Name: Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri un saggio di migrazione per cellule di Schwann murine lungo assoni in crescita su matrici di collagene con NGF. Questo metodo include l'habitat naturale delle cellule per studiare la rigenerazione dei nervi periferici.

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Vogliamo ringraziare Arumae Urmas per la condivisione di un protocollo di collagene e Jutta Fey e Ursula Hinz per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Inoltre vogliamo ringraziare Christian F. Ackermann, Ulrike Engel e la Nikon Imaging Center presso l&#39;Università di Heidelberg e anche per Joachim Kirsch aiuto gentile per il Shoting video. Il lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Preparazione del gel di collagene <ol><li> Preparare un mezzo magazzino, contenente 455 microlitri MEM 10x, 112 microlitri NaHCO 7,5% 3, 50 microlitri glutammina e NaOH. La concentrazione e la quantità di NaOH dipende dalla coda di topo preparazione collagene (vedere 1.2), il volume finale del mezzo magazzino essendo 1.000 microlitri. </li><li> Preparare coda di topo collagene secondo Ebendal (1). Conservare la soluzione di collagene a 4 ° C. Una degradazione del collagene soluzione non poteva essere osservato. Dopo la preparazione di un nuovo gruppo, valutare la concentrazione di NaOH necessaria per il mezzo stock (vedere 1.1). Utilizzare il pH del mezzo indicatore per la titolazione della quantità e concentrazione di NaOH. 800 microlitri acido coda di topo collagene deve girare una tonalità di rosso quando miscelato con 210 ml di mezzo di brodo. Se la concentrazione di NaOH è troppo bassa la soluzione di collagene diventa giallo, per l&#39;indicatore di pH del mezzo. Aggiungi il collagene al mezzo e mescolare senza prodottiucing bolle. Eseguire questi passaggi su ghiaccio. La polimerizzazione si verifica entro 2 ore dopo la soluzione di collagene e il mezzo magazzino sono stati mescolati e la nuova soluzione viene incubata a 37 ° C. Prova questo prima di iniziare un esperimento. 1.3) Mescolare 800 ml di soluzione di collagene con pl 210 di media stock (vedi 1.2). Posto 100 pl di questa soluzione in pozzetti di una slitta 8 camera bene. Incubare i vetrini a 37 ° C, 5% di CO 2 e umido in una cella incubatore. Preparare i gel di collagene sotto un banco di coltura cellulare e condizioni sterili. Il collagene gelatinizes entro 2 ore. </li></ol> 2. Dissezione di SCGS embrionali <ol><li> Harvest embrioni di topo gravide tempo (E16-18) dall&#39;utero e tenerli in PBS fino a nuovo necessario. </li><li> Staccare un embrione dalla membrana amniotica. Decapitare il caudale dell&#39;embrione del livello clavicolare. Fissare la testa su un piatto fondo di silicio con &quot;insetto-aghi&quot;. Il lato ventrale della testa deve affrontare a voi und si deve vedere la regione sottomandibolare. Il fissaggio per un facile preparazione. </li><li> Rimuovere la pelle della regione sottomandibolare destra e sinistra e con essa la sottocutaneo tessuto connettivo. </li><li> Rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari dalla loro posizione per cancellare la vista sulla ioide, i muscoli infrahyoidal e il muscolo sternocleidomastoideo. </li><li> Rimuovere questi muscoli con attenzione per eliminare la vista sulla laringe e della trachea. Rimuovere la trachea e la laringe. Le arterie carotidi sono quindi visibili da entrambi i lati sui muscoli prevertebrali. Il SCG si trova nella biforcazione delle arterie carotidee e ha una forma ovale. Rimuovere con attenzione i gangli e metterli in PBS. Rimuovere i gangli delicatamente dagli strumenti di dissezione se sono aderiscano. E &#39;vantaggioso utilizzare pinze nonché un porta aghi montato con un &quot;ago insetto&quot; per la rimozione SCG. </li><li> Una volta in PBS, memorizzare i gangli a temperatura ambiente in PBS fino sezionato enougangli gh. Quindi pulire i gangli dai vasi sanguigni e tessuto connettivo. Eseguire la dissezione SCG e pulizia sotto un microscopio da dissezione posta sotto un banco di flusso laminare. </li><li> Infine, posizionare i gangli espiantato sui gel di collagene gelatinizzati con l&#39;aiuto della siringa aghi montati su una siringa per facilitarne la movimentazione. </li><li> Incubare le espianti SCG sul collagene gelificato in un incubatore per colture cellulari a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide. </li></ol> 3. Trattamento di espianti SCG <ol><li> Dopo 1-2 ore di incubazione, coprire il collagene espianto SCG contenente terreno con 100 microlitri Neurobasal coltura cellulare contenente B27 supplemento, glutammina e antibiotici. Ora i pozzetti dei vetrini camera contiene un volume di 200 pl (100 microlitri gel e 100 microlitri media). Aggiungere altri 200 pl di mezzo, ma ora contenenti NGF (60 ng / ml) per facilitare la crescita assonale. Di conseguenza la concentrazione finale NGF è