Name: Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Scopri come combinare immunofluorescenza e DNA FISH per analizzare modificazioni istoniche e sequenze genomiche in nuclei intatti. Questo metodo avanzato consente la visualizzazione 3D della cromatina.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Skok, soprattutto Susannah Hewitt, per le discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Institute of sovvenzioni Salute R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS è un Leukemia &amp; Lymphoma Society studioso. JC è un Fellow Irvington Istituto del Cancer Research Institute. MM è supportato da una formazione National Science Foundation Graduate Concessione Integrativa e tirocinio di ricerca (NSF IGERT 0333389).

1. DNA Etichettatura Sonda con Fluorofori: Nick Traduzione (~ 6 ore) <ol><li> Pulito BAC DNA (preparato da maxi-prep) o plasmidi o prodotti PCR, tutti risospeso in H 2 O, possono essere utilizzati per l&#39;etichettatura. Noti che per un segnale FISH robusta, le sonde devono estendersi almeno 10 kb. </li><li> Incubare DNA in RNasi A per 30 min a 37 ° C (Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella 1). </li><li> Incubare la reazione traduzione nick per 2 ore a 16 ° C (vedi tabelle 2 e 3). Metodi alternativi di etichettatura diretta può essere utilizzato (esempio: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inattivare la reazione per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C. </li><li> Determinare le dimensioni della sonda su un gel di agarosio al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 100 e 1.000 bp, con la maggioranza di circa 300-500 bp (Si noti che la macchia di Cy5-sonde non è visibile). Se il DNA non è digerito abbastanza, più DNA Pol I eDNasi I può essere aggiunto alla reazione ed incubata per due ore più a 16 ° C. </li><li> Purificare sonde su filtri 0,025 mm in due bicchieri litro riempite con H 2 0 per due ore al buio. </li><li> Aggiungere fattori bloccanti alle sonde come segue: 10 mg di DNA Cot-1, 10 ug di DNA Hybloc e 100 pg di sperma di salmone per 10 pg di sonde di DNA. DNA sonde Conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Sonda Precipitazioni / Denaturazione / Pre-ricottura (ore 3-4) <ol><li> Tra 0,3 mg e 1 mg di test sul DNA viene utilizzato per coprioggetto. Sonde mescolare con 0,1 volume di 3M NaAc (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%, incubare per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C e centrifugare a 13.000 rpm a 4 ° C per 30 min. Si noti che la quantità di sonda di DNA può essere regolata a seconda della qualità del DNA nucleare e la regione di ibridazione. Metodi alternativi di etichettatura diretta può consentire l&#39;utilizzo di ridotte quantità disonda. Per il rilevamento di segnali multipli FISH DNA su una diapositiva, diverse sonde può essere precipitato insieme (tranne le sonde che non dovrebbero essere pre-cotto, come sequenze ripetute). Sonde per diversi esperimenti eseguiti contemporaneamente può anche essere precipitato insieme. Pellet dovrebbe essere leggermente colorata secondo i fluorofori utilizzati (se piccole quantità di sonde vengono precipitati, il pellet può non essere visibile). </li><li> Pellet secco e risospendere in 15 microlitri tampone di ibridazione (cfr. tabella 4) per coprioggetto con agitazione (con un Thermomixer Eppendorf) al buio a 37-45 ° C (per circa 20 min). </li><li> Sonde Denaturare per 5 minuti a 75-95 ° C. </li><li> Pre-ricottura sonde a 37 ° C per 30-60 min. Lunghezza del pre-ricottura può essere regolata a seconda della complessità e qualità delle sonde. </li><li> Applicare i coprioggetti sonde per l&#39;ibridazione durante la notte (cfr. sezione 3). </li></ol> 3. 