Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare simultaneamente le modifiche della cromatina e le sequenze di DNA utilizzando la microscopia confocale 3D, vengono generate le prime sonde di DNA specifiche. Nel frattempo, le cellule sperimentali sono a permeazione fissa e immunocolorate. Per i marcatori istonici di interesse.

Le cellule vengono quindi denaturate e una fluorescenza notturna all'interno di te. L'ibridazione o pesce viene eseguita utilizzando una o più sonde di DNA. Infine, le cellule vengono lavate e montate per la fluorescenza 3D.

L'analisi al microscopio delle immagini risultanti rivela la localizzazione nucleare di loci di interesse e l'associazione con specifiche modificazioni dei calcoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina la visualizzazione di proteine nucleari, inclusi calcoli con loci genomici in nuclei conservati 3D, e può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'organizzazione nucleare epigenetica della cromatina o della regolazione genica. Per questa procedura, per l'etichettatura possono essere utilizzati plasmidi posteriori o prodotti PCR.

Questi devono essere preparati come descritto nel testo di accompagnamento. Si noti che per un segnale robusto per i pesci, le sonde dovrebbero spendere almeno 10 coppie di kilobasi. Inizia questa procedura combinando un microgrammo di DNA e 0,17 microgrammi di RNA A in una provetta da microcentrifuga.

Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, inattivare brevemente gli RNA A sul ghiaccio e aggiungere la quantità appropriata di traduzione di Nick. Mescolare, incubare per due ore a 16 gradi Celsius in un bagno d'acqua refrigerato o in un blocco freddo per inattivare la reazione.

Posizionare i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un'ora o di una temperatura negativa di 20 gradi Celsius durante la notte. Quindi, determinare la dimensione della sonda su un gel agros al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 101.000 coppie di basi, con la maggior parte di circa 300-500 coppie di basi.

Si noti che la macchia delle sonde fantascientifiche non è visibile. Una volta determinata la dimensione, purificare le sonde mediante dialisi allo 0,02. Filtri da cinque millimetri in becher da due litri riempiti d'acqua.

Pipettare delicatamente 200 microgrammi di sonda al centro di ciascun filtro galleggiante, quindi incubare per due ore al buio. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente la sonda dai filtri a una nuova provetta per microcentrifuga. Quindi, aggiungere i fattori di blocco alle sonde come segue.

Un microgrammo di CO 1D NA. Un microgrammo di DNA ad alto blocco e 10 microgrammi di sperma di salmone per un microgrammo di sonda di DNA e una miscela conservano le sonde di DNA a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Il giorno della procedura per il pesce, le sonde vengono precipitate e preparate per l'uso. Si noti che i passaggi descritti in questa sezione del video devono essere eseguiti in parallelo con i passaggi nella sezione seguente.

Per precipitare le sonde, seguirle e combinarle con 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio a pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo al 100% incubare per un'ora a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, far girare le sonde verso il basso a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e asciugare i pellet all'aria al buio.

A seconda della quantità e del colore delle sonde, il pellet può essere visibile o meno. Resus sospendere il pellet in 15 microlitri di tampone di ibridazione per condizione di prova e agitare utilizzando un termomiscelatore einor al buio a 37-45 gradi Celsius per circa 20 minuti. Successivamente, per denaturare le sonde, incubarle per cinque minuti a 75-95 gradi Celsius.

Quindi, per pre-sonde, incubarle a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti sul termomiscelatore. Immediatamente dopo l'incubazione, le sonde verranno applicate alle cellule su vetrini coprioggetti come descritto nella sezione successiva del video. Si noti che per i passaggi successivi, i tempi di incubazione devono essere modificati secondo necessità per gli anticorpi e le cellule utilizzate.

I passaggi descritti in questa sezione del video devono essere eseguiti in parallelo con i passaggi della sezione precedente, come descritto nel testo allegato. Far cadere le cellule non aderenti sopra i vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina in pozzetti di piastre a sei pozzetti e lasciarli attaccare per cinque minuti. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di aldeide paraforme al 2% in PBS, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Sciacquare ogni pozzetto con PB S3 volte quindi per permeare le cellule, aggiungere due millilitri di ghiaccio freddo, 0,4% di Triton X 100 in PBS e incubare per cinque minuti su ghiaccio. Dopo aver aspirato la soluzione permeabile se il DNA del pesce sarà combinato con l'immunofluorescenza, procedere come segue. Per prima cosa pipettare 100 microlitri di soluzione bloccante su param in una camera umidificata.

Posizionare la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione bloccante e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferisci. Il coperchio scivola a 100 microlitri di gocce dell'anticorpo primario diluito in soluzione bloccante.

Qui l'anticorpo utilizzato riconosce il siriano fosforilato 1 39 di H due A x o gamma H due A x. Incubare i vetrini in una camera umidificata per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetti.

