Name: Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri l'imaging in vivo della penetrazione del farmaco e della risposta terapeutica nei tumori mammari murini con microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente di analizzare le interazioni cellulari in tempo reale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Cappellani J. e J. Qiu per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del National Cancer Institute (U01 CA141451), il Consorzio Starr Cancro, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Un giorno per combattere il cancro al seno, Coalizione Manhasset donne contro il cancro al seno a ME, e un pre-dottorato dal dal Congresso Regia Programma di ricerca sul cancro al seno, Stati Uniti per ESNESN è anche il destinatario del C. Leslie rapida e William Randolph Hearst Borse di studio della Fondazione della Scuola Watson di Scienze Biologiche. HAA è stato sostenuto da fondi del Consiglio norvegese per la ricerca (160698/V40 e 151882), e del sud-est autorità sanitarie regionali (2.007.060).

<ol><li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li>
<li>Ahn, G. -O., Tseng, D., Liao, C. -H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Mac-1+%28CD11b%2FCD18%29+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li>
<li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li>
<li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li>
<li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li>
<li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li>
<li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li>
<li>Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8%2B+T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li>
<li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li>
<li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL%2F6J%5BTitle%5D)+AND+%22Mice.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716(2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEwald%2C+AJ+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2011, pdb.prot5563(2011).</li>
<li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li>
<li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li>
<li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEwald%2C+AJ+%22+Cold+Spring+Harb.+Protoc%22"> Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2011, pdb.top97(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con IACUC protocolli approvati.

