Name: Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Scopri come combinare immunofluorescenza e DNA FISH per analizzare modificazioni istoniche e sequenze genomiche in nuclei intatti. Questo metodo avanzato consente la visualizzazione 3D della cromatina.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Skok, soprattutto Susannah Hewitt, per le discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Institute of sovvenzioni Salute R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS è un Leukemia &amp; Lymphoma Society studioso. JC è un Fellow Irvington Istituto del Cancer Research Institute. MM è supportato da una formazione National Science Foundation Graduate Concessione Integrativa e tirocinio di ricerca (NSF IGERT 0333389).

1. DNA Etichettatura Sonda con Fluorofori: Nick Traduzione (~ 6 ore) <ol><li> Pulito BAC DNA (preparato da maxi-prep) o plasmidi o prodotti PCR, tutti risospeso in H 2 O, possono essere utilizzati per l&#39;etichettatura. Noti che per un segnale FISH robusta, le sonde devono estendersi almeno 10 kb. </li><li> Incubare DNA in RNasi A per 30 min a 37 ° C (Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella 1). </li><li> Incubare la reazione traduzione nick per 2 ore a 16 ° C (vedi tabelle 2 e 3). Metodi alternativi di etichettatura diretta può essere utilizzato (esempio: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inattivare la reazione per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C. </li><li> Determinare le dimensioni della sonda su un gel di agarosio al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 100 e 1.000 bp, con la maggioranza di circa 300-500 bp (Si noti che la macchia di Cy5-sonde non è visibile). Se il DNA non è digerito abbastanza, più DNA Pol I eDNasi I può essere aggiunto alla reazione ed incubata per due ore più a 16 ° C. </li><li> Purificare sonde su filtri 0,025 mm in due bicchieri litro riempite con H 2 0 per due ore al buio. </li><li> Aggiungere fattori bloccanti alle sonde come segue: 10 mg di DNA Cot-1, 10 ug di DNA Hybloc e 100 pg di sperma di salmone per 10 pg di sonde di DNA. DNA sonde Conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Sonda Precipitazioni / Denaturazione / Pre-ricottura (ore 3-4) <ol><li> Tra 0,3 mg e 1 mg di test sul DNA viene utilizzato per coprioggetto. Sonde mescolare con 0,1 volume di 3M NaAc (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%, incubare per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C e centrifugare a 13.000 rpm a 4 ° C per 30 min. Si noti che la quantità di sonda di DNA può essere regolata a seconda della qualità del DNA nucleare e la regione di ibridazione. Metodi alternativi di etichettatura diretta può consentire l&#39;utilizzo di ridotte quantità disonda. Per il rilevamento di segnali multipli FISH DNA su una diapositiva, diverse sonde può essere precipitato insieme (tranne le sonde che non dovrebbero essere pre-cotto, come sequenze ripetute). Sonde per diversi esperimenti eseguiti contemporaneamente può anche essere precipitato insieme. Pellet dovrebbe essere leggermente colorata secondo i fluorofori utilizzati (se piccole quantità di sonde vengono precipitati, il pellet può non essere visibile). </li><li> Pellet secco e risospendere in 15 microlitri tampone di ibridazione (cfr. tabella 4) per coprioggetto con agitazione (con un Thermomixer Eppendorf) al buio a 37-45 ° C (per circa 20 min). </li><li> Sonde Denaturare per 5 minuti a 75-95 ° C. </li><li> Pre-ricottura sonde a 37 ° C per 30-60 min. Lunghezza del pre-ricottura può essere regolata a seconda della complessità e qualità delle sonde. </li><li> Applicare i coprioggetti sonde per l&#39;ibridazione durante la notte (cfr. sezione 3). </li></ol> 3. 