllare la formazione di nuclei con microscopio a fluorescenza. In genere, nuclei rotondi formerà dopo 30 minuti di incubazione, che indica la replicazione del DNA ha avviato. </li><li> Prendere 10 pl di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni sono analizzati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi. </li></ol></li><li> Indurre il danno checkpoint del DNA in LSE con ilAT70 <ol><li> Aggiungere 50 ml di LSE in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga integrata con 1 ml di miscela di energia e 1,6 l di brodo Tautomycin. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di pre-made AT70 (2 pg / pl) o acqua (come controllo negativo) ad ogni reazione. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 90 min. Flick le provette di reazione ogni 10 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di miscela di reazione in 90 ml di tampone campione. I campioni vengono esaminati tramite immunoblotting utilizzando anticorpi anti-P-S344 Chk1 o anti-Chk1 anticorpi. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi La cromatina sperma danneggiato o danno al DNA che imitano la struttura può attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA nel sistema Xenopus estratto uovo. Figura 2a mostra che induce MMS Chk1 fosforilazione a Ser344 (Chk1 P-S344), che è un indicatore di l&#39;attivazione della chinasi ATR. figura 2B mostra che AT70, come un danno al DNA-imitazione structure, attiva anche Chk1 fosforilazione. Totale campioni Chk1 sono utilizzati come controlli carico in entrambi gli esempi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Figura 1. Uno schema della segnalazione checkpoint danno al DNA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Figura 2. Chk1 fosforilazione è indotta da uno o MMS AT70 trattamenti in Xenopus estratti uovo. (A) MMS-danneggiato sperma cromatina (MMS) o cromatina spermatica normale (Con) vengono incubati in estratti di uova per 90 min. Chk1 fosforilazione di Ser344 (Chk1 P-S344) e Chk1 totale in estratti di uova sono esaminati mediante immunoblotting. (B) AT70 o acqua (Con) vengono aggiunti estratti di uova, rispettivamente. I campioni sono analizzati mediante immunoblotting come in (A).

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<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono diversi vantaggi nello studio il punto di controllo danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. L&#39;uso di estratti di uova fornisce una grande quantità di estratti acellulari sincronizzati al interfase del ciclo cellulare. Gli estratti uovo può essere facilmente ed economicamente realizzato. È relativamente facile danneggiare il DNA o cromatina e per rivelare un difetto del checkpoint danno al DNA dopo immunodepleting una proteina bersaglio estratto da uovo. Successivamente, un difetto di f...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 anticorpo </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Chk1 anticorpo </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metile methanesulfonate (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Esempio di buffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Benna per la deposizione delle uova </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 centrifuga IEC con rotore oscillante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotore oscillante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 più centrifuga superspeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Reticolante UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzioni </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, regolare il pH a 7,8 con NaOH 10 M </td></tr><tr><td> Aprotinina / leupeptina magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in acqua ciascuno. Memorizzare 20 pl aliquote a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M saccarosio, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, regolare il pH a 7,5 per HCl </td></tr><tr><td> Cicloeximide magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in acqua. Negozio aliquote da 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Citocalasina B magazzino </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Memorizzare 20 pl aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) stock </td><td></td><td></td><td> 1 M in acqua. Negozio aliquote da 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M saccarosio, 1 mM DTT, 50 pg / ml cicloeximide, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM di HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole magazzino </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. Memorizzare aliquote di 5 pl a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energy Miscela </td><td></td><td></td><td> Creatina fosfato 375 mM, ATP 50 mM, e 25 mM MgCl 2. Aliquote vengono salvate a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Soluzione colorante nucleare </td><td></td><td></td><td> 0,4 mcg / ml Hoechst 33258, glicerolo 25%(V / v), in PBS 1x </td></tr><tr><td> Tautomycin magazzino </td><td></td><td></td><td> 100 mM in DMSO. Memorizzare aliquote da 10 pl a -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