3-Dimensionale FISH DNA - Primo Giorno (~ 3 ore) <ol><li> Cellule non aderenti sono concentrate in un piccolo volume di PBS 1x (~ 2x10 5 cellule in 5-10 microlitri 1x PBS per vetrino) e scaricati sul centro di un poli-L-lisina coprioggetto rivestiti. Cellule aderenti dovrebbero essere coltivate su vetrini per almeno 24 ore (confluenza ~ 70%) (vetrini possono essere rivestiti con gelatina 0,1%). Quadrati 18x18 a 24-24 coprioggetti mm sono poste in piastre da 6 pozzetti, e tutto il protocollo, due ml di ciascuna soluzione viene usato per pozzetto (in alternativa rotonde coprioggetto 1,5 millimetri può essere posto in piastre 12/24-well). </li><li> Fissare cellule in paraformaldeide al 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, per 10 minuti a RT (4% PFA scorte possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C). Paraformaldeide possono essere acquistati in soluzione (16%), o soluzioni di riserva del 4% può essere preparato da polvere / granuli. Paraformaldeide in polvere viene dissolto in PBS 1x a&gt; 60 ° C (pH può essere portato a 8-9 per facilitare la dissoluzione), raffreddato in ghiaccio, regolareed a pH 7-7,4, filtrata, aliquotare falchi e conservati per settimane a -20 ° C. </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS per 5 minuti in ghiaccio. Lunghezza di permeabilizzazione può essere regolata a seconda del tipo cellulare. NB: Se FISH DNA viene combinato con immunofluorescenza, l&#39;immunocolorazione deve essere eseguita in questa fase (vedi sezione 4). </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, incubare le cellule con 0,1 mg / microlitri RNasi A in PBS 1x per un ora a 37 ° C. Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetto vengono poi accuratamente rimosso con una pinza. Se si incontra una resistenza, coprioggetto deve essere allagato con PBS 1x per evitare di danneggiare le cellule. </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,7% Triton-X-100 / HCl 0,1 M per 10 min in ghiaccio. </li><li> Dopo tre lavaggi in 1x PBS, le cellule denaturate in HCl 1,9 M per 30 minuti a RT. Alternativamente, le cellule possono essere denaturati in 50% di formammide / 2x SSC a 75-80 ° C per almeno 30 min. Notare che la lunghezza ibridazione (e temperatura) può essere ottimizzato a seconda del tipo cellulare. </li><li> Dopo tre lavaggi in ghiacciata 1x PBS, le cellule ibridare con sonde notte a 37 ° C in una camera oscura e umida. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo del 15 microlitri di sonda su un vetrino, e sigillato con mastice. </li></ol> 4. 3-dimensionale Immuno-FISH - Primo Giorno (~ 6-7 ore) <ol><li> Per combinato immunofluorescenza / DNA FISH, immuno-colorazione deve essere eseguita dopo la permeabilizzazione nello 0,4% Triton-X-100 (punto 3.3). </li><li> Incubare le cellule in soluzione di blocco per 30 minuti a RT (2,5% di sieroalbumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,1% Tween-20). La soluzione bloccante è filtrata, aliquotare Eppendorfs 1,5 ml e conservati per mesi a -20 ° C. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo primario sollevata contro la proteina o la modificazione degli istoni di interesse diluito in soluzione di bloccaggio, per un ora a RT in una camera umida. Qui vi mostriamo l&#39;esempio di un anticorpo contro fosforilati della serina-139 di H2AX (γ-H2AX, Millipore: vedi Tabella 5 per i dettagli). Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetti sono poi accuratamente rimosso con una pinza (inondato con PBS 1x se necessario). Notare che la diluizione e la lunghezza di incubazione può essere regolata a seconda della qualità del anticorpo e cellule-tipi. </li><li> Lavare le cellule in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Incubare le cellule con il fluoroforo appropriato anticorpo secondario coniugato diluito in soluzione di blocco per un ora a RT in una camera oscura e umida. Qui mostriamo un esempio di rilevamento con unsecondario di capra anti-topo (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen, vedere la Tabella 5 per i dettagli). Anticorpi secondari coniugati aptene-(biotina, digossigenina, etc) potrebbe anche essere usato. In questo caso, un ulteriore passaggio per il rilevamento appropriato (streptavidina, anti-dig, ecc) può essere eseguita prima o dopo over-notte ibridazione DNA-FISH. </li><li> Risciacquare le cellule in 