Name: Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per In Vivo Tomografia a coerenza ottica Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara la tecnica della finestra cranica a cranio diluito per l'imaging OCT in vivo del cervello nel modello murino. Questo metodo meno invasivo preserva la viabilità cerebrale e consente di ottenere informazioni strutturali e funzionali ad alta risoluzione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla prova UC Discovery di concessione Concept e dal NIH (R00 EB007241). Gli autori desiderano inoltre ringraziare Jacqueline Hubbard per la sua assistenza in questo esperimento.

1. Preparazione chirurgica <ol><li> Femmina CD 1 topi di età compresa tra 6-8 settimane sono state utilizzate nei nostri esperimenti. </li><li> Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di una combinazione di chetamina e xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xilazina). Posizionare il mouse su un tappetino omeotermi per garantire una temperatura ottimale del corpo a ~ 37 ° C. Monitorare costantemente il livello di anestesia testando riflessi dell&#39;animale (ad esempio, pizzicando piedi con una pinza smussati) e iniettare più l&#39;anestesia in caso di necessità. </li><li> Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento lacrima artificiale. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto con un rasoio e rimuovere i capelli residui usa il 70% di preparazione tamponi di alcol. Applicare uno strato sottile di crema di rimozione dei capelli Nair sul cuoio capelluto e attendere 2 minuti per esso abbia effetto. Pulire delicatamente via i capelli Nair e rimanente utilizzando tamponi di cotone inumiditi salina e pastiglie di preparazione alcol. Cuoio capelluto dovrebbe ora essere completamente glabro. </li><li> Disinfezione cuoio capelluto con un bastone betadine tampone e pulire con 70% etanolo preparazione pastiglie. </li><li> Avvolgete l&#39;animale in teli chirurgici per garantire una temperatura ottimale del corpo di ~ 37 ° C e montare l&#39;animale su un telaio stereotassico per immobilizzare il cranio. Battere leggermente il cranio per garantirne la stabilità. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1. </li></ol> 2. Diluito-cranio Preparazione finestra corticale <ol><li> Avviare l&#39;incisione nel punto mediano tra gli occhi. Continua caudalmente al punto linea mediana tra le orecchie. Parte la pelle con una pinza. </li><li> Individuare l&#39;area deve essere diluito con un microscopio da dissezione e rimuovere delicatamente la fascia con una pinzetta. Asciugare il cranio con tamponi di cotone sterili prima di creare la finestra corticale assottigliata. Nei nostri esperimenti, abbiamo creato un 4 × 4 mm diluito cranica finestra ~ 1 mm posteriormente e lateralmente al bregma. </li><li> Cominci a diventare calvo cranio con un rotondo fresa in carburo di dimensioni punta 0,75 millimetri in un trapano a mano chirurgica utilizzando la luce onl travolgente movimentoy. Non applicare una pressione diretta sul cranio. Interrompere il fresaggio ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere osseo con soluzione salina sterile e tamponi di cotone e per evitare surriscaldamento del cranio. La soluzione salina aiuterà anche a dissipare il calore in tutto il cranio. </li><li> Una volta che lo strato esterno di osso compatto viene completamente rimosso lo strato centrale dell&#39;osso spugnoso dovrebbe essere visibile. Ci può essere qualche leggero sanguinamento da vasi sanguigni sono più evidenti nello strato osso spugnoso. Passare a una fresa pietra verde e continua che si esercita con cautela come strato spugnoso è più delicata. La fresa pietra verde sarà rimuovere il materiale meno osso creando uniformità in tutta la finestra del cranio. Interrompere il fresaggio di tanto in tanto per rimuovere la polvere delle ossa e per raffreddare il cranio. </li><li> Infine, quando il cranio è diventato più trasparente e vascolarizzazione del cervello è ora visibile, iniziare la lucidatura del cranio con una fresa di lucidatura. Ciò consentirà una più precisa assottigliamento mentre lisciandosi il cranio. Controllare magrezza del skull picchiettando delicatamente su di esso con una pinza. Arrestare lucidatura quando il cranio diventa leggermente flessibile. </li><li> La finestra diluito cranica dovrebbe essere completamente liscia e riflettente e pronto per l&#39;imaging (Figura 1). A causa della natura dei tessuti altamente diffondenti del cervello, il cranio deve essere diluito ad almeno 55 micron di profondità di penetrazione ottimale. