Isometrica ed eccentrica valutazione della forza dei muscoli scheletrici Isolato da modelli murini di distrofie muscolari

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le proprietà meccaniche dei muscoli scheletrici isolati dai topi. Ciò si ottiene sezionando prima l'estensore lungo delle dita o il muscolo EDL, nonché il muscolo diaframma dall'animale. Dopo aver preparato una striscia di diaframma, pinnare l'EDL e la striscia di diaframma in un piatto di soluzione di suoneria ossigenata e quindi legare gli anelli di sutura a entrambe le estremità dei muscoli.

Successivamente, l'EDL o la striscia del diaframma viene fissata in un bagno d'organo tra due elettrodi collegati a un trasduttore di forza o a una leva a un'estremità e regolata alla sua lunghezza ottimale in base alla forza di contrazione. Il passaggio finale consiste nello stimolare il muscolo utilizzando una serie di protocolli meccanici e misurare la produzione di forza. In definitiva, il calcolo della produzione di forza, la resistenza al danno, la relazione tra la frequenza della forza e altre proprietà vengono utilizzate per mostrare la forza e l'integrità e altre proprietà del muscolo e, se applicabile, gli effetti di un trattamento o di una modificazione genetica.

Questa tecnica può essere utilizzata per testare potenziali terapie per le distrofie muscolari perché la maggior parte di queste terapie mira a recuperare la forza muscolare e ridurre la fragilità muscolare. Anche se non siamo i primi a utilizzare questa tecnica, la usiamo abitualmente per studiare una serie di diversi modelli murini e valutare la loro funzione muscolare, e anche per caratterizzare e valutare molteplici terapie per le distrofie muscolari. Oltre alla dottoressa Catherine Morewood, dimostreremo questa procedura utilizzando due membri del nostro nucleo di valutazione fisiologica, il dottor Min Liu, un ricercatore associato, e il signor Ian, uno specialista di ricerca.

I topi utilizzati in questa procedura vengono anestetizzati con ketamina e xilazina per garantire che non provino dolore o angoscia, ma che i muscoli rimangano ben ossigenati dalla circolazione. Dopo aver confermato con un pizzico di dita dei piedi che l'animale è sufficientemente anestetizzato, immobilizzare gli arti alti utilizzando del nastro adesivo e rimuovere la pelle dell'arto posteriore anteriore inferiore per esporre i muscoli di quest'area, mantenere i muscoli umidi con l'applicazione di PBS a intervalli regolari. Sotto un cannocchiale da dissezione, praticare una piccola incisione laterale al ginocchio per esporre il tendine prossimale dell'estensore lungo delle dita o del muscolo EDL.

Ci sono due tendini in questa regione ed entrambi dovrebbero essere tagliati per consentire la rimozione dell'EDL alla caviglia mediale. Tagliare il tendine del muscolo tibiale anteriore o TA per esporre i tendini distali dell'EDL, che si estendono lungo i metatarsi. Solleva il muscolo TA.

Fare attenzione a non tagliare o toccare l'EDL sottostante. Torna ai tendini distali dell'EDL e taglia ciascuno di essi. Quindi, afferra i tendini e allontana delicatamente l'EDL dal resto dell'arto.

Dovrebbe rilasciare liberamente dall'estremità prossimale. Rimuovere il muscolo EDL e metterlo in una pirofila da dissezione riempita con strizzatori ossigenati refrigerati. Fissare il muscolo attraverso i tendini a una lunghezza approssimativamente a riposo, che è la lunghezza che si trova in vivo.

La lunghezza è troppo corta quando il muscolo è immerso nel piatto e troppo lunga se il muscolo tira i perni di dissezione. Legare le suture ai tendini il più vicino possibile al muscolo, ma senza toccare il muscolo. Fissare il muscolo a una lunghezza approssimativamente a riposo usando le suture.

