Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per In Vivo Tomografia a coerenza ottica Imaging
19 novembre 2012
Vi presentiamo un metodo per creare un assottigliata-teschio finestra corticale (TSCW) in un modello di topo per In vivo Ottobre immagini della corteccia cerebrale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una sottile finestra cranica del cranio in un modello murino per l'imaging del cervello con tomografia a coerenza ottica in vivo. Ciò si ottiene anestetizzando prima l'animale e preparandolo per l'intervento chirurgico. Quindi, assottiglia il cranio usando varie frese dentali.
Il passo finale consiste nell'ottenere immagini OCT del cervello in vivo attraverso la sottile finestra cranica del cranio. In definitiva, le informazioni strutturali e funzionali del cervello possono essere ottenute dalle immagini OCT risultanti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la craniectomia o le finestre coprivetrino, è che la finestra terminale è meno invasiva e ha maggiori probabilità di mantenere l'integrità biologica e la vitalità del cervello.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di disturbi neurologici perché l'OCT fornisce un'elevata risoluzione spaziale e temporale e fornisce una penetrazione in profondità superiore rispetto alla microscopia confocale e a due fotoni. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo faranno fatica a creare una superficie cranica uniformemente sottile senza introdurre fratture del cranio o sanguinamento subdurale. Per iniziare questa procedura, anestetizzare un topo di età compresa tra sei e otto settimane con un'iniezione intraperitoneale di una combinazione di ketamina e xilazina.
Quindi posizionare il mouse su un tappetino omeo o una coperta per garantire la temperatura corporea ottimale a circa 37 gradi Celsius durante la preparazione chirurgica, monitorare continuamente il livello di anestesia testando i riflessi dell'animale e iniettare più anestesia quando necessario. Quindi, lubrificare entrambi gli occhi con l'unguento lacrimale artificiale. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto con il tagliacapelli.
Quindi rimuovere i capelli tagliati residui con un tampone o un tampone. Successivamente, applicare uno strato sottile di crema depilatoria sul cuoio capelluto. Dopo due minuti, rimuovere delicatamente la crema e i capelli rimanenti utilizzando soluzione fisiologica, batuffoli di cotone inumiditi e tamponi imbevuti di alcol.
Ora disinfetta il cuoio capelluto usando un bastoncino di tampone Betadine e pulisci con tamponi di preparazione all'etanolo al 70%. Quindi monta l'animale su un telaio stereotassico per immobilizzare il cranio. Picchiettare leggermente il teschio per garantirne la stabilità.
In questa procedura, iniziare l'incisione del cuoio capelluto nel punto della linea mediana tra gli occhi. Continua con delicatezza fino al punto della linea mediana tra la parte delle orecchie, i lembi della pelle con una pinza. Quindi, individuare l'area da assottigliare con un microscopio da dissezione.
Usa una pinza per raschiare il cranio per rimuovere eventuali residui di fascia. Quindi asciugare il cranio con tamponi di cotone sterili prima di creare una finestra corticale assottigliata di quattro per quattro millimetri di circa un millimetro di torema posteriore e laterale. Utilizzare un trapano chirurgico a mano con una fresa rotonda in metallo duro con un leggero movimento ampio per assottigliare il cranio.
Non esercitare una pressione diretta sul cranio. Interrompere la perforazione ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea utilizzando soluzione fisiologica sterile e tamponi di cotone e per evitare il surriscaldamento del cranio. La soluzione salina aiuterà anche a dissipare il calore in tutto il cranio.
Una volta che lo strato esterno dell'osso compatto è stato completamente rimosso, lo strato osseo spugnoso medio dovrebbe essere visibile. Ci può essere un leggero sanguinamento poiché i vasi sanguigni sono più evidenti nello strato osseo spugnoso. Passa a una fresa a pietra verde e continua a perforare con particolare cautela.
Poiché lo strato spugnoso è più delicato, la bava di pietra verde rimuoverà meno materiale osseo assicurando l'uniformità in tutta la finestra cranica. Interrompere di tanto in tanto la perforazione per rimuovere la polvere ossea e raffreddare il cranio. Infine, quando il cranio è diventato più trasparente e la vascolarizzazione sul cervello è visibile, inizia a lucidare il cranio usando una fresa lucidante controlla lo spessore del cranio picchiettandolo delicatamente con una pinza per smettere di lucidare.
Quando il cranio diventa leggermente flessibile, la finestra cranica assottigliata dovrebbe ora essere completamente liscia e riflettente e pronta per l'imaging. A causa della natura dei tessuti cerebrali altamente dispersivi, il cranio dovrebbe essere assottigliato ad almeno 55 micron per una penetrazione ottimale in profondità. Al termine dell'intervento chirurgico, controllare la frequenza respiratoria dell'animale tramite ispezione visiva e riflessi per garantire un livello adeguato di anestesia e somministrare ulteriore anestesia Se necessario, posizionare l'animale sotto la telecamera OCT, quindi posizionare la sottile finestra cranica del cranio sotto il raggio ottico.
È ora possibile visualizzare una vista in sezione trasversale del cranio e del cervello. L'acquisizione dei dati può iniziare. Una volta individuata l'area di interesse per l'imaging, abbiamo scansionato il fascio OCT su una finestra corticale di imaging con una larghezza di 4,0 millimetri e ottenuto una profondità di imaging di due millimetri con sei milliwatt di potenza incidente e una focale di 0,1 millimetri sotto il cranio sottile.
Ogni area della sezione trasversale consisteva in 2048 scansioni assiali con una velocità di acquisizione di 0,14 secondi per immagine. Questo particolare metodo ci ha permesso di identificare strutture specifiche nelle nostre immagini in sezione trasversale OCT. Questa figura mostra un'immagine OCT para sagittale della corteccia sotto un cranio normale, e qui mostra un'immagine OCT para sagittale sotto un cranio sottile.
