Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare in tempo reale la penetrazione del farmaco e la risposta terapeutica alla somministrazione di un farmaco terapeutico. Ciò si ottiene trattando prima l'animale con il farmaco. Successivamente, la ghiandola mammaria inguinale contenente il tumore viene esposta creando un lembo cutaneo.

Quindi il topo viene trasferito allo stadio microscopico e vengono misurati la saturazione di ossigeno nel sangue e la frequenza cardiaca e viene inserita una linea di permanenza per la somministrazione di liquidi e farmaci o coloranti. Infine, vengono acquisite immagini time-lapse per analisi successive. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti nella morte cellulare o nelle interazioni con lo stroma tumorale in risposta a un farmaco attraverso la microscopia confocale a disco rotante vivo di tumori mammari di topo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale, come ad esempio il modo in cui i vari componenti dello stroma di un tumore influenzano la risposta alla terapia. Prima di iniziare, consultare il protocollo scritto per i programmi tipici per la somministrazione dei farmaci e l'imaging. Accendi uno sterilizzatore a perline calde e lascia che raggiunga almeno i 200 gradi Celsius.

Dopo aver lavato gli strumenti chirurgici con acqua e sapone, tra cui un paio di pinze con denti, un paio di pinze seghettate e due paia di forbici, utilizzare lo sterilizzatore a perline calde per sterilizzarli per almeno 30 secondi. Allora lasciateli fare. Bello. Posizionare un impregnatore da laboratorio sopra il coperchio in polistirolo che verrà utilizzato come piattaforma chirurgica.

Utilizzare del nastro adesivo da laboratorio per fissare un cono nasale con una linea al sistema di anestesia all'ammollo da laboratorio e un certo ago da 18 gauge da un pollice e mezzo attraverso il nastro nel coperchio di polistirolo su entrambi i lati del cono nasale per mantenere il cono nasale fissato in posizione. Mettere da parte la garza sterile Betadine. Due salviette all'isopropanolo al 70%, un vetrino da microscopio, una super colla e quattro pezzi di nastro da laboratorio largo mezzo pollice.

Dopo aver anestetizzato l'animale in una camera di induzione, quando respira profondamente e lentamente, trasferire il topo sulla piattaforma chirurgica, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Per evitare l'alta pressione, aprire la linea di anestesia sulla piattaforma chirurgica e quindi chiudere la linea di anestesia sulla camera di induzione. Ridurre la concentrazione di isoflurano dal 4% al 2,5%Verificare che la profondità dell'anestesia sia sufficiente per l'intervento chirurgico eseguendo un pizzicamento del piede.

Se l'animale non reagisce, utilizzare quattro pezzi di nastro adesivo da laboratorio per fissare gli arti alla piattaforma chirurgica e utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dalla superficie ventrale. Utilizzare salviette isopropanolo al 70%, seguite da Betadine applicato su una garza sterile per disinfettare la superficie ventrale dell'animale utilizzando forbici e pinze con i denti. Praticare un'incisione sottocutanea della linea mediana ventrale da circa tre millimetri sopra l'uretra fino al processo xifoideo.

Fare attenzione a non forare o tagliare il peritoneo con le forbici e le pinze seghettate. Ha staccato delicatamente la pelle dalla cavità peritoneale con la ghiandola mammaria inguinale contenente il tumore da visualizzare Ancora attaccato. Posizionare un vetrino da microscopio contro il lembo cutaneo in modo che la maggior parte del tumore si trovi in piano una volta che il topo è posizionato sul tavolino e in modo che non sia ostruito dagli arti posteriori.

Una volta che il vetrino del microscopio è stato posizionato correttamente, utilizzare la super colla per fissare il vetrino alla superficie esterna della pelle. Rimuovere il nastro da laboratorio che fissa gli arti dell'animale. Aprire la linea di anestesia sul tavolino del microscopio, quindi chiudere la linea di anestesia sulla piattaforma chirurgica.

Trasferire rapidamente l'animale al tavolino del microscopio Una volta che l'animale è stato trasferito, posizionare e fissare la linea di anestesia e il cono del naso per assicurarsi che il topo rimanga anestetizzato e si trovi in una posizione comoda. Ridurre la concentrazione di isoflurano all'1,5%Esporre il tumore in modo che sia posizionato sopra e al centro di una delle porte di imaging ricoperte di vetro sul tavolino del microscopio. Inserire la linea intraperitoneale a permanenza con il set di infusione alato collegato alla siringa da un millilitro contenente soluzione fisiologica PBS sterile o soluzione fisiologica con ioduro di propidio.

Quando viene inserita la linea intraperitoneale, iniettare nell'animale 100 microlitri di soluzione fisiologica con ioduro di propidio e continuare a iniettare 50 microlitri di soluzione fisiologica con ioduro di propidio ogni ora fino al completamento della sessione di imaging. Utilizzando gli oculari, verificare che il tumore sia posizionato correttamente e fissare delicatamente con nastro adesivo il vetrino del microscopio e la linea intraperitoneale. Il vetrino deve essere fissato in modo sufficientemente lasco da non ostruire il flusso sanguigno al tessuto.

Fissare il vetrino del microscopio aiuta a ridurre al minimo gli artefatti di imaging introdotti dalla respirazione dell'animale per acquisire immagini time-lapse. Utilizza il software open source micromanager, compila e analizza i dati grezzi utilizzando IRIS o altri software di analisi delle immagini. I filamenti di DExT coniugati in fluorescenza possono essere utilizzati come marcatore surrogato per la somministrazione di farmaci nei tessuti.

Qui è mostrato l'arrivo di fitzy coniugato con due megadalton destrano IV iniettato in un topo che esprime la proteina fluorescente blu nelle cellule di cancro al seno. Dopo l'arrivo del farmaco nel tumore, lo stravaso e la diffusione possono essere visualizzati per determinare l'emivita intravascolare e la distribuzione del farmaco. Qui, viene mostrata lo stravaso e la distribuzione di destrano IV coniugato con 10 kilodalton LOR iniettato in un topo che esprime la proteina fluorescente blu nelle cellule di cancro al seno e la proteina fluorescente verde nelle cellule mieloidi.

L'imaging può fornire informazioni sul tipo di morte cellulare che le cellule tumorali subiscono. Qui, si osservano cambiamenti nucleari strutturali indicativi di necrosi o apoptosi in un topo che esprime una proteina fluorescente verde coniugata al suo one due b. Dopo il trattamento con doxorubicina, la morte delle cellule tumorali indotta dalla chemioterapia provoca spesso un reclutamento reattivo di cellule immunitarie nei tumori.

Ecco un esempio di questa risposta stromale al trattamento acuto con doxorubicina in un topo che esprime proteine fluorescenti blu e verdi rispettivamente nel cancro al seno e nelle cellule mieloidi. Oltre a visualizzare la risposta stromale complessiva alla chemioterapia, qui possono essere visualizzate anche risposte stromali specializzate. La fagocitosi del materiale cellulare necrotico da parte di una cellula vicina viene mostrata una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in 30-60 minuti e gli animali possono essere ripresi per 12-40 ore se eseguita correttamente.