Le risposte dei tumori a terapie sistemiche in vivo può essere notevolmente diverse da quelle delle cellule tumorali in vitro, come il microambiente influenza sia la risposta acuta e ricaduta 5. Uno dei maggiori ostacoli alla esplicitazione nei percorsi di chemioresistenza in vivo è la complessità delle interazioni tra cellule tumorali e il loro micro. In particolare, poiché tumori solidi hanno sviluppato un equilibrio tra cancro e cellule stromali, perturbazioni di un componente, come la morte cellulare che si verifica durante il trattamento antitumorale, può provocare effetti drammatici sulla organizzazione dei tessuti. La tecnica di imaging intravitale qui fornite permette la visualizzazione diretta del cancro cellula-stroma interazioni all&#39;interno dei tumori di topi anestetizzati dal vivo, durante il trattamento con farmaci anti-cancro. Usiamo microscopia confocale disco rotante, che ha una profondità relativa penetrazione limitata (v. 17 </sup&gt;), ma le tecniche chirurgiche ed etichettatura può essere utilizzato con altri tipi di microscopia. Filmati acquisiti da questi esperimenti possono essere utilizzati per monitorare i processi che includono cambiamenti di intensità di fluorescenza (ad esempio a causa di infiltrazioni di una popolazione etichettati o induzione della morte cellulare), la motilità cellulare, distribuzione di iniettabili (ad esempio per monitorare perdita vascolare), e co- localizzazione di segnali fluorescenti 5,12,17,20. Noi di routine topi di immagine per più di 6 ore e di imaging eseguita anche per oltre 18 ore. Ciò richiede mantenendo i topi continuamente sotto anestesia per questi periodi di tempo lunghi. Con l&#39;anestesia adeguata, oltre il 90% dei nostri animali sopravvivono 6 ore, e circa l&#39;80% sopravvive più di 18 ore. I dettagli su come eseguire a lungo termine anestesia sono stati pubblicati in precedenza 19. Nella nostra esperienza, cinque fattori sono fondamentali: evitare l&#39;ipotermia, evitare la disidratazione, mantenendo fisiologiche nel sangue i livelli di saturazione di ossigeno, ucantare gas umidificato vettore per isoflurano, e mantenere gli animali al più basso livello di anestesia in cui essi non mostrano segni di dolore. Per mantenere la temperatura corporea, teniamo topi sotto una coperta riscaldata (a 38 ° C). Per evitare la disidratazione, si iniettano piccole quantità di soluzione salina ip durante tutta la procedura di imaging intero. Per mantenere fisiologici livelli di saturazione dell&#39;ossigeno nel sangue, si parte con il 21% di ossigeno nel gas di trasporto (piuttosto che il comunemente usato 100%). Questo ci permette di aumentare i livelli di ossigeno per via inalatoria se un topo - ore in un esperimento - mostra una diminuzione della saturazione di ossigeno nel sangue. Nella nostra esperienza, aumentare i livelli di ossigeno per via inalatoria in quel momento (ad esempio, per il 30-40%), quasi sempre si stabilizzerà l&#39;animale consentendo ore di immagini aggiuntive. Il livello ottimale di anestesia è per la maggior parte dei mouse conseguiti con 1-1,5% isoflurano e si traduce in tassi di 60-65/min respiro e pulsazioni di 400-450/min. Nei nostri esperimenti di imaging, si utilizzano principalmente modello di topo transgenicos (MMTV-PyMT e C3 [1]-Tag) in cui i tumori sono multifocali, consentendo l&#39;imaging di lesioni multiple in diverse fasi della progressione tumorale in parallelo alle posizioni x, y multipli durante una sessione di imaging. Questo diminuisce preoccupazioni riguardanti mouse-a-mouse variazione rispetto a esperimenti volti a identificare risposte terapeutiche stadio-dipendenti, e riduce il numero di animali necessari per l&#39;imaging. Il MMTV-PyMT modello (e di altri modelli di cancro spontanee) passare attraverso stadi progressivi istopatologici che possono essere rilevate durante l&#39;esposizione intravitale, anche se la messa in scena patologica delle lesioni tumorali che si possono fare durante l&#39;esposizione intravitale è diverso e meno dettagliata, di quella di sezioni istologiche 5,17. Al contrario, i modelli di trapianto tendono a riflettere i tumori in fase avanzata meglio, come le cellule tumorali in genere sono isolati da