Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Lo scopo del seguente esperimento è quello di attivare e studiare i circuiti neuronali a lungo termine in topi svegli e comportanti. Questo metodo è adattato dal concetto originariamente descritto in Sparta etal. Ciò si ottiene assemblando prima un cavo di coppia in fibra ottica, che collega il giunto rotante ottico all'impianto in fibra ottica.

Successivamente, la fibra ottica viene impiantata sul tessuto cerebrale di interesse per creare un passaggio per la luce per viaggiare direttamente verso il canale che esprime i neuroni che esprimono la redina. Infine, la sorgente luminosa è collegata al giunto rotante ottico per creare un percorso collegato in serie dalla sorgente luminosa al tessuto cerebrale. In definitiva, l'attivazione indotta dalla luce di neuroni che esprimono la redsina del canale può essere valutata sulla base di studi in vivo, elettrofisiologici e comportamentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le cannule guida è che riduce al minimo il danno al tessuto cerebrale causato dall'inserimento e dalla rimozione ripetuti di una fibra ottica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione del circuito neurale, può anche essere applicato ad altri sistemi per comprendere meglio i meccanismi dipendenti dalle sinapsi e dai circuiti che sono alla base di alcuni tipi di disturbi neurologici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Poiché le fasi di impianto sono difficili da padroneggiare, ogni fase apparentemente minore contribuisce notevolmente alla stabilità e all'affidabilità complessive del metodo. Inizia tagliando 35 millimetri di una fibra ottica di 125 micron di diametro con un nucleo di 100 micron posizionando uno scriba in carburo con punta a cuneo perpendicolare alla fibra ottica e incidendo la fibra in un unico movimento unidirezionale seguito da un'estrazione diritta. Ora, inserisci un feral in ceramica lc con un foro di 127 micron in un diametro con il lato convesso rivolto verso il basso in una morsa e poi inserisci il pezzo in fibra ottica nel feral.

La fibra ottica dovrebbe scorrere dolcemente e sporgere marginalmente oltre l'estremità convessa del selvatico. Quindi applicare una goccia di resina epossidica in fibra ottica termopolimerizzabile appena preparata sull'estremità piatta del feral, quindi applicare una pistola termica sulla resina epossidica. La resina epossidica dovrebbe riempire il selvatico quando viene riscaldato e si indurisce quando diventa nero.

Dopo l'indurimento, pulire la resina epossidica dai lati del feral, quindi utilizzando un disco di lucidatura in fibra ottica lc esegue modelli di rotazione circolare per lucidare l'estremità convessa del feral su fogli di lucidatura in ossido di alluminio su un tampone di lucidatura su quattro gradi decrescenti. Quindi tagliare la fibra ottica all'estremità piatta alla lunghezza appropriata per mirare alla regione di interesse. Per testare la fibra ottica lucidata, inserire l'estremità lucidata dell'impianto nel manicotto dell'accoppiatore.

Fino a quando non si avverte il contatto diretto con il selvatico opposto, un impianto difettoso avrà un punto focale debole vicino alla punta della fibra ottica, mentre un buon impianto trasmetterà un cerchio concentrico liscio di luce senza uscita. Le potenze fino a 10 milliwatt conservano gli impianti finiti in schiuma fino all'uso. Inizia questo passaggio misurando e quindi incidendo una fibra ottica di 220 micron di diametro con un nucleo di 200 micron per consentire a un mouse di muoversi liberamente ma non consentire al mouse di masticare la fibra.

Quindi inserire la fibra ottica in un pezzo di tubo di furazione con un diametro interno leggermente più grande e una lunghezza leggermente inferiore a quelli della fibra ottica. Ora, spellare circa 25 millimetri da un'estremità della fibra ottica e inserirla nell'estremità metallica di un gruppo feral FC MM multimodale. Con un foro di 230 micron di diametro fino all'arresto, la fibra ottica dovrebbe sporgere attraverso l'estremità selvaggia.

Quindi, fissare la connessione con cianoacrilato all'estremità metallica e coprire la connessione con un connettore Lucidare l'estremità selvaggia con un disco lucidante FC come appena dimostrato. Dopo aver spogliato l'altra estremità della fibra ottica, inseriscila in un feral in ceramica lc con solo l'estremità convessa distale. Quindi applicare una goccia di resina epossidica sull'estremità piatta e riscaldare fino a quando non si sarà indurito come appena dimostrato.