Se i vetrini coprioggetto sono difficili da raccogliere, inondati di PBS e riprova. Trasferire ogni vetrino in un pozzo di sei. La piastra a pozzetti contenente due millilitri di 0,2% BSA 0,1% tra 20 in PBS lava i vetrini coprioggetto in questa soluzione tre volte per cinque minuti a temperatura ambiente agitando, quindi incuba le cellule con l'anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato diluito in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente in una camera buia e umida su param.

Come prima dopo l'incubazione, sciacquare le cellule allo 0,1% tra 20 in PB S3 volte per cinque minuti a temperatura ambiente al buio per postfissare le cellule, immergerle in due millilitri di para formaldeide al 2% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Una volta che le cellule sono state colorate o se non lo sono, continuare il DNA del pesce sciacquando i vetrini coprioggetto tre volte in PBS. Quindi posizionare il vetrino coprioggetto con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 100 microlitri di 0,1 milligrammi per millilitro.

Gli RNA vengono messi in una camera umidificata e incubati per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare tre volte i vetrini copricoperchio in PBS, quindi permeare le cellule in Trix 100 ghiacciato allo 0,7% in acido cloridrico 0,1 molare per 10 minuti su ghiaccio al buio. Dopo tre risciacqui in PBS, denaturare le cellule in acido cloridrico molare 1,9 per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e lavare altre tre volte in PBS ghiacciato per poi ibridare le cellule con le sonde.

Posizionare il vetrino copricoperchio con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 15 microlitri di sonda preparata nella sezione precedente di questo video su un vetrino da microscopio, sigillare il vetrino con cemento di gomma e incubare per una notte a 37 gradi Celsius in una camera umidificata buia. Il giorno successivo, utilizzare una pinza per rimuovere con cura il cemento di gomma dai vetrini. Quindi fluire i vetrini coprioggetti con due Acts SSC e utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetti con le cellule.

Quindi metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio. Successivamente, eseguire i seguenti lavaggi agitando al buio due XSSC per 30 minuti a 37 gradi Celsius, due XSSC per 30 minuti a temperatura ambiente e un XSSC per 30 minuti a temperatura ambiente per montare i vetrini, posizionare i vetrini coprioggetto con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 10 a 15 microlitri di mezzo di montaggio in oro prolungato contenente 1,5 milligrammi per millilitro DPI sigillare con smalto per unghie. I vetrini possono essere conservati per mesi a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Una volta che i vetrini sono pronti, raccogliere immagini 3D con sezioni ottiche separate da 0,3 micron e analizzare come descritto nel documento di accompagnamento per determinare se i cambiamenti nell'associazione dei due alleli dei loci del recettore dell'antigene sono legati alla regolazione del processo di ricombinazione VDJ durante lo sviluppo dei linfociti, le cellule wild type e mutanti carenti nella proteina ricombinasi rag one sono state utilizzate per esaminare un locus di interesse utilizzando un DNA sonda di pesce generata da una parte posteriore che si estende per circa 200 coppie di basi che comprendono la regione genomica. Le distanze tra gli alleli sono state misurate tra il centro di massa di ciascun segnale posteriore in pile di immagini 3D, cerchi tratteggiati, forme di nucleo. Le barre della scala mostrate sono curve di distribuzione di frequenza cumulativa di un micron sono state quindi generate per mostrare l'intera gamma di distanze tra i due alleli misurate nelle cellule wild type e mutante.

Il test KS non parametrico a due campioni è stato quindi utilizzato per valutare la significatività delle differenze tra le due distribuzioni. La gamma delle differenze più robuste nelle distanze interalleliche è stata valutata utilizzando una serie di due test esatti del pescatore di coda indicati dai punti blu. I valori P più robusti indicati dai punti più alti sono stati trovati per le distanze intorno al micron.

Pertanto, il cutoff per la stretta associazione o l'accoppiamento dei due alleli è stato impostato a un micron. Le curve di frequenza cumulative mostrate qui indicano l'intervallo di distanze per la stretta associazione dei due alleli da zero a 1,5 micron nelle due diverse condizioni biologiche. Il significato dell'accoppiamento dei due alleli è stato valutato utilizzando il test esatto del fisher a due code per un cutoff a un micron.

Questo grafico mostra che nella condizione mutante, i due alleli non sono associati ad alta frequenza come nel wild type. Pertanto, quello dello straccio proteico mancante è coinvolto nell'appaiamento ico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare l'immunofluorescenza e il DNA dei pesci.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori fornendo informazioni sui cambiamenti globali nell'architettura nucleare, sul comportamento di specifici loci genomici e regioni all'interno dello spazio nucleare e sull'associazione di specifiche proteine nucleari all'interno di queste regioni. E aiuta a comprendere i meccanismi alla base delle diverse malattie che seguono questa procedura. Altri metodi, come le tecniche di produzione del ghiaccio a livello di genoma, come la cromatina, le precipitazioni immunologiche o la ricerca di chip o la conferma della cattura cromosomica, abbinate al sequenziamento profondo come fore five C o IC, possono essere eseguiti per fornire dati globali sulle popolazioni cellulari.