tumori avanzati. Tali modelli sono quindi più suscettibili allo studio del tumore-stromainterazioni di tumori in fase avanzata che differenze in queste interazioni tra diverse fasi. Mostriamo alcuni esempi di come immagine cambia nucleari strutturali che si verificano dopo la morte cellulare indotta dalla terapia. In assenza di un trattamento anti-cancro, questa strategia etichettatura può invece essere utilizzata per la divisione cellulare immagine in situ, chiarire, ad esempio, come la proliferazione cellulare e dormienza è influenzata dal microambiente. In futuro, marcatura fluorescente di componenti mitocondriali possono consentire di immagine cambia mitocondriali che si verificano durante la morte cellulare per apoptosi. In questo protocollo, abbiamo anche mostrato esempi di come immagine del cancro delle cellule immuni interazioni delle cellule dopo la terapia, ma altri componenti microambientali possono anche essere visualizzati e creata l&#39;immagine. Esistenti linee giornalista transgeniche per i componenti stromali includono quelli per i fibroblasti (ad es., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) o cellule del sistema vascolare (es. Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravitale imaging consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni e processi che avvengono in vivo somministrazione di chemioterapia seguente. Con la tecnologia attualmente disponibile, abbiamo fatto importanti progressi nella comprensione di come cellule mieloidi influenzare la risposta terapeutica, tuttavia, perché il microambiente tumorale è così complesso, grandi progressi sono ancora necessari per iniziare a scavare meccanicamente nei processi sottostanti ambiente-mediata resistenza ai farmaci. Uno dei progressi più importanti ancora richiesti è l&#39;identificazione di migliori marcatori per specifiche popolazioni cellulari. L&#39;importanza di migliori marcatori è ben illustrato con due dei componenti più importanti cellule stromali del microambiente tumorale mammario, fibroblasti e cellule immunitarie. α-muscolo liscio actina (αSMA) viene spesso utilizzato per identificarefibroblasti, ma la proteina è espressa da cellule muscolari lisce vascolari e cellule mioepiteliali 24. Così, anche se αSMA-GFP topi reporter esiste, determinare il tipo specifico di essere cellula seguente durante un esperimento di imaging intravitale è impegnativo. Analogamente, un singolo marcatore fluorescente come EGFP espresso sotto il c-fms promotore più spesso identificare sottopopolazioni di cellule immunitarie 12,17. Così, anche se uno vorrebbe idealmente utilizzare un singolo marcatore per identificare un tipo specifico cellulare la complessità della biologia sottostante rappresenta una sfida importante nell&#39;utilizzo questo approccio. Una parziale soluzione a questo problema è di utilizzare etichette iniettabili per differenziare ulteriormente sottopopolazioni di cellule che esprimono il reporter fluorescente stessa. Per esempio, destrani fluorescenti sono ripreso da macrofagi e può essere usato per etichettare le sottopopolazioni di macrofagi che sono etichettati da c-fms-EGFP e Fsp1-EGFP topi reporter transgenici <sup&gt; 17. Anticorpi coniugati a sonde fluorescenti sono stati utilizzati per identificare le sottopopolazioni specifiche (ad esempio il Gr1-positivo popolazione di cellule mieloidi etichettati da c-fms-EGFP giornalista 17). A differenza di curve di risposta del tumore generati dal calibro di misura, che forniscono poche informazioni sui meccanismi su come e perché i tumori rispondono alla terapia somministrata, o una serie istologico derivati ​​da tessuti raccolte in diversi momenti che richiedono grandi coorti di animali, la nostra tecnica fornisce diretta, informazioni quantificabili sulla dinamica della morte cellulare e le interazioni di cellule stromali con cellule tumorali in coorti piccole. Così, il vantaggio di utilizzare la procedura riportata qui è che fornisce informazioni dinamiche sulle risposte farmacologiche nel contesto di un microambiente tumorale intatta in tempo reale. Tali informazioni possono portare a intuizioni importanti nei processi di fondo che guidano le risposte terapeutiche 5 &lt;/ Sup&gt;.