studio del danno al dna con checkpoint<em&gt; xenopus</em&gt; uovo estratti

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Su base giornaliera, le cellule vengono sottoposte ad una serie di insulti endogeni e ambientali. Per combattere questi insulti, le cellule si sono evoluti danno checkpoint del DNA segnalazione come un meccanismo di sorveglianza per rilevare danni al DNA e dirette risposte cellulari al danno al DNA. Ci sono diversi gruppi di proteine ​​chiamate sensori, trasduttori ed effettori coinvolti nella segnalazione checkpoint danni al DNA (Figura 1). In questo complesso percorso di segnalazione, ATR (ATM e RAD3 correlato) è uno dei principali chinasi che può rispondere al danno del DNA e stress replicazione. Attivato ATR può fosforilare i suoi substrati a valle, come Chk1 (Checkpoint chinasi 1). Di conseguenza, fosforilata e attivata Chk1 porta a molti effetti a valle nel checkpoint danno del DNA compresi arresto del ciclo cellulare, l&#39;attivazione della trascrizione, danni riparazione del DNA, e apoptosi o senescenza (Figura 1). Quando il DNA è danneggiato, non riuscendo ad attivare i risultati danno checkpoint del DNA in unrepdanni in onda e, successivamente, instabilità genomica. Lo studio del punto di controllo danno al DNA chiariranno come le cellule di mantenere l&#39;integrità genomica e fornire una migliore comprensione di come malattie umane, quali il cancro, lo sviluppo. Xenopus laevis estratti di uova stanno emergendo come un potente sistema acellulare modello estratto nella ricerca checkpoint danni al DNA. A bassa velocità estratto (LSE) è stato inizialmente descritto dal gruppo Masui 1. L&#39;aggiunta di cromatina spermatica demembranated ai risultati LSE in formazione nuclei dove viene replicato DNA in maniera semiconservativa volta per ciclo cellulare. La via di segnalazione ATR/Chk1-mediated checkpoint viene attivata da danni al DNA o stress replica 2. Due metodi sono attualmente utilizzati per indurre il checkpoint danno al DNA: approcci che danneggiano il DNA e il DNA danni che imitano le strutture 3. Danno al DNA può essere indotta da raggi ultravioletti (UV) di irradiazione, γ-irradiazione, metil metanoesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitrochinolina-1-ossido di (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS è un agente alchilante che inibisce la replicazione del DNA e attiva il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA 4-7. Irradiazione UV innesca anche il danno ATR/Chk1-dependent 8 checkpoint del DNA. Il danno che imitano la struttura del DNA AT70 è un complesso di due oligonucleotidi ricotto-poli (dA) 70 e poli-(dT) 70. AT70 Il sistema è stato sviluppato nel laboratorio di Bill Dunphy ed è ampiamente utilizzato per indurre ATR/Chk1 segnalazione checkpoint 9-12. Qui, descriviamo protocolli (1) per preparare estratti privi di cellule uovo (LSE), (2) per il trattamento di cromatina spermatica Xenopus con due DNA diversi approcci di danneggiare (MMS e UV), (3) per preparare il danno-imitazione struttura del DNA AT70, e (4) per attivare il checkpoint ATR/Chk1-mediated danno al DNA in LSE con cromatina sperma danneggiato o un danno che imitano la struttura del DNA.

Xenopus uovo estratto è un sistema modello utile per studiare il punto di controllo danno al DNA. Questo protocollo è per la preparazione di estratti di uova di Xenopus e danno del DNA reagenti inducenti checkpoint. Queste tecniche sono adattabili ad una varietà di approcci di danneggiamento del DNA nello studio del DNA segnalazione checkpoint danni.

Studio del danno al DNA con Checkpoint<em&gt; Xenopus</em&gt; Uovo Estratti

Su base giornaliera, le cellule sono soggette a una varietà di insulti endogeni e ambientali. Per contrastare tali insulti, le cellule hanno evoluto sistemi di riparazione del danno al DNA...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il checkpoint del danno al DNA utilizzando estratti di uova di xip come sistema modello. In primo luogo, preparare un estratto a bassa velocità ottenuto da uova di xip. Successivamente, preparare cromatina spermatica danneggiata mediante trattamenti che inducono danno al DNA, come MMS e luce UV.Preparare anche la struttura che imita il danno al DNA. Un T 70 procede ad attivare il checkpoint del danno al DNA nell'LSE con la cromatina spermatica danneggiata o con un T 70. Infine, i risultati ottenuti dagli immunoblot possono fornire informazioni sul checkpoint del danno al DNA mediato da a TR nell'estratto uovo di xenopus.Ciao a tutti. Sono CH Y del dipartimento di biologia dell'Università della Carolina del Nord a Charlotte. Oggi vi mostreremo come l'estratto di pus venga utilizzato come sistema modello per studiare il danno al punto di segnalazione tecnologico.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'instabilità dinamica, ad esempio in che modo viene attivato il checkpoint del danno al DNA. Questo protocollo riguarda la preparazione di estratti di uova opus e di reagenti in grado di indurre

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La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare l'imaging vivo per visualizzare gli effetti dei danni ossidativi sulla localizzazione e dinamica delle strutture subcellulari nelle ovaie di Drosophila.

Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l&apos;imaging dal vivo

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Mantenere l'integrità del genoma dell'ovocita è necessario per garantire la fedeltà genetica nell'embrione risultante. Qui, presentiamo un protocollo accurato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule germinali femminili dei mammiferi.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Impara a studiare il checkpoint del danno al DNA utilizzando estratti di uova di Xenopus. Questo metodo permette di analizzare l'attivazione del checkpoint mediato da ATR-Chk1 e i meccanismi di riparazione del DNA.

Studio del danno al DNA con Checkpoint

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