Name: Analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in Mais Rayado Fino virus Particelle virus-simili Prodotto in Nicotiana benthamiana Piante e Cross-linking di peptidi a VLP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri l'analisi dell'accessibilità al solvente dei residui di cisteina su particelle virus-simili di Mais Rayado Fino prodotte in Nicotiana benthamiana. Questo metodo consente il cross-linking di peptidi per applicazioni nanotecnologiche.

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1. Virus Inoculazione e purificazione VLP da piante di Nicotiana benthamiana <ol><li> Produrre ricoperti T7-RNA trascritti da Virus X della patata (PVX) basati su plasmidi vettori che trasportano MRFV wild-type (WT) e proteina di rivestimento Cys-mutato (CP) geni 12, utilizzando Ambion il T7-mMessage mmachine kit. </li><li> Per ogni reazione di trascrizione T7, inoculare due foglie completamente espanse di N. benthamiana con 10 reazioni e incubare le piante per 10 giorni in serra, al 60% di umidità per 16 ore di luce (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 ore buio a 20 ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana infettate da virus foglie di 10 giorni dopo l&#39;inoculazione (dpi), pesare il tessuto vegetale (50 grammi) e posto sul ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare il materiale vegetale in un frullatore in presenza di 100 ml di una soluzione fredda di 0,5 M Na-citrato, pH 5,5 (uso 2 ml di tampone per grammo di tessuto vegetale). </li><li> Filtrare omogeneizzato attraverso 3 strati di cheeseclOTH e chiarire mediante centrifugazione a 27.000 xg per 30 min. Trasferire il surnatante in un cilindro graduato refrigerati, misurarne il volume, e poi trasferire in un recipiente freddo sterile. Eliminare il pellet. </li><li> Elaborare il surnatante aggiungendo glicole polietilenico 8000 10% (PEG 8000), agitare per 15 min a 4 ° C, e incubare per altri 45 min a 4 ° C per precipitare le particelle simili a virus (VLPs)-PEG matrice. </li><li> Centrifugare il campione a 27.000 xg per 20 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> Elaborare il pellet aggiungendo 8 ml di 0,05 M Na-citrato, 5,5 contenente 2% Triton X-100 pH. Swirl tubi la centrifuga bene a rilasciare il pellet. Trasferire il pellet e buffer a un beaker refrigerati sterile. Sciacquare i tubi immediatamente con 2 ml dello stesso tampone e aggiungere al becher. Agitare la sospensione a 4 ° C fino a quando i pellet vengono disciolti (generalmente 1 ora). </li><li> Chiarificare mediante centrifugazione per 5 minuti a 27.000 xg, scartare il pellet, e pPROCESSO surnatante mediante centrifugazione a 140.000 xg per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di 0,05 M Na-citrato, pH 5,5 e posizionare la sospensione su un gradiente di saccarosio 10-40% made in 0,05 M Na-citrato, pH 5,5. </li><li> Centrifugare il gradiente per 3 ore a 140,000 xg a 4 ° C. </li><li> Accendere una luce sopra la parte superiore della provetta e raccogliere la luce-dispersione banda superiore a 4 cm dalla sommità del tubo, diluire con 0,05 M Na-citrato, pH 5,5, e centrifugare per 3 ore a 140.000 xg a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 0,5 ml di acqua sterile e conservare a 4 ° C per un massimo di sei mesi. </li><li> Quantificare la concentrazione VLPs eseguendo un saggio di proteina Bradford. La resa di VLPs è tra 1 e 3 mg / g di tessuto vegetale. </li></ol> 2. Fluoresceina-5-maleimide-etichettatura Reazioni di VLP <ol><li> Preparare una soluzione 1 mM di fluoresceina-5-maleimide (427,37 g / mole) in 50 mM di sodio Phosphate tampone, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mescolare con il vortice e verificare la completa dissoluzione. Proteggere il tubo dalla luce con un foglio di alluminio. </li><li> Aggiungi fluoresceina-5-maleimide a VLPs prodotte nel passaggio 1 e mescolare. Utilizzare di 25 volte l&#39;eccesso molare di fluoresceina-5-maleimide per quantità molare di sulfidrili. Generalmente, utilizzando 