Insulina Microiniezione ippocampale e In vivo Durante il test di memoria spaziale

Lo scopo generale di questa procedura è misurare il metabolismo ippocampale durante test comportamentali. Questo viene ottenuto preparando chirurgicamente un animale ben manipolato con una cannula guida per microdialisi. Nel giorno del test, una sonda per microdialisi viene inserita nella cannula e si verifica il flusso PERFUSE eight.

Successivamente, si permette al sonda di equilibrarsi mentre l'animale è seduto in una camera di controllo. Infine, metodi analitici appropriati, ad esempio una reazione di glucosio ossidasi, NADP, N-A-D-P-H e analisi fluorimetrica. Se la misurazione del glucosio viene utilizzata per mostrare il livello di metabolismo e/o di rilascio neurochimico durante il periodo di prova, uno degli aspetti più difficili di questa tecnica è l'attenzione necessaria nella manipolazione del tubo di microdialisi e il fatto che spesso gli animali lo rosicchiano o aggrovigliano i collegamenti se non si presta sufficiente attenzione.

La prima volta che ho utilizzato la microdialisi ippocampale durante test comportamentali è stata durante il mio lavoro di dottorato, e volevamo verificare se i modelli esistenti riguardo all'apporto di glucosio fossero effettivamente compatibili con i dati psicologici noti sull'incremento della memoria indotto dal glucosio. Questa metodologia ci ha permesso di dimostrare che, in effetti, i modelli esistenti sul glucosio applicati al cervello erano completamente errati.

Seguendo le procedure chirurgiche standard, preparare l'animale, esporre il cranio e praticare fori per il posizionamento della cannula. Inserire una cannula alle coordinate predeterminate e abbassarla lentamente fino alla profondità desiderata. Una volta posizionata correttamente, fissare la cannula in sede con cemento dentale.

Usare un filo di sutura chirurgico sterile per chiudere la ferita, se necessario. Infine, utilizzare uno stilo per mantenere la pervietà della cannula. Successivamente, preparare il PERFUSE otto da utilizzare per la microdialisi.

Si deve notare che una composizione accurata del fluido è essenziale per ottenere risultati ottimali. Nel giorno del test, l'albumina sierica bovina BSA deve essere aggiunta e completamente disciolta. Dopo la preparazione, il PERFUSE eight deve essere filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron.

Successivamente, preparare il trattamento che verrà somministrato al cervello, se previsto, utilizzando un'aliquote dell'ECF A preparato. In questo caso, l'insulina viene preparata per la somministrazione nell'ippocampo. Una sonda per microdialisi nuova e la relativa linea devono essere preparate il giorno prima della prova.

Crea due linee separate per l'ingresso e l'uscita del flusso. Usa tubi PE 50 per collegare due pezzi di tubo FEP lunghi un metro e assicurati che lo spazio morto tra le linee sia minimo. I tubi devono essere tagliati come mostrato, creando estremità oblique per facilitarne l'inserimento nei connettori PE 50.

Collegare il tubo di ingresso a una siringa Hamilton da un millilitro riempita con acqua deionizzata sterile filtrata e attaccare la sonda all’altra estremità, in modo da permettere all’animale di muoversi liberamente durante le misurazioni. Collegare i tubi di ingresso e di uscita a un gironevole a due canali. Successivamente, collegare il tubo di uscita alla pompa e farlo funzionare a 1,5 microlitri al minuto finché non si osserva l’uscita di acqua deionizzata dal tubo di uscita della sonda.

Spegnere la pompa e collegare l'altro tubo tra il tubo di efflusso e un tubo per la raccolta del campione. Far passare cinque millilitri attraverso il tubo e posizionare la sonda in una provetta contenente acqua deionizzata sterile per tutta la notte, assicurandosi che la punta della sonda rimanga sempre umida. 24 ore prima del test, preparare il soggetto mediante rimozione dello stiletto fittizio e inserimento di una sonda per microdialisi utilizzata esclusivamente a questo scopo.

Per 10 minuti successivi, sostituire il finto stilo e rimettere il ratto nella sua gabbia. In alternativa, utilizzare una sonda nuova in questa fase e lasciarla in posizione senza rimuoverla fino al momento delle misurazioni. Il giorno seguente.

Nel giorno del microdialisi, riempire la siringa Hamilton e il vial per scintillazione con A ECF filtrato e lasciare che la pompa si equilibri per un'ora. Se necessario, riempire una seconda siringa Hamilton con il trattamento preparato e posizionarla nella pompa per siringa. La chiave del successo in questa procedura è rimanere calmi e manipolare l'animale in modo molto accurato.

Pertanto, mantenersi calmi, muoversi lentamente e con precisione e, soprattutto, esercitarsi. Al termine dell'equilibrazione, rimuovere lo stiletto fittizio ed inserire delicatamente la sonda per microdialisi equilibrata nel cervello del ratto attraverso la cannula. Posizionare il ratto in una scatola di plastica trasparente contenente parte della lettiera della sua gabbia.