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1. </li></ol> 3. Tomografia a coerenza ottica Imaging <ol><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico è completa, controllare la frequenza respiratoria dell&#39;animale e riflessi di garantire adeguato livello di anestesia e somministrare l&#39;anestesia supplementari, se necessario. Rimuovere animale dal telaio stereotassico, tenere animale avvolto in teli chirurgici, e degli animali il trasporto alla stazione di imaging. </li><li> Prima di controllare i segni di imaging per i riflessi e applicare ulteriori lacrima artificiale se necessario. Animale montare sul telaio stereotassico per fissare il cranio. </li><li> Luogo animale inOttobre fotocamera e la posizione TSCW sotto il fascio ottico (Figura 2). Una vista in sezione trasversale del cranio e cervello può ora essere visualizzati (Figura 3). </li><li> L&#39;acquisizione dei dati può iniziare un tempo area di interesse si trova. Per scopi di imaging, usiamo specchi galvanometrica per ottenere una finestra di imaging con una larghezza di 4,0 mm. Una profondità di 2 mm di imaging è stato ottenuto con 6 mW di potenza incidente e un punto focale 1 mm sotto il cranio assottigliato. Ogni sezione trasversale costituita da 2.048 scansioni assiali con un tasso di acquisizione di 0,14 sec per immagine. </li><li> Scansioni volumetriche del cervello può anche essere ottenuta raccogliendo una serie di 2D immagini trasversali mediante due serie di specchi per Galvo xy scansione con il primo specchio galvo scansione del fascio nella direzione sagittale e il secondo specchio di scansione galvanometrica nel coronale direzione. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Imaging con OCT e assottigliato-teschio è un romanzo neuro-imaging tecnica che è solo stato recentemente studiato 15, 16. Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato la fattibilità di SD-OCT immagini attraverso un TSCW in un modello di topo in vivo. Dai risultati ottenuti, il cranio è assottigliata a circa 55 micron e la profondità di penetrazione è ottenuta a circa 1 mm con risoluzione di immagine di 8 um e 20 um in direzione assiale e laterale, rispettivamente. Nel profilo di intensità di segnale, O...

Dalla sua introduzione nei primi anni del 1990, ottobre è stato ampiamente utilizzato per l&#39;imaging biologico della struttura dei tessuti e la funzione 2. Ottobre genera immagini in sezione trasversale misurando il tempo di ritardo dell&#39;eco di 4 luce riflessa mediante l&#39;attuazione di bassa coerenza con sorgente di luce a fibre ottiche 2,4 interferometro di Michelson. SD-OCT, noto anche come dominio di Fourier ottobre (FD-OCT), è stato introdotto nel 1995 5 e offre una modalità di imaging superiore rispetto alla tradizionale dominio del tempo OCT (TD-OCT). In SD-ottobre, il braccio di riferimento viene mantenuto fermo con conseguente alta velocità e ad altissima risoluzione di acquisizione dell&#39;immagine 6-9. Attualmente, i modelli TSCW sono stati ampiamente utilizzati in applicazioni per brain imaging in vivo di due fotoni microscopia in luogo di una craniotomia tradizionale. Questi TSCW sono stati utilizzati in concomitanza con un piatto cranio personalizzato o un foglio di copertura in vetro 10-13 per fornire ulteriori imaging stabilità. Nei nostri studi, abbiamo osservato che gli accessori come questi non sono necessari per l&#39;imaging ottobre quando un TSCW viene utilizzato. Pertanto, la mancanza di una piastra cranio o vetrini di vetro consente una più ampia gamma di dimensioni di imaging finestra in quanto potrebbero interferire con il fascio ottico e modificare immagini ottobre A assottigliata-cranio preparazione ha dimostrato di essere vantaggioso in studi di imaging del cervello utilizzando due fotoni microscopia 10-13. Nei nostri esperimenti, ci avvaliamo di un sistema SD-OCT per l&#39;immagine del corteccia in vivo attraverso un TSCW. La nostra misura SD-OCT installazione di imaging contiene una, la banda larga a bassa coerenza sorgente luminosa costituita da due diodi superluminescenti (SLD) centrato a 1295 nm con una larghezza di banda di 97 nm con un conseguente risoluzione assiale e laterale di 8 micron e 20 micron, rispettivamente 14 . Con il nostro dispositivo di imaging ottico, prevediamo che l&#39;imaging attraverso un TSCW ha un grande potenziale per individuare e visualizzare le strutture e le funzioni in otessuti del cervello ptically denso.