30 ml di VLPs alla concentrazione di 1 pg / pl e 60 pl della fluoresceina-5-maleimide soluzione produce risultati accettabili. </li><li> Incubare la reazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Terminare la reazione mediante aggiunta di ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 50 mM. </li><li> Rimuovere non reagito fluorescina utilizzando una colonna dissalazione spin (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugazione per 2 min a 1500 xga temperatura ambiente. </li><li> Per analisi SDS-PAGE, aggiungere 10 ml di 2 x SDS-PAGE tampone Laemmli a 10 pl di ciascuna reazione. Memorizzare la proteina marcata protetto dalla luce a 4 ° C per un mese omonouso in aliquote a -20 ° C fino a 3 mesi. </li></ol> 3. Etichettatura di reazione e la determinazione di Costituzione Biotina <ol><li> Utilizzare spin column desalificazione (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) per eseguire uno scambio di buffer dall&#39;acqua al tampone fosfato salino (PBS), pH 7,0 delle VLPs prodotte nel passo 1. </li><li> Preparare una soluzione stock 20 mM di maleimide-PEG2-biotina aggiungendo 190 microlitri di PBS in n-maleimide-PEG2 Pesare-biotina e mescolare pipettando su e giù. </li><li> Aggiungi maleimide-PEG2-biotina alle VLP e mescolare. Utilizzare un 10-fold eccesso molare di reagente per soluzioni VLPs ≤ 2 mg / ml. </li><li> Incubare la reazione a temperatura ambiente per 4 h. </li><li> Rimuovere non reagito maleimide-PEG2-biotina utilizzando una colonna di spin dissalazione (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugazione per 2 min a 1500 xga temperatura ambiente. </li><li> Determinare le moli di biotina per moli di VLP utilizzando la Pierce Biotina quantificazione Kit (Thermo Scientific) e following istruzioni del produttore. </li></ol> 4. Cross-linking di Cys 2-VLP e F Peptide <ol><li> VLPs che portano a residui di cisteina disponibili per reticolazione nella fase 2 (2-Cys VLPs) vengono utilizzati nel passaggio seguente. Preparare un nuovo cross-linking soluzione madre (28,63 mM) sciogliendo 10 mg di NHS-PEG4-maleimide reticolante in 680 ml di dimetilsolfossido. </li><li> Sciogliere un 17 (F)-amino peptide acido lunga (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 pl di tampone di coniugazione (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ad una concentrazione di 0,1 mM. </li><li> Aggiungere 4 ml di reticolante a 50 microlitri del peptide disciolto (proteina-NH2) ad una concentrazione di 1 mM finale (che è di 10 volte l&#39;eccesso molare di 0,1 mM di soluzione di peptide). </li><li> Incubare la reazione per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Purificare reticolato peptide utilizzando una colonna dissalazione (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrata con tampone di coniugazione (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) per centrifugazione a 1500 xgper 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Impostare un mix di reazione combinando VLPs (proteina-SH) e reticolato peptide (proteina-NH2) in un rapporto molare determinata dal numero di tioli e ammine attivati ​​coinvolte nella reazione e la differenza di peso molecolare tra VLP e peptidi. </li><li> Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Per l&#39;analisi Western blot, miscelare il prodotto risultante coniugato 1:1 con tampone di Laemmli, bollire per 10 min, e procedere con SDS-PAGE su un pre-cast 10-20% Tris-glicina gel (Invitrogen), seguita da elettroblotting su una membrana di nitrocellulosa (Invitrogen). Bloccare le membrane con 1 x PBS, pH 7,2 contenente 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) e 5% di latte scremato in polvere e sonda con peptide anticorpi specifici seguiti dal appropriata fosfatasi-anticorpo secondario marcato. </li></ol>

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</ol>

Menzione dei nomi commerciali dei prodotti commerciali nella pubblicazione è al solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti.