0,1% di Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione al buio. </li><li> Post-fix cellule nel 2% paraformaldeide / 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Continua FISH DNA come sopra da incubazione a RNasi A (passo 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensionale DNA FISH / Immuno-FISH - Secondo giorno (circa 2 ore) <ol><li> Rimuovere con cautela cemento di gomma, vetrini alluvione con 2x SSC, rimuovere con cautela con una pinza e metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio. </li><li> Lavare le cellule in 2x SSC per 30 min a 37 ° C al buio con agitazione.</li><li> Lavare le cellule in 2x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione. </li><li> Lavare le cellule in 1x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione noti che in caso di denaturazione con formammide, lavaggi deve essere sostituito dal seguente:. 3 lavaggi a 50% formammide lavaggi / 2x SSC e 3 in 2x SSC, 5 min ciascuna, a 37 ° C. </li><li> Montare cellule in mezzo prolungare oro montaggio contenente 1,5 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) per controcolorazione di DNA totale. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo di 10-15 ml di mezzo di montaggio su un vetrino e sigillato con smalto. I vetrini sono conservati per mesi a -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopia e analisi 3D <ol><li> Le immagini 3D possono essere acquisite con sistemi microscopio diversi. Nei nostri esperimenti, sezioni ottiche separate di 0,3 micron vengono raccolti su un sistema Leica SP5 AOBS confocale (acusto-ottico Beam Splitter). Notare che la distanza tra ottical piani possono essere regolati a seconda del tipo di analisi. </li><li> Stack di immagini 3D possono essere analizzati utilizzando diversi software e strumenti. Usiamo il software J immagine per valutare le misure di distanza tra i loci di interesse e di analizzare i diversi tipi di associazione dei loci di interesse con sub-nucleare compartimenti o proteine. </li><li> Tutte le analisi statistiche sono effettuate per confrontare due (o più) diverse condizioni biologiche con coppie di valutazione (s) di importanza: confronto tra diversi tipi di cellule o fasi, il confronto tra i diversi loci di interesse. In tutti i test statistici, P-value ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) sono presi per essere significativo (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * molto significativo, p &lt;1,00 E-3 *** altamente significativo). </li></ol> Analisi statistica delle distribuzioni intero distanze tra due alleli. Abbiamo prima construct cumulativi curve di frequenza di distribuzione su tutta la gamma di distanze misurate tra i due alleles.To valutare la significatività delle differenze tra le distribuzioni empiriche di inter-alleliche distanze che utilizziamo il non parametrico due campioni di Kolmogorov-Smirnov (KS) prova 13,14. L&#39;analisi statistica di una stretta associazione (pairing cioè) di due alleli con una distanza ottimale di cut-off. Per identificare la gamma di robusti maggior parte delle differenze in termini di distanze tra due alleli o loci, si usa una serie di due code test esatto di Fisher 15 s. Vale a dire, ad ogni distanza misurata abbiamo verificare se una condizione è significativamente sovrarappresentati a brevi distanze tra i due campioni. Il minimo nella distribuzione dei valori p indica l&#39;intervallo di distanze che devono essere considerati come un cut-off per la stretta associazione (pairing cioè) dei due alleli. Successivamente il due code test esatto di Fisher è usato to valutare l&#39;importanza di accoppiamento di due alleli al identificato cut-off 15. Correzioni test multipli vengono conteggiati per il numero totale di test eseguiti Fisher 16. Analisi statistica di associazione del locus di interesse con compartimenti sub-nucleari o proteine. La due code esatto di Fisher-test viene utilizzato per analizzare il significato di associazione del locus di interesse con diversi scomparti o proteine ​​15.