Per iniziare questa procedura. Fai un'incisione nella pelle dell'animale soppresso. Per esporre la cavità addominale e toracica.

Aprire la cavità addominale e tagliare la parete del corpo appena sotto le costole usando le forbici ossee e iniziando sopra l'inserzione del diaframma. Taglia intorno all'intera gabbia toracica seguendo la linea delle costole e taglia attraverso la colonna vertebrale. Tagliare i vasi sanguigni che attraversano il centro del diaframma in modo che il diaframma possa essere rimosso facilmente.

Rimuovere il diaframma dal mouse e metterlo in un piatto da dissezione riempito con suonerie ossigenate. Agitare delicatamente il diaframma nel piatto per lavare via il sangue. Aggiornare la soluzione della suoneria in base alle esigenze.

Quindi, tagliare una piccola striscia del diaframma dal tendine centrale alle costole lungo l'orientamento delle fibre nella porzione centrale dei diaframmi emi laterali. La striscia dovrebbe essere larga tra i due e i quattro millimetri. Lega le suture al tendine centrale, lega le suture a ciascuna delle estremità delle costole sporgenti lateralmente, quindi legarle insieme per creare un grande anello usando le forbici per ossa.

Tagliare la nervatura su entrambi i lati della striscia, lasciando circa uno o due millimetri, sporgenza della nervatura su entrambi i lati del diaframma. La valutazione della generazione di forza a strisce dei muscoli scheletrici isolati viene eseguita da un sistema di test muscolare in vitro per montare i muscoli nel bagno del meccanico, afferrare le suture e utilizzarle per collegare il muscolo a un perno rigido su un'estremità e a un trasduttore di forza sull'altra estremità. Una buona approssimazione è la lunghezza del muscolo a riposo.

Come mostrato in precedenza, il bagno viene riempito con una soluzione di ringers ossigenata mantenuta a 22 gradi Celsius. Per prolungare la stabilità muscolare per il test, i muscoli dovrebbero riposare per cinque minuti in questo bagno prima del test funzionale, in modo che la temperatura muscolare sia equiparata a 22 gradi Celsius per stabilire condizioni di stimolazione sovramassimali. Dopo che un muscolo è stato inserito nella vasca, utilizzare singoli impulsi di stimolazione di 0,5 millisecondi per generare una contrazione e monitorare la forza in uscita.

Aumentare gradualmente la corrente fino a quando la forza raggiunge un livello massimo ma costante, aumentare la corrente al 10% in più di questo livello per gli esperimenti rimanenti per stabilire la lunghezza ottimale, in primo luogo, assicurarsi che il muscolo non sia allentato, ma nemmeno insegnato. Una buona approssimazione è la lunghezza del muscolo a riposo, come mostrato in precedenza. Utilizzando le stimolazioni isometriche a contrazione, regolare gradualmente la lunghezza del muscolo fino ad ottenere una forza massima.

Riposa il muscolo circa 10 secondi tra ogni contrazione. La lunghezza ottimale del muscolo si ottiene quando la forza di contrazione è massima, registrare la lunghezza del muscolo utilizzando i calibri a corsoio. Per l'EDL, è la lunghezza tra le giunzioni miotendinee.

Per il diaframma, è la lunghezza tra la giunzione miotendinea del tendine centrale e l'inserzione muscolare alla costola. Per determinare la massima forza isometrica del Titanic, stimolare il muscolo impostato alla lunghezza muscolare ottimale per un periodo di 500 millisecondi con una serie di impulsi di 0,5 millisecondi alla stimolazione super massimale e alla frequenza di fusione. Il plateau per i muscoli EDL si ottiene tipicamente con 120 hertz e per i muscoli diaframma con 100 hertz si stimolano tre volte alla rispettiva frequenza con periodi di riposo di cinque minuti tra gli attacchi di stimolazione per ogni muscolo dopo un riposo di cinque minuti.