3-Dimensionale FISH DNA - Primo Giorno (~ 3 ore) <ol><li> Cellule non aderenti sono concentrate in un piccolo volume di PBS 1x (~ 2x10 5 cellule in 5-10 microlitri 1x PBS per vetrino) e scaricati sul centro di un poli-L-lisina coprioggetto rivestiti. Cellule aderenti dovrebbero essere coltivate su vetrini per almeno 24 ore (confluenza ~ 70%) (vetrini possono essere rivestiti con gelatina 0,1%). Quadrati 18x18 a 24-24 coprioggetti mm sono poste in piastre da 6 pozzetti, e tutto il protocollo, due ml di ciascuna soluzione viene usato per pozzetto (in alternativa rotonde coprioggetto 1,5 millimetri può essere posto in piastre 12/24-well). </li><li> Fissare cellule in paraformaldeide al 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, per 10 minuti a RT (4% PFA scorte possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C). Paraformaldeide possono essere acquistati in soluzione (16%), o soluzioni di riserva del 4% può essere preparato da polvere / granuli. Paraformaldeide in polvere viene dissolto in PBS 1x a&gt; 60 ° C (pH può essere portato a 8-9 per facilitare la dissoluzione), raffreddato in ghiaccio, regolareed a pH 7-7,4, filtrata, aliquotare falchi e conservati per settimane a -20 ° C. </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS per 5 minuti in ghiaccio. Lunghezza di permeabilizzazione può essere regolata a seconda del tipo cellulare. NB: Se FISH DNA viene combinato con immunofluorescenza, l&#39;immunocolorazione deve essere eseguita in questa fase (vedi sezione 4). </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, incubare le cellule con 0,1 mg / microlitri RNasi A in PBS 1x per un ora a 37 ° C. Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetto vengono poi accuratamente rimosso con una pinza. Se si incontra una resistenza, coprioggetto deve essere allagato con PBS 1x per evitare di danneggiare le cellule. </li><li> Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,7% Triton-X-100 / HCl 0,1 M per 10 min in ghiaccio. </li><li> Dopo tre lavaggi in 1x PBS, le cellule denaturate in HCl 1,9 M per 30 minuti a RT. Alternativamente, le cellule possono essere denaturati in 50% di formammide / 2x SSC a 75-80 ° C per almeno 30 min. Notare che la lunghezza ibridazione (e temperatura) può essere ottimizzato a seconda del tipo cellulare. </li><li> Dopo tre lavaggi in ghiacciata 1x PBS, le cellule ibridare con sonde notte a 37 ° C in una camera oscura e umida. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo del 15 microlitri di sonda su un vetrino, e sigillato con mastice. </li></ol> 4. 3-dimensionale Immuno-FISH - Primo Giorno (~ 6-7 ore) <ol><li> Per combinato immunofluorescenza / DNA FISH, immuno-colorazione deve essere eseguita dopo la permeabilizzazione nello 0,4% Triton-X-100 (punto 3.3). </li><li> Incubare le cellule in soluzione di blocco per 30 minuti a RT (2,5% di sieroalbumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,1% Tween-20). La soluzione bloccante è filtrata, aliquotare Eppendorfs 1,5 ml e conservati per mesi a -20 ° C. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo primario sollevata contro la proteina o la modificazione degli istoni di interesse diluito in soluzione di bloccaggio, per un ora a RT in una camera umida. Qui vi mostriamo l&#39;esempio di un anticorpo contro fosforilati della serina-139 di H2AX (γ-H2AX, Millipore: vedi Tabella 5 per i dettagli). Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetti sono poi accuratamente rimosso con una pinza (inondato con PBS 1x se necessario). Notare che la diluizione e la lunghezza di incubazione può essere regolata a seconda della qualità del anticorpo e cellule-tipi. </li><li> Lavare le cellule in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Incubare le cellule con il fluoroforo appropriato anticorpo secondario coniugato diluito in soluzione di blocco per un ora a RT in una camera oscura e umida. Qui mostriamo un esempio di rilevamento con unsecondario di capra anti-topo (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen, vedere la Tabella 5 per i dettagli). Anticorpi secondari coniugati aptene-(biotina, digossigenina, etc) potrebbe anche essere usato. In questo caso, un ulteriore passaggio per il rilevamento appropriato (streptavidina, anti-dig, ecc) può essere eseguita prima o dopo over-notte ibridazione DNA-FISH. </li><li> Risciacquare le cellule