di 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per studiare l&#39;insorgenza di SC migrazione, aggiungere ulteriori fattori direttamente al giorno in vitro 0 (DIV0). Sciogliere i fattori a medio NGF, contenenti, in doppia concentrazione necessaria (2). </li><li> Al fine di analizzare l&#39;impatto sulla SC, che ha già iniziato la migrazione lungo gli assoni, aggiungere ulteriori fattori a DIV3 fino DIV4 (fermata potenzialità dell&#39;esperimento). A tal fine, rimuovere attentamente 180 microlitri della soluzione, a DIV3, e aggiungere 200 microlitri NGF nuovo mezzo e contenente gli elementi complementari di interesse a doppia concentrazione (2). </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse imaging Utilizzare un microscopio invertito per le analisi. Vari obiettivi possono essere utilizzati, definire il campo di vista e l&#39;ingrandimento. Un aspetto importante, tuttavia, è la distanza di lavoro dell&#39;obiettivo utilizzato, come l&#39;imaging degli espianti SCG viene eseguita attraverso il vetrino e il collagenegel. Il frame rate di registrazione di 1/10-30 minuti ha mostrato buoni risultati (2). Tuttavia, questo aspetto deve essere adattata alla domanda scientifica. Una telecamera CCD normale può essere utilizzato per l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Per l&#39;imaging time lapse una coltura cellulare camera di incubazione deve essere attaccata alla fase del microscopio. Incubare il tessuto durante l&#39;esposizione a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide. Avviare il sistema di incubazione uno ora prima dell&#39;inizio imaging. Ciò consente alle parti microscopio (es. obiettivo) compresa la camera di scorrimento per regolare la temperatura e impedisce derive termiche indotte. Definire le aree specifiche di analisi (entro il espianto e tra espianti diversi) con l&#39;aiuto del software microscopio e con un programma di controllo fase motore (installazione multiposizione) per le analisi simultanee di diverse condizioni applicate agli espianti SCG. Per time-lapse immagini dei tessuti di tipo selvatico e tessuti di animali transgenici può essere utilizzatosegnando la SC (S100B: GFP) (3). Per fluorofori immagini una sorgente di luce fluorescente deve essere attuata nel setup micropscope. Utilizzare i filtri standard. 5. Quantificazione dei SC distanze di migrazione <ol><li> Al punto finale (DIV4 per esempio), fissare il gel di collagene con il 4% PFA nella scatola di controllo per ora 3-4. Consecutivamente lavare i gel di collagene 5 volte per 10 minuti con PBS. Applicare protocolli standard per l&#39;immunoistochimica (2). Se siete nuovi alla preparazione di SCGS, verificare l&#39;identità del ganglio come un ganglio simpatico di immunoistochimica contro la tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per le cellule catecolaminergici comune. Durante immunoistochimica (dopo l&#39;anticorpo primario), trasferire i contenenti gel di collagene explant a piastre da 24 pozzetti, che hanno un volume maggiore, che è vantaggioso per il lavaggio del gel. </li><li> Dopo immunoistochimica, posizionare con attenzione il gel di collagene su vetrini. Attentamenterimuovere la soluzione restante e lasciare asciugare il collagene / ridursi a due dimensioni. Questo permette facili misurazioni di distanze (2). Dopo questo, montare i campioni. </li><li> Infine, misurare le distanze di migrazione con l&#39;aiuto di Figi (NIH) software. Nessun plugin speciali sono necessari a tal fine. Per consentire misurazioni corrette in pm, controllare i metadati corretto imaging e le impostazioni con il Fiji, l&#39;immagine e la scala. Utilizzare Fiji anche per la quantificazione delle cellule. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Lo sviluppo del sistema nervoso periferico è un processo eccitante. Quando l&#39;elaborazione è completata, assoni sono ensheathed da SCS per tutta la lunghezza, che può, in esseri umani, spesso oltre 100 cm. A tal fine il numero corretto dei SCs necessari deve essere stabilito durante lo sviluppo e la SCS devono anche muoversi lungo assoni si estendono verso la periferia per garantire la copertura completa assonale. Questo vale per assoni unmeylinated mielinizzati ma anche per. In entrambi i casi tutti assoni sono in c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di Sodio (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; S # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> antibiotici </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> d-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> aghi insetti </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> siringa con ago </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 Fare scorrere camera ben </td><td> Lab tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

analizzando lo sviluppo delle cellule di schwann murine lungo gli assoni in crescita