Tumori solidi sono costituiti da due compartimenti principali: le cellule tumorali e le componenti stromali (sia cellulare e non cellulare) che aiutano a mantenere un ambiente adatto per la crescita tumorale 1. Questi componenti stromali giocano un ruolo critico nello sviluppo, progressione e metastasi di molti tipi di tumori, compresi quelli del seno 2-5. L&#39;ambiente stromale influenza anche le risposte terapeutiche 2,4,5. Così, determinando come le cellule tumorali rispondono alle terapie convenzionali e romanzo nel contesto del microambiente intatto è importante per la nostra comprensione della biologia del cancro e migliorare attuali strategie terapeutiche. Inoltre, definendo le modalità di cellule di cancro-stroma interazioni cambiano in seguito alla somministrazione della terapia è fondamentale per la comprensione della biologia di recidiva tumorale. Organotipiche co-coltura di sistemi sono stati utili per lo studio delle interazioni tumore-stroma <sup&gt; 6, ma è evidente che i metodi attualmente disponibili non correttamente ricapitolare il microambiente intatta tumorale in vitro, in particolare per quanto riguarda la funzione vascolare e reclutamento di cellule immunitarie. Infatti, le risposte delle cellule tumorali a terapie che vengono osservate in vitro sono spesso significativamente differenti da quelle osservate in vivo, in cui il microambiente è intatto 5. Così, in modelli in vivo per lo studio del tumore-stroma interazioni e il loro impatto sulla risposta terapeutica può rispecchiare meglio i meccanismi clinicamente rilevanti 7. Il mezzo principale di studiare le risposte a terapia antitumorale in vivo sono passati attraverso le misurazioni di dimensione del tumore e la valutazione istologica dei tessuti provenienti da animali trattati o pazienti. Tuttavia, i progressi nella microscopia a fluorescenza e giornalisti nel corso degli ultimi due decenni hanno permesso la visualizzazione di processi inter-e intracellularead alta risoluzione in un animale vivo, anestetizzati (intravitale imaging) 8. Queste tecnologie microscopia intravitale hanno dimostrato di essere particolarmente utile per spazialmente e temporalmente la dissezione nella dinamica in vivo del tumore-stroma interazioni con risoluzione cellulare e sub-cellulare 8,9. Processi che sono stati svelati da imaging intravitale includono antitumorale citotossicità delle cellule T 10,11, interazioni tra cellule T e cellule mieloidi 12, la dinamica dei cambiamenti nella composizione collagene e organizzazione dopo il trattamento terapeutico 13, macrofagi-dipendente intravasation cellula tumorale e metastasi 14, e la permeabilità vascolare 15. Ci sono tre requisiti principali per l&#39;imaging intravitale. Questi includono la preparazione adeguata e l&#39;esposizione di tessuti per l&#39;imaging, l&#39;etichettatura fluorescente delle componenti del tessuto di interesse, e di una coppia di microscopia-camera sistema in grado di acquisire immagini 16. Le strategie più comuni utilizzati per rispondere a queste esigenze sono: 1) preparati eterotopiche (ad esempio, l&#39;inoculazione del orbitale orecchio o con gli occhi), permanente Imaging per Windows o preparati esteriorizzato (ad esempio, lembo di pelle dorsale), 2) transgenici fluorescenti e giornalisti.. iniettabili fluorescenti di etichettare componenti del tessuto e 3) sistemi di microscopia confocale multiphoton o in coppia con tubi fotomoltiplicatori o charge-coupled device (CCD), rispettivamente 9. Usiamo un modello preparato chirurgicamente lembo cutaneo per esporre la ghiandola mammaria inguinale per l&#39;imaging in animali anestetizzati che esprimono transgeni codificanti reporter fluorescenti. Immagini sono ottenute in un periodo di 12 a 40 ore utilizzando un CCD intensificata (ICCD) fotocamera accoppiato con quattro laser filatura sistema microscopio confocale disco 17. Imaging in questo modo ci ha permesso di studiare i processi, come nella distribuzione di farmaci in vivo, la fase-dipendente chrisposte emotherapeutic, il tipo di chemioterapia morte cellulare, e il comportamento delle cellule mieloidi 5. Forniamo un protocollo per l&#39;imaging intravitale delle risposte delle cellule tumorali di terapia antitumorale e tumore-stroma interazioni in modelli murini di cancro al seno. Questo protocollo può essere utilizzato per monitorare i comportamenti e la morte di entrambe le cellule tumorali e componenti stromali con una vasta gamma di etichette fluorescenti transgenici e iniettabili sia in modelli transgenici e il trapianto per periodi fino a 40 ore in una singola sessione di imaging.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT topi </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1) Tag-topi </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP topi </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP topi </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Destrano, fluoresceina coniugato </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Ricostituire in dH 2 O (4 mg / ml, conservare a -20 ° C), diluire a 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD destrano, Alexa Fluor 647-coniugato </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22.914 </td><td> Ricostituire in dH 2 O (4 mg / ml, conservare a -20 ° C), diluire a 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicina cloridrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Ricostituire in dH 2 O e conservare a 4 ° C; diluire in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurano) </td><td> Butler Animal Health di alimentazione </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidio ioduro </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml, diluito 1:15 in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Azoto </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ossigeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;ago smussatura regolare </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Software open-source </td></tr><tr><td> Tampone imbevuto di alcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% di alcol isopropilico tamponi </td></tr><tr><td> Anestesia sistema </td><td> Imaging Products molecolari, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm, disinfettare con il 70% salviette isopropanolo </td></tr><tr><td> Rezza spugne garza (sterile) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro microscopio diapositive </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Pre-pulite, se non pre-lavaggio, disinfettare con il 70% salviette isopropanolo </td></tr><tr><td> Temprati forbici sottili </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14090-11 </td><td> 2 coppie, in acciaio inossidabile, forte affilati come punte, punta diritta, 26 tagliente mm, 11 cm di lunghezza </td></tr><tr><td> Coperta riscaldata </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot tallone sterilizzatore </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18000-45 </td><td> Attivare circa 30 minuti prima dell&#39;uso; sterilizzare strumenti a&gt; 200 ° C per 30 sec </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Prodotti di Elmer </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio nastro (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio nastro (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coperchio diuna spedizione polistirolo raffreddamento </td><td></td><td></td><td> Questo sarà utilizzato come piattaforma chirurgica </td></tr><tr><td> Micro dissettore </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 denti, una leggera curva, 0,8 mm di larghezza, punta 4 &quot;lunghezza </td></tr><tr><td> Micro dissettore </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentata, leggera curva, 0.8 larghezza punta mm 4 &quot;lunghezza </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td></td><td></td><td> Spinning-disco confocale, XYZ fase Piezo, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Microscopio fase di inserimento </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td></td><td> Personalizzato fabbricato, con due porte di imaging circolari </td></tr><tr><td> MouseOx ossimetro, software e sensori </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Versi Super-Dry lab inzuppatori </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Tagliare in quarti per il rivestimento piattaforma chirurgica </td></tr><tr><td> Nebulizzatore </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Utilizzato per umidificare i gas, previene le irritazioni dei tessuti polmonari </td></tr><tr><td> Slip-siringa monouso tubercolina (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo alato set d&#39;infusione </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> X 23G ¾ &quot;ultra sottile ago, 12&quot; tubo </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