Le strutture del cervello sono visivamente più evidenti sotto una sottile finestra cranica del cranio rispetto a un cranio normale. Inoltre, si ottiene anche un'immagine OCT della sezione trasversale coronale per facilitare l'identificazione delle strutture della linea mediana. Le scansioni volumetriche del cervello possono anche essere ottenute raccogliendo una serie di immagini in sezione trasversale 2D utilizzando due set di specchi gal O per la scansione XY con il primo specchio gal O che scansiona il fascio in direzione sagittale e il secondo specchio gal che scansiona la direzione coronale.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 10 minuti se eseguita correttamente. Mentre si tenta di questa procedura è importante assottigliare uniformemente il cranio per garantire un'adeguata penetrazione del segnale durante l'imaging OCT, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una sottile finestra corticale del cranio per scopi di imaging OCT.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la creazione di una finestra corticale con cranio sottile (TSCW) in un modello murino, che consente l'acquisizione in vivo di immagini mediante tomografia a coerenza ottica (OCT) della corteccia cerebrale. La tecnica è stata progettata per essere meno invasiva rispetto ai metodi tradizionali, preservando l'integrità biologica del cervello.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di Imaging
- Studi In Vivo
Sfondo
- La tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging non invasiva.
- Metodi tradizionali come la craniectomia possono essere più invasivi e dannosi.
- È fondamentale mantenere la vitalità del cervello durante l'imaging per ottenere risultati accurati.
- L'approccio con cranio assottigliato mira a risolvere queste problematiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo meno invasivo per l'imaging cerebrale.
- Migliorare la vitalità del cervello durante le procedure di imaging.
- Ottenere informazioni strutturali e funzionali dalle immagini OCT.
Metodi Utilizzati
- Anestesia del modello murino prima dell'intervento chirurgico.
- Assottigliamento del cranio mediante frese dentali.
- Acquisizione di immagini OCT attraverso il cranio assottigliato.
- Valutazione delle informazioni strutturali e funzionali cerebrali ricavate dalle immagini.
Risultati principali
- Il metodo del cranio sottile consente con successo l'imaging in vivo.
- Le immagini ottenute forniscono preziose informazioni strutturali e funzionali.
- La tecnica mostra potenzialità nel mantenere la vitalità cerebrale.
- È meno invasiva rispetto ai metodi tradizionali, riducendo i possibili danni.
Conclusioni
- La finestra corticale con cranio sottile è un'alternativa praticabile per l'immagine del cervello.
- Questo metodo migliora la capacità di studiare la funzione cerebrale in vivo.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a vari studi neurologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questa tecnica consente un'immagine longitudinale mininvasiva della struttura e della funzione corticale in vivo, supportando la validazione degli obiettivi nei modelli di malattie neurodegenerative. Preservando l'integrità cerebrale, aumenta la fiducia predittiva negli studi preclinici e riduce la variabilità biologica che potrebbe alterare le valutazioni della risposta ai farmaci. Il metodo si configura come una piattaforma riutilizzabile per l'eliminazione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali dei percorsi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante imaging corticale strutturale e funzionale longitudinale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare il legame al bersaglio e la modulazione del percorso nel tempo.
- Valore predittivo: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori e la prontezza per lo screening fenotipico fornendo letture strutturali quantitative ad alta risoluzione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione di composti successivi con accesso ottico costante.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso un assottigliamento uniforme del cranio e finestre di imaging stabili.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma in più sessioni di imaging, riducendo il carico di preparazione per ogni soggetto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia consentendo l'imaging in reti corticali integre e fisiologicamente attive.
- Valore operativo: Favorisce la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica con minima variabilità procedurale.
- Controllo del rischio: Riduce le variabili di confondimento derivanti dal trauma chirurgico, migliorando l'affidabilità dei dati per decisioni di avanzamento o interruzione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del capostazione, fornendo letture di imaging strutturale e funzionale che contribuiscono alla comprensione meccanicistica e agli effetti del composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante ripetute acquisizioni di immagini in vivo delle risposte corticali a perturbazioni.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie alla preparazione riproducibile della finestra immaginativa e alla penetrazione stabile del segnale per lo screening longitudinale di composti.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti, inclusi spessore corticale, densità vascolare e delimitazione dei livelli strutturali, per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica preservando la vitalità corticale e consentendo la correlazione con esiti comportamentali o molecolari.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile piuttosto che come procedura terminale, sostenendo disegni di studio longitudinali in più bracci sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante la visualizzazione diretta e ripetuta della microstruttura corticale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie a protocolli definiti di assottigliamento e criteri visivi per il raggiungimento del punto finale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'acquisizione di più punti dati per soggetto, riducendo l'uso di animali e aumentando la potenza statistica.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta per il rischio fornendo letture precoci di tipo strutturale e funzionale che si correlano con il potenziale di modifica della malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microchirurgiche e familiarità con la fissazione stereotassica e l'uso del trapano dentale.
- Presuppone l'accesso a sistemi OCT nel dominio spettrale dotati di software di scansione adeguato e controllo dello specchio galvanometrico per l'acquisizione volumetrica.
- Necessita di una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro (chirurgia, imaging e analisi) per garantire una qualità costante della finestra cranica e un'interpretazione coerente dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse linee di topi e diverse età, poiché lo spessore del cranio e la risposta alla guarigione possono variare.
- È limitato dalla necessità di abilità tecniche per evitare fratture del cranio o emorragie subdurali durante l'assottigliamento, che potrebbero compromettere la qualità del segnale e il benessere dell'animale.