Il metodo qui presentato permette una analisi molto sensibile e rapido delle cisteine ​​reattive presenti sulla superficie delle piante prodotte VLPs nonché su complessi di proteine. Maleimmidi sono tiolo-specifici reagenti, che reagiscono con liberi sulfidrilici contenenti molecole di formare legami stabili tioetere. Questo metodo disegna sulla specificità delle maleimmidi di reagire con i gruppi sulfidrilici non coinvolti in interazioni con altri aminoacidi. Mantenendo la struttura nativa delle VLPs è molto importante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tubi </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mmachine T7 Kit </td><td> Vita Tecnologie </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceina-5-Maleimide </td><td> Thermo Scientific Life Technologies </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 non è sostituto ordine con F150 </td></tr><tr><td> Pierce Biotina quantificazione Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link Maleimide-PEG2-biotina, No-Pesare Formato </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Reticolanti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-glicina gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris glicina SDS tampone di corsa </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris glicina Transfer Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocellulosa membrana del filtro di carta Sandwich </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatasi affinità etichetta Purificato Anticorpi anti-IgG di coniglio </td><td> Kirkegaard e Laboratori Perry </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP Fosfatasi substrato </td><td> Kirkegaard e Laboratori Perry </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in<em&gt; mais rayado fino virus</em&gt; particelle virus-simili prodotto in<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; piante e cross-linking di peptidi a vlp

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Imitare e sfruttando le proprietà e le caratteristiche fisico-chimiche dei virus e fisico promette di fornire soluzioni ad alcune delle sfide più pressanti del mondo. La gamma pura e tipi di virus insieme con le loro proprietà potenzialmente intriganti dare infinite opportunità per le applicazioni in tecnologie basate su virus. Virus hanno la capacità di auto-assemblano in particelle di forma e dimensioni discrete, specificità di simmetria, polivalenza e proprietà stabili in un&#39;ampia gamma di condizioni di temperatura e di pH. Non sorprendentemente, con una notevole gamma di proprietà, i virus sono proposti per l&#39;uso in vaccini biomateriali 9, 14, 15, materiali elettronici, strumenti chimici e molecolare elettronica contenitori 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12. Al fine di utilizzare i virus in nanotecnologie, devono essere modificati dalle loro forme naturali per impartire nuove funzioni. Questo impegnativo process può essere effettuato attraverso meccanismi diversi tra modificazione genetica del genoma virale e attaccare chimicamente molecole estranee o desiderato per i gruppi reattivi delle particelle virali 8. La possibilità di modificare un virus dipende principalmente dalle proprietà fisico-chimiche e fisiche del virus. Inoltre, le modifiche genetiche o fisico-chimiche devono essere eseguite senza alterare la struttura originaria del virus e la funzione virus. Mais Rayado Fino virus (MRFV) proteine ​​di rivestimento auto-assemblano in Escherichia coli che producono VLP stabili e vuoti che sono stabilizzati da proteina-proteina interazioni e che possono essere utilizzati in applicazioni basate su virus tecnologie 8. VLPs prodotte in piante di tabacco sono stati esaminati da impalcatura su cui una varietà di peptidi possono essere covalentemente visualizzato 13. Qui, descriviamo la procedura per 1) determinare quale dei solventi accessibili cisteine ​​in un capside del virus sono disponibili per modifizione, e 2) Bioconjugate peptidi alle capsidi modificati. Utilizzando nativi o mutationally-inserito residui di aminoacidi e tecnologie standard di accoppiamento, una grande varietà di materiali sono stati visualizzati sulla superficie del virus vegetali come, virus del mosaico Brome 3, virus della screziatura Carnation 12, Cowpea clorotiche mottle virus 6, mosaico del tabacco virus 17, Rapa virus del mosaico giallo 1, e MRFV 13.