vivo imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Il microambiente tumorale gioca un ruolo fondamentale nella iniziazione del tumore, la progressione, metastasi, e la risposta alle terapie anti-tumore. Tridimensionali di co-coltura sistemi sono spesso utilizzati per spiegare le interazioni tumore-stroma, compreso il loro ruolo nella risposta ai farmaci. Tuttavia, molte delle interazioni che avvengono in vivo nel microambiente intatto non può essere completamente replicata in queste impostazioni in vitro. Pertanto, la visualizzazione diretta di questi processi in tempo reale, è diventato uno strumento importante per capire le risposte alle terapie tumorali e individuare le interazioni tra cellule tumorali e lo stroma che possono influenzare queste risposte. Qui forniamo un metodo per utilizzare la microscopia confocale filatura disco di vivo, topi anestetizzati osservare direttamente la distribuzione di droghe, le risposte delle cellule tumorali e le variazioni tumore-stroma interazioni in seguito alla somministrazione di terapia sistemica in modelli di cancro al seno. Si descrivono le procedure per labeling componenti tumorali diverse, il trattamento degli animali per l&#39;osservazione di risposte terapeutiche, e la procedura chirurgica per l&#39;esposizione di tessuti tumorali per immagini fino a 40 ore. I risultati ottenuti da questo protocollo sono filmati time-lapse, in cui i processi come l&#39;infiltrazione di droga, morte delle cellule tumorali e la migrazione delle cellule stromali possono essere valutati utilizzando software di analisi delle immagini.

