Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

Lo scopo del seguente esperimento è quello di analizzare lo sviluppo delle cellule di schwan lungo la crescita degli assoni, il loro habitat naturale. Ciò si ottiene con il primo ex explan dei gangli cervicali superiori, o S cgs di embrioni di topo su matrici di collagene come secondo passaggio. Gli S cgs sono trattati con il fattore di crescita nervoso o NGF, che facilita la crescita assonale dai neuroni SCG in modo coronale.

Oltre alla crescita assonale dall'explan X, si possono osservare cellule di schwan endogene che migrano lungo gli assoni estesi verso la periferia. Lo sviluppo delle cellule di Schwan può essere analizzato mediante imaging time-lapse e anche mediante analisi degli endpoint del tessuto fisso, che consente misurazioni a distanza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di migrazione da graffio, è che l'habitat naturale delle cellule del cigno è incluso in questo saggio.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché il corretto assemblaggio delle metriche del collagene e la corretta dissezione dell'sgs sono la chiave del successo. Questi passaggi non sono particolarmente difficili da imparare.

Hanno solo bisogno di pratica prima. Mentre lavoravamo in una cappa di coltura tissutale, abbiamo compreso le nostre condizioni con tutte le soluzioni sul ghiaccio. Preparare il terreno di coltura madre e il collagene della coda di ratto secondo le istruzioni nel protocollo scritto.

Mescolare, 800 microlitri di collagene di coda di topo con 210 microlitri del terreno madre. Senza introdurre bolle, la soluzione dovrebbe rimanere di un colore rosso. Se la soluzione diventa gialla, la soluzione di collagene Ratal è troppo acida e deve essere rifatta con una concentrazione maggiore di idrossido di sodio Pipetta 100 micro rilascio della soluzione in ciascun pozzetto di un vetrino multipozzetto e assicurarsi che il fondo di ciascun pozzetto sia completamente coperto.

Posizionare le piastre in un incubatore di coltura tissutale umidificato impostato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due ore. Dopo il raccolto, gli embrioni da E 16 a E 18 vengono posti in una capsula di Petri contenente PBS, quindi sezionati dall'amnio e decapitati a livello cordale del C clavicolare. Le regioni della testa e del collo vengono quindi trasferite su un piatto inferiore in silicone e, mentre si guarda attraverso un microscopio da dissezione, vengono utilizzati aghi di insetti per bloccare il tessuto nelle regioni sottomandibolare e clavicolare.

Ora usa una pinza per rimuovere la pelle e il tessuto sottocutaneo della regione sottomandibolare. Quindi rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari per rivelare i muscoli sovraioide, infra ilaterali e sternocleidomastoideo. Successivamente, usa una pinza per rimuovere con cura i muscoli infra hiali e sternocleidomastoideo per rivelare la laringe e la trachea.

Afferrare la trachea con la pinza e sollevare la trachea e la laringe. Una volta rimosse la laringe e la trachea, le arterie carotidi sono visibili, sono entrambi i lati dei muscoli prevertebrali. I gangli cervicali superiori si trovano nella biforcazione delle arterie carotidi e possono essere identificati come una forma ovale.

Utilizzare una pinza e un portaago montato con un ago per insetti per rimuovere i gangli cervicali superiori e metterli in un piatto fresco contenente PBS, quindi sezionare eventuali vasi sanguigni o tessuti collegati dai gangli. Con l'aiuto degli aghi per siringa, rimuovere i gel di collagene gelatinizzato dall'incubatrice e utilizzare gli aghi per siringa montati sulle siringhe per trasferire i gangli sui gel. Posizionare gli espianti nell'incubatore per colture tissutali impostato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e condizioni umide per una o due ore.