Espressione transitoria di cappotto mutanti MRFV proteine ​​(CP) geni in N. benthamiana piante in un PVX basati VLPs vettore producono è descritto nella Figura 1. Il mantello modificato MRFV proteina gene viene amplificato mediante PCR e quindi posto sotto il controllo trascrizionale del promotore subgenomico duplicato CP in un PVX-based vettore, pP2C2S 2, (un dono di D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inghilterra). In vitro la trascrizione di RNA produce trascri...

Un metodo per analizzare l&#39;accessibilità al solvente del gruppo tiolo della cisteina residui di<em&gt; Mais Rayado Fino virus</em&gt; (MRFV)-particelle simili a virus (VLPs) seguiti da un peptide reazione di reticolazione è descritto. Il metodo sfrutta la disponibilità di gruppi chimici diversi sulla superficie delle VLPs che possono essere bersagli per reazioni specifiche.

Analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in<em&gt; Mais Rayado Fino virus</em&gt; Particelle virus-simili Prodotto in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Piante e Cross-linking di peptidi a VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è eseguire un'analisi di accessibilità del solvente dei residui di Cisteina sulla superficie di particelle simili a virus, o VLP, seguita dal legame incrociato di peptidi alla Cisteina presente sulle particelle simili a virus. Questo risultato si ottiene innanzitutto clonando la proteina del capside del virus del mosaico lineato del mais, o MRFV, in un vettore virale basato sul virus X della patata. Successivamente, piante di N. benthamiana vengono inoculate con il virus modificato e le VLP di MRFV, formate dalla proteina del capside, vengono purificate. Infine, le VLP e i peptidi vengono legati mediante ammonia-PEG4-maleimide e rilevati tramite western blot. I risultati ottenuti identificano la produzione di complessi peptidici-VLP mediante analisi western blot. La tecnica amplia la base conoscitiva su come modificare chimicamente la superficie di virus e particelle simili a virus per produrre nuovi materiali per la nanotecnologia.Dopo aver prodotto trascritti di RNA Capped T7 da plasmidi vettoriali basati sul virus X della patata, contenenti i geni della proteina coat di MRFV wild type e con mutazione cys, utilizzare due aliquote da 10 microlitri ciascuna per inoculare due foglie di N. benthamiana. Incubare le piante per 10 giorni in serra con umidità al 60% e un fotoperiodo di 16 ore di luce a 25 gradi Celsius e 8 ore di buio a 20 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raccogliere le foglie infette dal virus, pesare il tessuto vegetale e porlo sul ghiaccio. Dopo aver purificato le particelle simili al virus secondo il protocollo descritto nel testo, preparare una soluzione di Fluoresceina-5-maleimide a un millimolare in tampone fosfato di sodio 50 millimolare, pH 7,0, 1 millimolare EDTA. Vortexare fino a completo scioglimento e proteggere la soluzione dalla luce avvolgendola con carta d'alluminio. Mescolare circa 30 microlitri di VLPs a un microgrammo per microlitro con 60 microlitri di Fluoresceina-5-maleimide e incubare per due ore a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Arrestare la reazione aggiungendo DTT a una concentrazione finale di 50 millimolare. Mediante una colonna cromatografica per desalting rimuovere la fluoresceina non reagita. Per visualizzare le VLPs con residui di cisteina disponibili per il cross-linking, eseguire un'analisi SDS-PAGE aggiungendo 10 microlitri di tampone campione 2x a 10 microlitri di ogni reazione. Conservare la proteina marcata protetta dalla luce a quattro gradi Celsius fino a un mese oppure in aliquote monouso a meno 20 gradi Celsius fino a tre mesi.Preparare una soluzione madre fresca di crosslinker sciogliendo 10 milligrammi di crosslinker NHS-PEG4-maleimide in 680 microlitri di dimetilsulfossido. Sciogliere un peptide lungo 17 (F)-amminoacidi in 50 microlitri di buffer di coniugazione