Assicurarsi di controbilanciare il tubicino. Fissare un microcentrifuga da 1,6 millilitri riempito di acqua al tubicino all'esterno della gabbia in modo che la forza di gravità mantenga le linee di microdialisi senza pieghe ma non in tensione. Lasciare che la sonda e il ratto raggiungano l'equilibrio per due ore.

All'inizio di questo periodo, verificare che il flusso di Perfuse eight non sia ostruito. Per fare ciò, raccogliere l'effluente di PERFUSE eight per un periodo definito e pesare il campione per confermare che il volume previsto stia uscendo dal sistema prima di raccogliere i campioni. Assicurarsi che la correlazione tra dialisi del campione e raccolta sia calcolata con precisione.

Qui abbiamo un volume di 30 microlitri tra la sonda e il punto di raccolta, con una portata di 1,5 microlitri al minuto. Vi è un ritardo di 20 minuti tra l'uscita del campione dal cervello e il suo relativo recupero. Dopo il periodo di equilibrazione, raccogliere almeno tre campioni mentre il ratto si trova a riposo nella propria camera abituale.

Per stabilire una linea di base stabile delle misurazioni prima dei test comportamentali, pianificare attentamente i tempi di somministrazione del trattamento al cervello. In questo apparato, in cui è presente un volume di 30 microlitri tra la punta della siringa e la sonda inserita nel cervello dell'animale, si sostituisce la siringa del trattamento con quella contenente la soluzione di trattamento profusa otto minuti prima. Vogliamo che il trattamento raggiunga l'ippocampo per effettuare la sostituzione delle siringhe.

Scollegare semplicemente la linea di afflusso dalla siringa di controllo del PERFUSE eight e collegarla rapidamente alla siringa del trattamento del PERFUSE eight. L'operazione non deve richiedere più di cinque secondi per evitare interruzioni del flusso del PERFUSE eight. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria che potrebbero ridurre l'efficacia nel periodo di tempo appropriato.

Dopo la somministrazione del trattamento, spostare delicatamente il ratto nell'apparato prescelto per i test comportamentali. In questo caso, l'alternanza spontanea viene misurata in un labirinto a forma di croce. Consentire all'animale di esplorare liberamente il labirinto per 20 minuti.

Registrare la sequenza e i tempi del braccio di Ariete utilizzando una registrazione video o manualmente per raccogliere i campioni. Durante questo periodo, spostare il tubo di efflusso in un nuovo tubo di raccolta. Ogni cinque minuti, tenere il tubo in modo che possa muoversi liberamente.

Non deve ostacolare i movimenti del ratto né spostarsi davanti all'animale e deve rimanere fermo in modo che i suoi movimenti non influenzino il comportamento del ratto. Al termine del test, rimuovere delicatamente il ratto dal labirinto e riportarlo nella camera di controllo. Continuare la raccolta dei campioni di microdialisi per almeno quattro campioni, in modo da coprire il periodo di recupero dopo l'esecuzione del compito.

Dopo aver raccolto i campioni desiderati, rimuovere delicatamente la sonda dalla testa dell'animale e collocarla in una provetta di conservazione. Restituire l'animale alla sua gabbia di provenienza e osservare attentamente eventuali cambiamenti post-sperimentali nello stato di salute o nel comportamento. Infine, lavare i tubicini passando a una siringa contenente una soluzione di catto per prevenire la crescita di microrganismi.

In questo esempio si osserva una diminuzione della glucosio nel liquido cerebrospinale ippocampale associata a un compito. La scatola grigia rappresenta il periodo in cui l'animale ha trascorso nel labirinto. La linea viola mostra i livelli di glucosio ippocampale in animali senza test nel labirinto, mentre la linea rossa rappresenta gli animali che eseguono il compito di alternanza spontanea dell'avambraccio.

La linea arancione mostra le misurazioni effettuate sugli animali che eseguono la versione più semplice di questo compito con tre bracci. Qui si osservano i cambiamenti nell'ippocampo, nel glucosio e nel lattato dopo l'amministrazione di insulina. Si noti che questi cambiamenti si verificano senza alcun test comportamentale, e riflettono quindi l'effetto dell'insulina da sola in condizioni basali.

Quando si esegue questa procedura, è molto importante rimanere calmi. I ratti possono percepire lo stato di stress dell'esperimentatore e diventano agitati, il che può rendere la procedura molto più difficile e probabilmente alterare i risultati. Questa combinazione di tecniche ha permesso un'accurata indagine neurochimica dei processi comportamentali.

Tecniche simili sono ora utilizzate anche nei pazienti umani. Ad esempio, pazienti con epilessia che hanno elettrodi impiantati per localizzare il focus delle crisi possono avere anche una cannula per microdialisi impiantata, per consentire misurazioni metaboliche.