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<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
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<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
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<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti 30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine ​​nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di permeabi...

Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l&#39;eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati 6-11. Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le analisi molecolari e biochimici valutando specifiche interazioni / associazioni di sequenze di DNA e / o proteine ​​all&#39;interno del nucleo. Inoltre, mentre il genoma tecniche ad alto rendimento, come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) o la cattura conformazione cromosoma accoppiata con sequenziamento profondo (4C-seq, 5C, Hi-C) forniscono dat globaleuna su popolazioni cellulari 12, immunofluorescenza / DNA tecniche FISH affinché le analisi a livello di singola cellula. Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-FISH). Il vantaggio di questo protocollo è la visualizzazione combinata di DNA e conservazione delle strutture proteiche. La nostra esperienza in questo campo ci ha consentito di migliorare e semplificare i protocolli esistenti. Anche se abbiamo usato questo protocollo per rilevare il DNA a doppio filamento rompe in linfociti sottoposti ricombinazione, questo metodo può essere applicato ad altre proteine ​​e altri tipi di cella.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pescatore </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 a C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 o Cy5 dUTP </td><td> Pescatore </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 micron filtri </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 mg / ml </td><td> Applied Genetics </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Salmone sperma </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> polvere da risospese a 10 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (Acetato di sodio, pH 5.2, soluzione tampone) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grado) </td><td> Pescatore </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidone (Mol Biol grado) </td><td> Pescatore </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato polvere </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Saline-Sodio Fosfato-EDTA) soluzione 20x </td&gt; <td> Pescatore </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Pescatore </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Pescatore </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Diapositive </td><td> Pescatore </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-pozzetti </td><td> Pescatore </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pescatore </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina soluzione </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide, granuli, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol grade </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina di siero bovino) Frazione V </td><td> Pescatore </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol grade </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrato di sodio Saline) 20x soluzione </td><td> Pescatore </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro antifade </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Miglior prova di uno strato di cemento di gomma </td><td> D&#39;arte o in ufficio di approvvigionamento negozi </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti specifici e piccole attrezzature. </td></tr></tbody></table>

immunofluorescenza combinato e fish dna 3d conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3d organizzazione nucleare

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Ibridazione fluorescente in situ con l&#39;utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l&#39;architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine ​​nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l&#39;epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l&#39;architettura 3D del nucleo, e dall&#39;altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici 1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.

DNA e immuno-FISH vengono utilizzate in laboratorio Skok di studiare le variazioni dell&#39;organizzazione nucleare associati al processo di V (D) J ricombinazione dei loci recettore per l&#39;antigene durante lo sviluppo dei linfociti B e T. Le tecniche sopra descritte ci permettono di i) misurare le distanze tra le due estremità di un locus (contrazione), ii) misurare le distanze tra alleli o loci (pairing), iii) analizzare il danno al DNA che si verificano all&#39;interno loci, iv) verificare la posizione degli allel...