in 0,1% di Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione al buio. </li><li> Post-fix cellule nel 2% paraformaldeide / 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Continua FISH DNA come sopra da incubazione a RNasi A (passo 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensionale DNA FISH / Immuno-FISH - Secondo giorno (circa 2 ore) <ol><li> Rimuovere con cautela cemento di gomma, vetrini alluvione con 2x SSC, rimuovere con cautela con una pinza e metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio. </li><li> Lavare le cellule in 2x SSC per 30 min a 37 ° C al buio con agitazione.</li><li> Lavare le cellule in 2x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione. </li><li> Lavare le cellule in 1x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione noti che in caso di denaturazione con formammide, lavaggi deve essere sostituito dal seguente:. 3 lavaggi a 50% formammide lavaggi / 2x SSC e 3 in 2x SSC, 5 min ciascuna, a 37 ° C. </li><li> Montare cellule in mezzo prolungare oro montaggio contenente 1,5 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) per controcolorazione di DNA totale. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo di 10-15 ml di mezzo di montaggio su un vetrino e sigillato con smalto. I vetrini sono conservati per mesi a -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopia e analisi 3D <ol><li> Le immagini 3D possono essere acquisite con sistemi microscopio diversi. Nei nostri esperimenti, sezioni ottiche separate di 0,3 micron vengono raccolti su un sistema Leica SP5 AOBS confocale (acusto-ottico Beam Splitter). Notare che la distanza tra ottical piani possono essere regolati a seconda del tipo di analisi. </li><li> Stack di immagini 3D possono essere analizzati utilizzando diversi software e strumenti. Usiamo il software J immagine per valutare le misure di distanza tra i loci di interesse e di analizzare i diversi tipi di associazione dei loci di interesse con sub-nucleare compartimenti o proteine. </li><li> Tutte le analisi statistiche sono effettuate per confrontare due (o più) diverse condizioni biologiche con coppie di valutazione (s) di importanza: confronto tra diversi tipi di cellule o fasi, il confronto tra i diversi loci di interesse. In tutti i test statistici, P-value ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) sono presi per essere significativo (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * molto significativo, p &lt;1,00 E-3 *** altamente significativo). </li></ol> Analisi statistica delle distribuzioni intero distanze tra due alleli. Abbiamo prima construct cumulativi curve di frequenza di distribuzione su tutta la gamma di distanze misurate tra i due alleles.To valutare la significatività delle differenze tra le distribuzioni empiriche di inter-alleliche distanze che utilizziamo il non parametrico due campioni di Kolmogorov-Smirnov (KS) prova 13,14. L&#39;analisi statistica di una stretta associazione (pairing cioè) di due alleli con una distanza ottimale di cut-off. Per identificare la gamma di robusti maggior parte delle differenze in termini di distanze tra due alleli o loci, si usa una serie di due code test esatto di Fisher 15 s. Vale a dire, ad ogni distanza misurata abbiamo verificare se una condizione è significativamente sovrarappresentati a brevi distanze tra i due campioni. Il minimo nella distribuzione dei valori p indica l&#39;intervallo di distanze che devono essere considerati come un cut-off per la stretta associazione (pairing cioè) dei due alleli. Successivamente il due code test esatto di Fisher è usato to valutare l&#39;importanza di accoppiamento di due alleli al identificato cut-off 15. Correzioni test multipli vengono conteggiati per il numero totale di test eseguiti Fisher 16. Analisi statistica di associazione del locus di interesse con compartimenti sub-nucleari o proteine. La due code esatto di Fisher-test viene utilizzato per analizzare il significato di associazione del locus di interesse con diversi scomparti o proteine ​​15.