Dopo una o due ore di incubazione, gli espianti del ganglio cervicale superiore vengono recuperati dall'incubatore di coltura tissutale e a ciascun esempio vengono aggiunti 100 microlitri di terreno neurobasale contenente glutammina B 27 e antibiotici. Successivamente, 200 microlitri di terreno neuro basale contenente 60 nanogrammi per millilitro. L'NGF viene anche aggiunto ai pozzetti per facilitare la crescita assonale.

In questo momento possono essere aggiunte anche sostanze in esame, che è definito come giorno zero in vitro, per studiare l'effetto sulle cellule di cigno che hanno già iniziato a migrare. Le sostanze degli assoni possono essere somministrate in vitro a tre giorni rimuovendo 180 microlitri del terreno esistente e sostituendole con 200 microlitri di terreno contenenti la sostanza di interesse e NGF al doppio della concentrazione finale, l'imaging time-lapse viene eseguito utilizzando una configurazione al microscopio invertito che consentirà l'incubazione parallela di colture cellulari e l'imaging time-lapse per confrontare diverse sostanze in esame. In un esperimento, si consiglia un'impostazione multiposizione al punto finale dell'esperimento.

Dopo aver fissato gli espianti all'interno dei vetrini di coltura con PFA al 4% per tre o quattro ore e aver lavato con PBS, eseguire l'immunoistochimica per convalidare l'espiante X poiché l'SCG blocca il tessuto con PBS contenente il 10% di siero d'asino normale e il 2% di tritton X 100 per due ore. Proseguire quindi con l'incubazione degli anticorpi primari in soluzione bloccante per una notte. Il giorno successivo, dopo l'incubazione degli anticorpi primari, trasferire i gel contenenti X explan su una piastra a 24 pozzetti, dopo il lavaggio con PBS, incubare con anticorpi secondari marcati con fluorescenza per due ore al riparo dalla luce, quindi lavare con PBS e incubare con una soluzione dappy per 10 minuti.

Dopo aver lavato più volte, posizionare i gel di collagene contenenti l'X explan su un microscopio, far scivolare, asciugare i vetrini e successivamente montarli con la carne di vitello. Utilizzare un microscopio a fluorescenza standard per ottenere immagini per una successiva analisi quantitativa. È utile se il software del microscopio è in grado di registrare i metadati.

L'analisi quantitativa delle immagini ottenute può essere eseguita con il software Fiji o ImageJ, che può essere utilizzato gratuitamente per applicazioni scientifiche. In questo filmato viene dimostrata la crescita assonale da uno schematico SCGX EXPLAN nell'arco di quattro giorni in vitro. L'immunoistochimica può essere eseguita il quarto giorno in vitro per identificare chiaramente il ganglio espiantato.

Come ganglio simpatico, le cellule di schwan possono essere osservate migrare lungo l'assone, spostandosi dal ganglio cervicale superiore alla periferia. Questo video mostra lo stesso modello di migrazione appena visto a un ingrandimento maggiore. Le distanze di migrazione possono essere facilmente misurate su campioni di controcolorazione per nuclei con DPI misurando la distanza dai nuclei delle principali cellule di schwan al confine dell'SCG espiantato in più posizioni, come illustrato nello schema, e l'immagine di un campione trattato con NGF etichettato con DPI a quattro giorni in vitro, questo filmato mostra la migrazione delle cellule di schwan al confine di un SCG explan.

La combinazione di campo chiaro e fluorescenza consente la visualizzazione delle cellule di cigno positive S 100 GFP e degli assoni. Infine, questo filmato mostra la migrazione delle cellule di schwan al confine di un ganglio cervicale superiore ex explan. Qui viene mostrato solo il canale di fluorescenza, consentendo una più facile interpretazione delle cellule di Schwan positive alla GFP S 100.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi quantitative come la quantificazione della proliferazione di una cellula o la quantificazione dell'apoptosi di una cellula. Naturalmente, l'immunoistochimica adeguata deve essere eseguita per l'analisi degli endpoint o gli animali transgenici specifici devono essere utilizzati per mostrare gli effetti nel contesto di vita.