Si descrive un metodo per l&#39;imaging di risposta anti-cancro<em&gt; In vivo</em&gt; E alla risoluzione di singola cellula.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare in tempo reale la penetrazione del farmaco e la risposta terapeutica alla somministrazione di un farmaco terapeutico. Ciò si ottiene trattando prima l'animale con il farmaco. Successivamente, la ghiandola mammaria inguinale contenente il tumore viene esposta creando un lembo cutaneo.Quindi il topo viene trasferito allo stadio microscopico e vengono misurati la saturazione di ossigeno nel sangue e la frequenza cardiaca e viene inserita una linea di permanenza per la somministrazione di liquidi e farmaci o coloranti. Infine, vengono acquisite immagini time-lapse per analisi successive. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti nella morte cellulare o nelle interazioni con lo stroma tumorale in risposta a un farmaco attraverso la microscopia confocale a disco rotante vivo di tumori mammari di topo.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale, come ad esempio il modo in cui i vari componenti dello stroma di un tumore influenzano la risposta alla terapia. Prima di iniziare, consultare il protocollo scritto per i programmi tipici per la somministrazione dei farmaci e l'imaging. Accendi uno sterilizzatore a perline calde e lascia che raggiunga almeno i 200 gradi Celsius.Dopo aver lavato gli strumenti chirurgici con acqua e sapone, tra cui un paio di pinze con denti, un paio di pinze seghettate e due paia di forbici, utilizzare lo sterilizzatore a perline calde per sterilizzarli per almeno 30 secondi. Allora lasciateli fare. Bello. Posizionare un impregnatore da laboratorio sopra il coperchio in polistirolo che verrà utilizzato come piattaforma chirurgica.Utilizzare del nastro adesivo da laboratorio per fissare un cono nasale con una linea al sistema di anestesia all'ammollo da laboratorio e un certo ago da 18 gauge da un pollice e mezzo attraverso il nastro nel coperchio di polistirolo su entrambi i lati del cono nasale per mantenere il cono nasale fissato in posizione. Mettere da parte la garza sterile Betadine. Due salviette all'isopropanolo al 70%, un vetrino da microscopio, una super colla e quattro pezzi di nastro da laboratorio largo mezzo pollice.Dopo aver anestetizzato l'animale in una camera di induzione, quando respira profondamente e lentamente, trasferire il topo sulla piattaforma chirurgica, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Per evitare l'alta pressione, aprire la linea di anestesia sulla piattaforma chirurgica e quindi chiudere la linea di anestesia sulla camera di induzione. Ridurre la concentrazione di isoflurano dal 4% al 2,5%Verificare che la profondità dell'anestesia sia sufficiente per l'intervento chirurgico eseguendo un pizzicamento del piede.Se l'animale non reagisce, utilizzare quattro pezzi di nastro adesivo da laboratorio per fissare gli arti alla piattaforma chirurgica e utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dalla superficie ventrale. Utilizzare salviette isopropanolo al 70%, seguite da Betadine applicato su una garza sterile per disinfettare la superficie ventrale dell'animale utilizzando forbici e pinze con i denti. Praticare un'incisione sottocutanea della linea mediana ventrale da circa tre millimetri sopra l'uretra fino al processo xifoideo.Fare attenzione a non forare o tagliare il peritoneo con le forbici e le pinze seghettate. Ha staccato delicatamente la pelle dalla cavità peritoneale con la ghiandola mammaria inguinale contenente il tumore da visualizzare Ancora attaccato. Posizionare un vetrino da microscopio contro il lembo cutaneo in modo che la maggior parte del tumore si trovi in piano una volta che il topo è posizionato sul tavolino e in modo che non sia ostruito dagli arti posteriori.Una volta che il vetrino del microscopio è stato posizionato correttamente, utilizzare la super colla per fissare il vetrino alla superficie esterna della pelle. Rimuovere il nastro da laboratorio che fissa gli arti dell'animale. Aprire la linea di anestesia sul tavolino del microscopio, quindi chiudere la linea di anestesia sulla piattaforma chirurgica.Trasferire rapidamente l'animale al tavolino del microscopio Una volta che l'animale è stato trasferito, posizionare e fissare la linea di anestesia e il cono del naso per assicurarsi che il topo rimanga anestetizzato e si trovi in una posizione comoda. Ridurre la concentrazione di isoflurano all'1,5%Esporre il tumore in modo che sia posizionato sopra e al centro di una delle porte di imaging ricoperte di vetro sul tavolino del microscopio. Inserire la linea intraperitoneale a permanenza con il set di infusione alato collegato alla siringa da un millilitro contenente soluzione fisiologica PBS sterile o soluzione fisiologica con ioduro di propidio.Quando viene inserita la linea intraperitoneale, iniettare nell'animale 100 microlitri di soluzione fisiologica con ioduro di propidio e continuare a iniettare 50 microlitri di soluzione fisiologica con ioduro di propidio ogni ora fino al completamento della sessione di imaging. Utilizzando gli oculari, verificare che il tumore sia posizionato correttamente e fissare delicatamente con nastro adesivo il vetrino del microscopio e la linea intraperitoneale. Il vetrino deve essere fissato in modo sufficientemente lasco da non ostruire il flusso sanguigno al tessuto.Fissare il vetrino del microscopio aiuta a ridurre al minimo gli artefatti di imaging introdotti dalla respirazione dell'animale per acquisire immagini time-lapse. Utilizza il software open source micromanager, compila e analizza i dati grezzi utilizzando IRIS o altri software di analisi delle immagini. I filamenti di DExT coniugati in fluorescenza possono essere utilizzati come marcatore surrogato per la somministrazione di farmaci nei tessuti.Qui è mostrato l'arrivo di fitzy coniugato con due megadalton destrano IV iniettato in un topo che esprime la proteina fluorescente blu nelle cellule di cancro al seno. Dopo l'arrivo del farmaco nel tumore, lo stravaso e la diffusione possono essere visualizzati per determinare l'emivita intravascolare e la distribuzione del farmaco. Qui, viene mostrata lo stravaso e la distribuzione di destrano IV coniugato con 10 kilodalton LOR iniettato in un topo che esprime la proteina fluorescente blu nelle cellule di cancro al seno e la proteina fluorescente verde nelle cellule mieloidi.L'imaging può fornire informazioni sul tipo di morte cellulare che le cellule tumorali subiscono. Qui, si osservano cambiamenti nucleari strutturali indicativi di necrosi o apoptosi in un topo che esprime una proteina fluorescente verde coniugata al suo one due b. Dopo il trattamento con doxorubicina, la morte delle cellule tumorali indotta dalla chemioterapia provoca spesso un reclutamento reattivo di cellule immunitarie nei tumori.Ecco un esempio di questa risposta stromale al trattamento acuto con doxorubicina in un topo che esprime proteine fluorescenti blu e verdi rispettivamente nel cancro al seno e nelle cellule mieloidi. Oltre a visualizzare la risposta stromale complessiva alla chemioterapia, qui possono essere visualizzate anche risposte stromali specializzate. La fagocitosi del materiale cellulare necrotico da parte di una cellula vicina viene mostrata una volta padroneggiata.Questa tecnica può essere eseguita in 30-60 minuti e gli animali possono essere ripresi per 12-40 ore se eseguita correttamente.