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<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti 30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine ​​nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di permeabi...

Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l&#39;eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati 6-11. Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le analisi molecolari e biochimici valutando specifiche interazioni / associazioni di sequenze di DNA e / o proteine ​​all&#39;interno del nucleo. Inoltre, mentre il genoma tecniche ad alto rendimento, come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) o la cattura conformazione cromosoma accoppiata con sequenziamento profondo (4C-seq, 5C, Hi-C) forniscono dat globaleuna su popolazioni cellulari 12, immunofluorescenza / DNA tecniche FISH affinché le analisi a livello di singola cellula. Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-FISH). Il vantaggio di questo protocollo è la visualizzazione combinata di DNA e conservazione delle strutture proteiche. La nostra esperienza in questo campo ci ha consentito di migliorare e semplificare i protocolli esistenti. Anche se abbiamo usato questo protocollo per rilevare il DNA a doppio filamento rompe in linfociti sottoposti ricombinazione, questo metodo può essere applicato ad altre proteine ​​e altri tipi di cella.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pescatore </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 a C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 o Cy5 dUTP </td><td> Pescatore </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 micron filtri </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 mg / ml </td><td> Applied Genetics </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Salmone sperma </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> polvere da risospese a 10 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (Acetato di sodio, pH 5.2, soluzione tampone) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grado) </td><td> Pescatore </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidone (Mol Biol grado) </td><td> Pescatore </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato polvere </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Saline-Sodio Fosfato-EDTA) soluzione 20x </td&gt; <td> Pescatore </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Pescatore </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Pescatore </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Diapositive </td><td> Pescatore </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-pozzetti </td><td> Pescatore </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pescatore </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina soluzione </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide, granuli, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol grade </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina di siero bovino) Frazione V </td><td> Pescatore </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol grade </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrato di sodio Saline) 20x soluzione </td><td> Pescatore </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro antifade </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Miglior prova di uno strato di cemento di gomma </td><td> D&#39;arte o in ufficio di approvvigionamento negozi </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti specifici e piccole attrezzature. </td></tr></tbody></table>

immunofluorescenza combinato e fish dna 3d conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3d organizzazione nucleare

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Ibridazione fluorescente in situ con l&#39;utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l&#39;architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine ​​nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l&#39;epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l&#39;architettura 3D del nucleo, e dall&#39;altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici 1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.

DNA e immuno-FISH vengono utilizzate in laboratorio Skok di studiare le variazioni dell&#39;organizzazione nucleare associati al processo di V (D) J ricombinazione dei loci recettore per l&#39;antigene durante lo sviluppo dei linfociti B e T. Le tecniche sopra descritte ci permettono di i) misurare le distanze tra le due estremità di un locus (contrazione), ii) misurare le distanze tra alleli o loci (pairing), iii) analizzare il danno al DNA che si verificano all&#39;interno loci, iv) verificare la posizione degli allel...

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare simultaneamente le modifiche della cromatina e le sequenze di DNA utilizzando la microscopia confocale 3D, vengono generate le prime sonde di DNA specifiche. Nel frattempo, le cellule sperimentali sono a permeazione fissa e immunocolorate. Per i marcatori istonici di interesse.Le cellule vengono quindi denaturate e una fluorescenza notturna all'interno di te. L'ibridazione o pesce viene eseguita utilizzando una o più sonde di DNA. Infine, le cellule vengono lavate e montate per la fluorescenza 3D.L'analisi al microscopio delle immagini risultanti rivela la localizzazione nucleare di loci di interesse e l'associazione con specifiche modificazioni dei calcoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina la visualizzazione di proteine nucleari, inclusi calcoli con loci genomici in nuclei conservati 3D, e può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'organizzazione nucleare epigenetica della cromatina o della regolazione genica. Per questa procedura, per l'etichettatura possono essere utilizzati plasmidi posteriori o prodotti PCR.Questi devono essere preparati come descritto nel testo di accompagnamento. Si noti

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

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Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

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Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

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Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Scopri come combinare immunofluorescenza e DNA FISH per analizzare modificazioni istoniche e sequenze genomiche in nuclei intatti. Questo metodo avanzato consente la visualizzazione 3D della cromatina.

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare (Video) | JoVE Journal

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

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