Dopo aver lucidato l'estremità convessa del feral come appena dimostrato, far scorrere un manicotto feral lc sull'estremità convessa del feral fino a quando il feral raggiunge il punto medio del manicotto. Quindi posizionare una guaina termorestringente sopra la guaina e il manicotto e riscaldare il tubo termorestringente in modo che la connessione sia sicura e protetta. Infine, collegare il feral alla sorgente laser e quindi testarlo misurando l'emissione di luce attraverso l'accoppiatore con uno spettrofotometro, la perdita di luce tra l'uscita laser e l'uscita dell'accoppiatore misurata non deve superare il 30% prima di iniziare l'intervento chirurgico.

Disinfettare l'area chirurgica con alcool isop profile seguito da una soluzione di clorexidina. Quindi, posiziona il mouse nel rig stereotassico e fissa la testa assicurandoti che il cranio sia a livello. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire secchezza e dolore postoperatorio.

Ora fai un'incisione attraverso la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio dalle orbite dell'occhio alla sutura lambda. Usa i morsetti serafin per trattenere la pelle e mantenere l'accesso al cranio. Quindi usa un plettro dentale per incidere un motivo a scacchi su tutta la superficie del cranio.

Lavare via i detriti risultanti con soluzione fisiologica sterile. Dopo un'asciugatura accurata, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare il 3% di perossido di idrogeno sul cranio esposto per circa due o tre secondi per creare micropori. Quindi lavare il cranio più volte con altra soluzione fisiologica sterile e asciugarlo accuratamente.

Dopo l'incisione, il lavaggio e l'asciugatura del modello a scacchiera nel cranio, inserire nuovamente l'impianto ferale in fibra ottica nel supporto della sonda e quindi collegarlo al braccio stereotassico. Determinare la posizione del foro della fresa con un atlante stereotassico calibrato su bgma e lambda. Quindi utilizzare un trapano dentale rotante per eseguire una craniotomia con un piccolo foro di meno di un millimetro di diametro sopra la regione di interesse, facendo attenzione a non rompere la dura madre o danneggiare alcun tessuto.

Utilizzando il braccio stereotassico, posizionare l'impianto in posizione direttamente sopra la regione di interesse, il selvatico dovrebbe poggiare sul tessuto cranico circostante. Ora usa uno stuzzicadenti sterile per applicare uno strato sottile e uniforme di cemento dentale appena preparato sul cranio e sulla parte inferiore dell'impianto. Facendo attenzione a non entrare in contatto con la pelle dell'animale, lo strato di base di cemento dentale dovrebbe coprire quanta più superficie possibile sul cranio.

L'aspetto più difficile di questa procedura è l'applicazione del cemento dentale senza che tocchi la pelle di massa. Per garantire il successo, applicare piccole quantità di cemento alla volta in strati sottili e attendere che ogni strato si asciughi completamente prima di aggiungere il successivo. Applicare strati uniformi di cemento dentale per formare un piccolo tumulo sopra il cranio e intorno all'impianto.

Lasciare i tre o cinque millimetri dell'estremità convessa del feral puliti dal cemento per consentire una connessione liscia e senza ostacoli. Quindi suturare il cuoio capelluto sopra il cumulo di cemento dentale e intorno all'impianto, l'adesivo veterinario può essere utilizzato per un ulteriore legame dopo la sutura. Infine, applicare analgesici topici e antibiotici sulla pelle della sutura e intorno alla base dell'impianto, quindi posizionare il topo in una gabbia per il recupero postoperatorio.

Il corretto assemblaggio dell'impianto e dell'accoppiatore in fibra ottica comporta una perdita minima di fotoni tra la sorgente luminosa e l'estremità della fibra ottica nella regione di interesse. Mentre le fibre ottiche lucidate dovrebbero trasmettere la luce in un cerchio concentrico uniforme simile al cerchio mostrato qui, come si può vedere in questa immagine con un accurato impianto e sutura, l'impianto non provoca irritazione visibile al topo e può rimanere in posizione per studi a lungo termine senza alcun degrado significativo della fibra ottica o della quantità di luce trasmessa I saggi comportamentali funzionali in un topo sveglio mostrano una risposta diretta dalla stimolazione attraverso una fibra ottica impiantata sopra la corteccia motoria come evidenziato da questi dati video di elettrofisiologia in vivo che mostrano l'attivazione di neuroni mirati attraverso l'impianto e la risposta comportamentale dell'animale durante la stimolazione cerebrale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fotostimolazione di regioni cerebrali mirate per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono i modelli di connettività del circuito associati alle cellule bersaglio?

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare impianti in fibra ottica e cavi di accoppiamento e come impiantarli su tessuto cerebrale che esprime portatori optogenetici.