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

Lo sviluppo dei nervi periferici è un processo intrigante. I neuroni inviano assoni per innervare obiettivi specifici, che negli esseri umani sono spesso più di 100 cm di distanza dal soma del neurone. Sopravvivenza neuronale durante lo sviluppo dipende destinazione fattori di crescita derivati ​​ma anche sul supporto di cellule di Schwann (SC). A questo fine assoni ensheath SC della regione del soma neuronale (o il passaggio dalla centrale per il sistema nervoso periferico) alla sinapsi o giunzione neuromuscolare. Le cellule di Schwann sono derivati ​​della cresta neurale e la migrazione come precursori lungo gli assoni emergenti fino a quando l&#39;assone è coperto con SCS. Ciò dimostra l&#39;importanza di SC migrazione per lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sottolinea la necessità di studiare questo processo. Al fine di analizzare lo sviluppo SC, una messa a punto è necessario che accanto alle SC comprende anche la loro substrato fisiologico per la migrazione, l&#39;assone. Grazie allo sviluppo intrauterino <em&gt; in vivo time-lapse imaging, tuttavia, non è fattibile in vertebrati placentari come topo (mus musculus). Per ovviare a questo, abbiamo adattato il ganglio cervicale superiore (SCG) tecnica di espianto. Dopo il trattamento con il fattore di crescita nervosa (NGF) espianti SCG estendere assoni, seguiti da precursori SC migrano lungo gli assoni dal ganglio alla periferia. La bellezza di questo sistema è che la SC sono derivati ​​da un pool di SC endogena e che migrano lungo i loro assoni proprie fisiologici che crescono contemporaneamente. Questo sistema è particolarmente interessante, in quanto lo sviluppo SC lungo gli assoni possono essere analizzati con time-lapse imaging, aprendo ulteriori possibilità di acquisire conoscenze in migrazione SC.

Crescita assonale è facilitato dal SCG espianti seguito al trattamento con NGF (4) (regime film S1 Figura 1 schema). Questo processo è facilmente visibile da qualsiasi microscopio invertito e può essere seguito da time-lapse imaging (film S2). Se uno scienziato è una novità per la dissezione SCG da embrioni di topo si consiglia vivamente una validazione della tecnica da un semplice anti-tirosina idrossilasi (TH) immunoistochimica. TH è un marker comune per i neuroni catecolamine (in que...

Qui descriviamo una delle cellule di Schwann (SC) saggio transizione, in cui SC sono in grado di sviluppare lungo gli assoni si estendono.

Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Lo scopo del seguente esperimento è quello di analizzare lo sviluppo delle cellule di schwan lungo la crescita degli assoni, il loro habitat naturale. Ciò si ottiene con il primo ex explan dei gangli cervicali superiori, o S cgs di embrioni di topo su matrici di collagene come secondo passaggio. Gli S cgs sono trattati con il fattore di crescita nervoso o NGF, che facilita la crescita assonale dai neuroni SCG in modo coronale.Oltre alla crescita assonale dall'explan X, si possono osservare cellule di schwan endogene che migrano lungo gli assoni estesi verso la periferia. Lo sviluppo delle cellule di Schwan può essere analizzato mediante imaging time-lapse e anche mediante analisi degli endpoint del tessuto fisso, che consente misurazioni a distanza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di migrazione da graffio, è che l'habitat naturale delle cellule del cigno è incluso in questo saggio.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché il corretto assemblaggio delle metriche del collagene e la corretta dissezione dell'sgs sono la chiave del successo. Questi passaggi non sono particolarmente difficili da imparare.Hanno s

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Questo articolo si propone di descrivere in modo graduale comunemente...

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Questo video mostra il modello di cocoltura di un espiante di ganglio della radice dorsale e cellule di Schwann. In condizioni di cocoltura, l'acido ascorbico promuove la differenziazione delle cellule di Schwann in forme mielinizzanti. Le cellule mielinizzanti di Schwann avvolgono gli assoni più volte per creare una guaina mielinica, essenziale per la funzione nervosa.

Co-coltura di un espiante di ganglio della radice dorsale con cellule di Schwann per la mielinizzazione dei neuroni

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.

Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri un saggio di migrazione per cellule di Schwann murine lungo assoni in crescita su matrici di collagene con NGF. Questo metodo include l'habitat naturale delle cellule per studiare la rigenerazione dei nervi periferici.

Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

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