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Akorn, Inc. </td><td> 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial Tears Unguento </td><td> Rugby </td><td> 0536-6550-91 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> 4010130 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool sterile Prep Pad </td><td> Kendall Healthcare </td><td> 6818 </td><td></td></tr><tr><td> Cotone Tipped Applicatori </td><td> FISHERBRAND </td><td> 23-400-115 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine Soluzione Swabstick </td><td> Purdue Prodotti &lt;/ Td&gt; <td> 67618-153-01 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina, 0,9% </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-555-08 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica Telaio </td><td> Stoelting </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trapano a mano ad alta velocità chirurgica </td><td> Foredom </td><td></td><td> 38.000 rpm </td></tr><tr><td> Carbide rotonda Bur </td><td> Stoelting </td><td></td><td> 0,75 millimetri </td></tr><tr><td> Dura-verdi Pietre </td><td> Shofu </td><td></td><td> Shank: HP Forma: BA1 </td></tr><tr><td> CompoMaster grossa &amp; CompoMaster Lucidatore </td><td> Shofu </td><td></td><td> Forma: Mini-Pt. </td></tr><tr><td> SpaceDrapes </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diluito-cranio tecnica finestra corticale per<em&gt; in vivo</em&gt; tomografia a coerenza ottica imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging biomedico ad alta risoluzione spazio-temporale. Con il suo approccio mini-invasivo ottobre è stato ampiamente utilizzato in oftalmologia, dermatologia, gastroenterologia e 1-3. Utilizzando una finestra assottigliata cranio-corticale (TSCW), ci avvaliamo di spectral-domain OCT (SD-OCT) modalità come strumento per l&#39;immagine della corteccia in vivo. Comunemente, un aperto-cranio è stato utilizzato per neuro-imaging in quanto fornisce una maggiore versatilità, tuttavia, un approccio TSCW è meno invasiva ed è un mezzo efficace per l&#39;imaging lungo termine in studi neuropatologia. Qui, presentiamo un metodo per creare un TSCW in un modello di topo per l&#39;imaging in vivo ottobre della corteccia cerebrale.

Dopo aver creato una finestra assottigliata sulla corteccia cerebrale vascolarizzazione dovrebbe essere ora evidenziare visivamente (Figura 1) e consentirà una profondità di imaging profondo (fino a 1 mm). La corteccia destra viene diluito a circa 55 micron, rispetto ad un teschio normale misurato a 140 micron (Figura 1) e fornisce maggiore chiarezza ottica. Ulteriori diradamento a 10-15 micron è possibile 11 Non occorre tuttavia che l&#39;uso di vetrini in vetro e piastre cr...

Vi presentiamo un metodo per creare un assottigliata-teschio finestra corticale (TSCW) in un modello di topo per<em&gt; In vivo</em&gt; Ottobre immagini della corteccia cerebrale.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una sottile finestra cranica del cranio in un modello murino per l'imaging del cervello con tomografia a coerenza ottica in vivo. Ciò si ottiene anestetizzando prima l'animale e preparandolo per l'intervento chirurgico. Quindi, assottiglia il cranio usando varie frese dentali.Il passo finale consiste nell'ottenere immagini OCT del cervello in vivo attraverso la sottile finestra cranica del cranio. In definitiva, le informazioni strutturali e funzionali del cervello possono essere ottenute dalle immagini OCT risultanti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la craniectomia o le finestre coprivetrino, è che la finestra terminale è meno invasiva e ha maggiori probabilità di mantenere l'integrità biologica e la vitalità del cervello.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di disturbi neurologici perché l'OCT fornisce un'elevata risoluzione spaziale e temporale e fornisce una penetrazione in profondità superiore rispetto alla microscopia confocale e a due fotoni. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo faranno fatica a creare una superficie cranica uniformemente sottile senza introdurre fratture del cranio o sanguinamento subdurale. Per iniziare questa procedura, anestetizzare un topo di età compresa tra sei e otto settimane con un'iniezione intraperitoneale di una combinazione di ketamina e xilazina.Quindi posizionare il mouse su un tappetino omeo o una coperta per garantire la temperatura corporea ottimale a circa 37 gradi Celsius durante la preparazione chirurgica, monitorare continuamente il livello di anestesia testando i riflessi dell'animale e iniettare più anestesia quando necessario. Quindi, lubrificare entrambi gli occhi con l'unguento lacrimale artificiale. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto con il tagliacapelli.Quindi rimuovere i capelli tagliati residui con un tampone o un tampone. Successivamente, applicare uno strato sottile di crema depilatoria sul cuoio capelluto. Dopo due minuti, rimuovere delicatamente la crema e i capelli rimanenti utilizzando soluzione fisiologica, batuffoli di cotone inumiditi e tamponi imbevuti di alcol.Ora disinfetta il cuoio capelluto usando un bastoncino di tampone Betadine e pulisci con tamponi di preparazione all'etanolo al 70%. Quindi monta l'animale su un telaio stereotassico per immobilizzare il cranio. Picchiettare leggermente il teschio per garantirne la stabilità.In questa procedura, iniziare l'incisione del cuoio capelluto nel punto della linea mediana tra gli occhi. Continua con delicatezza fino al punto della linea mediana tra la parte delle orecchie, i lembi della pelle con una pinza. Quindi, individuare l'area da assottigliare con un microscopio da dissezione.Usa una pinza per raschiare il cranio per rimuovere eventuali residui di fascia. Quindi asciugare il cranio con tamponi di cotone sterili prima di creare una finestra corticale assottigliata di quattro per quattro millimetri di circa un millimetro di torema posteriore e laterale. Utilizzare un trapano chirurgico a mano con una fresa rotonda in metallo duro con un leggero movimento ampio per assottigliare il cranio.Non esercitare una pressione diretta sul cranio. Interrompere la perforazione ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea utilizzando soluzione fisiologica sterile e tamponi di cotone e per evitare il surriscaldamento del cranio. La soluzione salina aiuterà anche a dissipare il calore in tutto il cranio.Una volta che lo strato esterno dell'osso compatto è stato completamente rimosso, lo strato osseo spugnoso medio dovrebbe essere visibile. Ci può essere un leggero sanguinamento poiché i vasi sanguigni sono più evidenti nello strato osseo spugnoso. Passa a una fresa a pietra verde e continua a perforare con particolare cautela.Poiché lo strato spugnoso è più delicato, la bava di pietra verde rimuoverà meno materiale osseo assicurando l'uniformità in tutta la finestra cranica. Interrompere di tanto in tanto la perforazione per rimuovere la polvere ossea e raffreddare il cranio. Infine, quando il cranio è diventato più trasparente e la vascolarizzazione sul cervello è visibile, inizia a lucidare il cranio usando una fresa lucidante controlla lo spessore del cranio picchiettandolo delicatamente con una pinza per smettere di lucidare.Quando il cranio diventa leggermente flessibile, la finestra cranica assottigliata dovrebbe ora essere completamente liscia e riflettente e pronta per l'imaging. A causa della natura dei tessuti cerebrali altamente dispersivi, il cranio dovrebbe essere assottigliato ad almeno 55 micron per una penetrazione ottimale in profondità. Al termine dell'intervento chirurgico, controllare la frequenza respiratoria dell'animale tramite ispezione visiva e riflessi per garantire un livello adeguato di anestesia e somministrare ulteriore anestesia Se necessario, posizionare l'animale sotto la telecamera OCT, quindi posizionare la sottile finestra cranica del cranio sotto il raggio ottico.È ora possibile visualizzare una vista in sezione trasversale del cranio e del cervello. L'acquisizione dei dati può iniziare. Una volta individuata l'area di interesse per l'imaging, abbiamo scansionato il fascio OCT su una finestra corticale di imaging con una larghezza di 4,0 millimetri e ottenuto una profondità di imaging di due millimetri con sei milliwatt di potenza incidente e una focale di 0,1 millimetri sotto il cranio sottile.Ogni area della sezione trasversale consisteva in 2048 scansioni assiali con una velocità di acquisizione di 0,14 secondi per immagine. Questo particolare metodo ci ha permesso di identificare strutture specifiche nelle nostre immagini in sezione trasversale OCT. Questa figura mostra un'immagine OCT para sagittale della corteccia sotto un cranio normale, e qui mostra un'immagine OCT para sagittale sotto un cranio sottile.Le strutture del cervello sono visivamente più evidenti sotto una sottile finestra cranica del cranio rispetto a un cranio normale. Inoltre, si ottiene anche un'immagine OCT della sezione trasversale coronale per facilitare l'identificazione delle strutture della linea mediana. Le scansioni volumetriche del cervello possono anche essere ottenute raccogliendo una serie di immagini in sezione trasversale 2D utilizzando due set di specchi gal O per la scansione XY con il primo specchio gal O che scansiona il fascio in direzione sagittale e il secondo specchio gal che scansiona la direzione coronale.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 10 minuti se eseguita correttamente. Mentre si tenta di questa procedura è importante assottigliare uniformemente il cranio per garantire un'adeguata penetrazione del segnale durante l'imaging OCT, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una sottile finestra corticale del cranio per scopi di imaging OCT.

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