Dopo aver eseguito le contrazioni isometriche, iniziare la procedura per le contrazioni eccentriche. Stimolare il muscolo a 80 hertz isometricamente per i primi 500 millisecondi, seguito da un allungamento ottimale della lunghezza muscolare del 10% nella stimolazione finale di 200 millisecondi. Ripeti lo schema di stimolazione con cinque minuti di pausa tra l'uno e l'altro.

Per il numero desiderato di contrazioni eccentriche, misurare la forza per ogni contrazione nel periodo di tempo precedente l'allungamento. Calcolare il calo di forza tra la prima e l'ultima contrazione al termine del test funzionale. Accorciare la lunghezza del muscolo e rimuovere delicatamente il muscolo dal trasduttore e dal perno.

Rimetti il muscolo in un piatto da dissezione con suonerie. Rimuovere le suture dai muscoli per il muscolo EDL. Bloccare il muscolo due volte e poi pesarlo prima della successiva lavorazione.

Questo sarà importante per calcolare l'area della sezione trasversale e la forza specifica per l'immersione del muscolo del diaframma in 0,1% pro e arancione, una membrana e colorante permanente per 15-20 minuti. Ciò fornirà un indice di danno da dissezione, sezionando il muscolo del diaframma lontano dall'inserzione ossea e dal tendine centrale. Ciò è necessario per fornire un peso accurato del muscle blot prima della pesatura e della successiva preparazione.

L'area della sezione trasversale o CSA viene calcolata utilizzando la seguente formula, dove L su LO è il rapporto tra fibra e lunghezza muscolare e 1,06 è la densità dei valori attesi dal muscolo per le forze isometriche nel tipo C 57 selvatico e in questa figura sono mostrati la distrofia muscolare o i muscoli M-D-X-E-D-L di animali di 12 settimane. Poiché i muscoli MDX mostrano ipertrofia compensatoria, la forza totale rispetto al titanico può essere più alta nel muscolo MDX rispetto ai controlli wild type di pari età. Una misura più appropriata dell'output funzionale è la forza specifica, dove la forza è normalizzata per l'area della sezione trasversale.

Per calcolare questo valore, la forza specifica dipende dalla capacità funzionale intrinseca del muscolo, dove la debolezza nei muscoli distrofici è più evidente quando si tiene conto sia della forza assoluta che dell'area della sezione trasversale. In questo studio è stato osservato che i muscoli EDL dei topi MDX generano forze specifiche inferiori di circa il 20-25% rispetto a quelli dei topi wild type di pari età da 10 a 26 settimane di età. Per il diaframma solo la forza specifica è rilevante per i confronti perché la preparazione è un pezzo del muscolo dipendente dalla dissezione.

Un confronto della forza specifica tra il muscolo C 57 wild type indicato dalla linea blu e il muscolo del diaframma MDX indicato dalle barre rosse riflette la patologia progressiva in questo tessuto. L'output della forza isometrica diminuisce con l'età, in modo che entro i sei mesi di età i muscoli del diaframma dei topi MDX non producono più della metà dell'output funzionale delle strisce del diaframma dai controlli wild type di pari età. In questa figura è mostrato un esempio di contrazioni eccentriche dovute al test del diaframma.

Ad ogni successiva contrazione eccentrica, la forza di uscita diminuisce nelle strisce di diaframma sia del tipo selvatico C 57 mostrato in blu che dei topi MDX mostrati in rosso. Tuttavia, la perdita di forza è più drammatica nei campioni muscolari del topo MDX, presumibilmente a causa dell'assenza di distrofina e delle sue proteine associate. Questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora per un singolo muscolo se viene eseguita correttamente seguendo questa tecnica.

Altri metodi, come il western blotting o altre misurazioni biochimiche, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se il trattamento ha alterato i livelli di proteine o normalizzato l'integrità muscolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare l'EDL e il diaframma dal mouse e come misurare e analizzare la produzione di forza prima e dopo le contrazioni eccentriche.