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare simultaneamente le modifiche della cromatina e le sequenze di DNA utilizzando la microscopia confocale 3D, vengono generate le prime sonde di DNA specifiche. Nel frattempo, le cellule sperimentali sono a permeazione fissa e immunocolorate. Per i marcatori istonici di interesse.Le cellule vengono quindi denaturate e una fluorescenza notturna all'interno di te. L'ibridazione o pesce viene eseguita utilizzando una o più sonde di DNA. Infine, le cellule vengono lavate e montate per la fluorescenza 3D.L'analisi al microscopio delle immagini risultanti rivela la localizzazione nucleare di loci di interesse e l'associazione con specifiche modificazioni dei calcoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina la visualizzazione di proteine nucleari, inclusi calcoli con loci genomici in nuclei conservati 3D, e può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'organizzazione nucleare epigenetica della cromatina o della regolazione genica. Per questa procedura, per l'etichettatura possono essere utilizzati plasmidi posteriori o prodotti PCR.Questi devono essere preparati come descritto nel testo di accompagnamento. Si noti che per un segnale robusto per i pesci, le sonde dovrebbero spendere almeno 10 coppie di kilobasi. Inizia questa procedura combinando un microgrammo di DNA e 0,17 microgrammi di RNA A in una provetta da microcentrifuga.Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, inattivare brevemente gli RNA A sul ghiaccio e aggiungere la quantità appropriata di traduzione di Nick. Mescolare, incubare per due ore a 16 gradi Celsius in un bagno d'acqua refrigerato o in un blocco freddo per inattivare la reazione.Posizionare i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un'ora o di una temperatura negativa di 20 gradi Celsius durante la notte. Quindi, determinare la dimensione della sonda su un gel agros al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 101.000 coppie di basi, con la maggior parte di circa 300-500 coppie di basi.Si noti che la macchia delle sonde fantascientifiche non è visibile. Una volta determinata la dimensione, purificare le sonde mediante dialisi allo 0,02. Filtri da cinque millimetri in becher da due litri riempiti d'acqua.Pipettare delicatamente 200 microgrammi di sonda al centro di ciascun filtro galleggiante, quindi incubare per due ore al buio. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente la sonda dai filtri a una nuova provetta per microcentrifuga. Quindi, aggiungere i fattori di blocco alle sonde come segue.Un microgrammo di CO 1D NA. Un microgrammo di DNA ad alto blocco e 10 microgrammi di sperma di salmone per un microgrammo di sonda di DNA e una miscela conservano le sonde di DNA a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Il giorno della procedura per il pesce, le sonde vengono precipitate e preparate per l'uso. Si noti che i passaggi descritti in questa sezione del video devono essere eseguiti in parallelo con i passaggi nella sezione seguente.Per precipitare le sonde, seguirle e combinarle con 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio a pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo al 100% incubare per un'ora a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, far girare le sonde verso il basso a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e asciugare i pellet all'aria al buio.A seconda della quantità e del colore delle sonde, il pellet può essere visibile o meno. Resus sospendere il pellet in 15 microlitri di tampone di ibridazione per condizione di prova e agitare utilizzando un termomiscelatore einor al buio a 37-45 gradi Celsius per circa 20 minuti. Successivamente, per denaturare le sonde, incubarle per cinque minuti a 75-95 gradi Celsius.Quindi, per pre-sonde, incubarle a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti sul termomiscelatore. Immediatamente dopo l'incubazione, le sonde verranno applicate alle cellule su vetrini coprioggetti come descritto nella sezione successiva del video. Si noti che per i passaggi successivi, i tempi di incubazione devono essere modificati secondo necessità per gli anticorpi e le cellule utilizzate.I passaggi descritti in questa sezione del video devono essere eseguiti in parallelo con i passaggi della sezione precedente, come descritto nel testo allegato. Far cadere le cellule non aderenti sopra i vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina in pozzetti di piastre a sei pozzetti e lasciarli attaccare per cinque minuti. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di aldeide paraforme al 2% in PBS, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.Sciacquare ogni pozzetto con PB S3 volte quindi per permeare le cellule, aggiungere due millilitri di ghiaccio freddo, 0,4% di Triton X 100 in PBS e incubare per cinque minuti su ghiaccio. Dopo aver aspirato la soluzione permeabile se il DNA del pesce sarà combinato con l'immunofluorescenza, procedere come segue. Per prima cosa pipettare 100 microlitri di soluzione bloccante su param in una camera umidificata.Posizionare la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione bloccante e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferisci. Il coperchio scivola a 100 microlitri di gocce dell'anticorpo primario diluito in soluzione bloccante.Qui l'anticorpo utilizzato riconosce il siriano fosforilato 1 39 di H due A x o gamma H due A x. Incubare i vetrini in una camera umidificata per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetti.Se i vetrini coprioggetto sono difficili da raccogliere, inondati di PBS e riprova. Trasferire ogni vetrino in un pozzo di sei. La piastra a pozzetti contenente due millilitri di 0,2% BSA 0,1% tra 20 in PBS lava i vetrini coprioggetto in questa soluzione tre volte per cinque minuti a temperatura ambiente agitando, quindi incuba le cellule con l'anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato diluito in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente in una camera