a una concentrazione di 0,1 millimolare. Aggiungere quattro microlitri di crosslinker a 50 microlitri del peptide solubilizzato per ottenere una concentrazione finale di un millimolare. Incubare la reazione per due ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una colonna di desalting per purificare la reazione. Utilizzando VLPs con residui di cisteina disponibili per il cross-linking e il peptide cross-linkato, impostare una miscela di reazione in un rapporto molare determinato dal numero di tioli e ammine attivate coinvolti nella reazione e dalla differenza di peso molecolare tra VLPs e peptide. Dopo aver incubato la reazione per due ore a temperatura ambiente, utilizzarla per eseguire elettroforesi SDS-PAGE e western blotting secondo il protocollo descritto nel testo.Di seguito è riportato un esempio di aminoacidi reattivi della proteina del capside del MRFV. Ogni aminoacido selezionato può essere utilizzato per attaccare gruppi funzionali, a condizione che sia esposto sulla superficie. Le tecniche chimiche includono strategie tradizionali di bioconiugazione, come l'acilazione del gruppo amminico della lisina, l'alchilazione del gruppo sulfidrilico della cisteina e l'attivazione dei residui di acido carbossilico con successiva accoppiamento ad ammine aggiunte.Inoltre, i gruppi aromatici della tirosina e del triptofano possono rappresentare bersagli interessanti per la bioconjugazione attraverso diazotizzazione e alchilazione. Qui viene illustrata la disponibilità al solvente dei residui di Cys nei VLP rispetto a reagenti specifici per i gruppi tiolici. I VLP di tipo selvaggio purificati e i mutanti cys-VLP portatori di residui di cisteina nelle posizioni da 107 a 111 e da 192 a 194 del gene della proteina capsidica (CP) risultano inattivi in condizioni native con un reagente specifico per gruppi tiolici. Il fluoresceina-5-maleimide conferisce fluorescenza arancione soltanto al mutante cys-VLP portatore di residui di cisteina nelle posizioni da 125 a 129 del gene CP. Il risultato mostra che i VLP nella corsia due presentano un'organizzazione geometrica dei residui di cisteina che determina la presenza di gruppi tiolici liberi esposti al solvente, mentre i residui di cisteina nei campioni delle corsie uno e tre potrebbero essere coinvolti in ponti disolfuro durante il ripiegamento della proteina capsidica. Le reazioni di marcatura con maleimide-PEG2-biotina seguite da un saggio biotinilante rappresentano un altro esempio di analisi della disponibilità al solvente dei residui di cisteina. Poiché la biotina è una molecola relativamente piccola, può essere coniugata in più copie sui VLP, ciascuna delle quali lega una molecola di avidina, come mostrato qui. Il grado di biotinilazione, pari a 84,74 moli di biotina per mole di proteina, indica il numero di molecole di biotina legate ai VLP e, di conseguenza, il numero di ligandi che possono essere esposti sulla superficie esterna. A causa della disponibilità di diversi gruppi tiolici sui VLP, i peptidi possono essere legati mediante reazioni di cross-linking con NHS-PEG4-maleimide.Questo reagente è un crosslinker etero-bifunzionale, che contiene estremità reattive come N-idrossi succinimmide o estere NHS e gruppi maleimide, consentendo la coniugazione covalente di molecole contenenti ammine e gruppi solfidrilici. In questo esempio, l'estere NHS reagisce con le ammine primarie formando legami ammidici, mentre il maleimide reagisce con i gruppi solfidrilici formando legami tioesterici stabili. Come mostrato qui, le reazioni di cross-linking producono complessi VLP-peptide che risultano immunoreattivi con gli anticorpi specifici nel western blot.Questo sviluppo mostra ai ricercatori nel campo della virologia come esplorare l'uso di particelle virali come impalcatura per l'ancoraggio di una vasta gamma di ligandi in un reticolo geometrico regolare, per numerose applicazioni.

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