live-imaging-drug-responses-tumor-microenvironment-mouse-models

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Ortotopico modelli animali di cancro ovarico meglio replicare la malattia umana e, pertanto, migliorare la nostra comprensione della progressione del cancro e la risposta del tumore alla terapia. Un modello di topo riceve una iniezione intrabursal della luciferasi che esprimono le cellule tumorali ovariche. Il trattamento è somministrato tramite sonda gastrica. La crescita tumorale è controllato...

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Un modello murino sperimentale di metastasi ossee è stata fondata dopo la consegna intracardiaca di cellule tumorali che esprimono luciferasi mammarie. Sviluppo del tumore e ha portato lesione osteolitica sono stati monitorati longitudinalmente con bioluminescenza e micro-TC.

Monitoraggio metastasi tumorali e lesioni osteolitiche con bioluminescenza e Micro CT Imaging

L'imaging bioluminescenza di ipossia-inducibile fattore 1α attività è applicata a monitorare lo sviluppo del tumore ipossia cerebrale in un modello di cancro al seno del mouse metastasi al cervello.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D per live-cell imaging in tempo reale delle interazioni tra cellule tumorali del seno e altre cellule nel loro microambiente che hanno un impatto progressione verso un fenotipo invasivo. Questi modelli possono servire come schermi preclinici di farmaci per colpire paracrino indotte proteolitici, percorsi chemochine / citochine e chinasi implicati nella invasività.

Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna

Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Istituto di Scienze Biologiche, Università di Brasilia, 2Dipartimento di Processi Psicologici di Base, Istituto di Psicologia, Università di BrasiliaQuesto video mostra la procedura per monitorare la progressione del tumore in vivo...

Imaging bioluminescente della progressione del tumore al seno in un modello murino femmina

Un modello di tumore primario del cancro al seno ortotopica e la rimozione chirurgica del tumore primario di estendere la vita del mouse per generare metastasi spontanee sono descritti. La crescita del tumore e la progressione sono monitorati e quantificati mediante imaging di fluorescenza luciferasi.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

Questo lavoro preconfigura un protocollo avanzato per valutare con precisione il carico del tumore rilevando segnali di proteina fluorescente e bioluminescenza verdi, nonché l'integrazione della tecnica di rilevamento molecolare quantitativo.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l'espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.

Monitoraggio della crescita del cancro al seno e della formazione di colonie metastatiche nei topi utilizzando la bioluminescenza

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Qui, descriviamo il protocollo per la somministrazione in vivo di nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro che trasportano oligomeri di RNA al carcinoma mammario metastatico in modelli animali, fornendo un approccio clinicamente valido per il silenziamento terapeutico di acidi nucleici oncogenici.

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Scopri l'imaging in vivo della penetrazione del farmaco e della risposta terapeutica nei tumori mammari murini con microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente di analizzare le interazioni cellulari in tempo reale.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Esplora altri video