buia e umida su param.Come prima dopo l'incubazione, sciacquare le cellule allo 0,1% tra 20 in PB S3 volte per cinque minuti a temperatura ambiente al buio per postfissare le cellule, immergerle in due millilitri di para formaldeide al 2% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Una volta che le cellule sono state colorate o se non lo sono, continuare il DNA del pesce sciacquando i vetrini coprioggetto tre volte in PBS. Quindi posizionare il vetrino coprioggetto con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 100 microlitri di 0,1 milligrammi per millilitro.Gli RNA vengono messi in una camera umidificata e incubati per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare tre volte i vetrini copricoperchio in PBS, quindi permeare le cellule in Trix 100 ghiacciato allo 0,7% in acido cloridrico 0,1 molare per 10 minuti su ghiaccio al buio. Dopo tre risciacqui in PBS, denaturare le cellule in acido cloridrico molare 1,9 per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e lavare altre tre volte in PBS ghiacciato per poi ibridare le cellule con le sonde.Posizionare il vetrino copricoperchio con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 15 microlitri di sonda preparata nella sezione precedente di questo video su un vetrino da microscopio, sigillare il vetrino con cemento di gomma e incubare per una notte a 37 gradi Celsius in una camera umidificata buia. Il giorno successivo, utilizzare una pinza per rimuovere con cura il cemento di gomma dai vetrini. Quindi fluire i vetrini coprioggetti con due Acts SSC e utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetti con le cellule.Quindi metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio. Successivamente, eseguire i seguenti lavaggi agitando al buio due XSSC per 30 minuti a 37 gradi Celsius, due XSSC per 30 minuti a temperatura ambiente e un XSSC per 30 minuti a temperatura ambiente per montare i vetrini, posizionare i vetrini coprioggetto con la cella rivolta verso il basso su una goccia da 10 a 15 microlitri di mezzo di montaggio in oro prolungato contenente 1,5 milligrammi per millilitro DPI sigillare con smalto per unghie. I vetrini possono essere conservati per mesi a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.Una volta che i vetrini sono pronti, raccogliere immagini 3D con sezioni ottiche separate da 0,3 micron e analizzare come descritto nel documento di accompagnamento per determinare se i cambiamenti nell'associazione dei due alleli dei loci del recettore dell'antigene sono legati alla regolazione del processo di ricombinazione VDJ durante lo sviluppo dei linfociti, le cellule wild type e mutanti carenti nella proteina ricombinasi rag one sono state utilizzate per esaminare un locus di interesse utilizzando un DNA sonda di pesce generata da una parte posteriore che si estende per circa 200 coppie di basi che comprendono la regione genomica. Le distanze tra gli alleli sono state misurate tra il centro di massa di ciascun segnale posteriore in pile di immagini 3D, cerchi tratteggiati, forme di nucleo. Le barre della scala mostrate sono curve di distribuzione di frequenza cumulativa di un micron sono state quindi generate per mostrare l'intera gamma di distanze tra i due alleli misurate nelle cellule wild type e mutante.Il test KS non parametrico a due campioni è stato quindi utilizzato per valutare la significatività delle differenze tra le due distribuzioni. La gamma delle differenze più robuste nelle distanze interalleliche è stata valutata utilizzando una serie di due test esatti del pescatore di coda indicati dai punti blu. I valori P più robusti indicati dai punti più alti sono stati trovati per le distanze intorno al micron.Pertanto, il cutoff per la stretta associazione o l'accoppiamento dei due alleli è stato impostato a un micron. Le curve di frequenza cumulative mostrate qui indicano l'intervallo di distanze per la stretta associazione dei due alleli da zero a 1,5 micron nelle due diverse condizioni biologiche. Il significato dell'accoppiamento dei due alleli è stato valutato utilizzando il test esatto del fisher a due code per un cutoff a un micron.Questo grafico mostra che nella condizione mutante, i due alleli non sono associati ad alta frequenza come nel wild type. Pertanto, quello dello straccio proteico mancante è coinvolto nell'appaiamento ico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come combinare l'immunofluorescenza e il DNA dei pesci.Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori fornendo informazioni sui cambiamenti globali nell'architettura nucleare, sul comportamento di specifici loci genomici e regioni all'interno dello spazio nucleare e sull'associazione di specifiche proteine nucleari all'interno di queste regioni. E aiuta a comprendere i meccanismi alla base delle diverse malattie che seguono questa procedura. Altri metodi, come le tecniche di produzione del ghiaccio a livello di genoma, come la cromatina, le precipitazioni immunologiche o la ricerca di chip o la conferma della cattura cromosomica, abbinate al sequenziamento profondo come fore five C o IC, possono essere eseguiti per fornire dati globali sulle popolazioni cellulari.

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Il materiale qui descrive un metodo sviluppato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo è stato definito il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). Questo metodo migliora la sensibilità per il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH).

Metodo di preparazione delle diapositive per preservare l'architettura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Scopri come combinare immunofluorescenza e DNA FISH per analizzare modificazioni istoniche e sequenze genomiche in nuclei intatti. Questo metodo avanzato consente la visualizzazione 3D della cromatina.

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare (Video) | JoVE Journal

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

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