Criosezionamento Comunità di lievito per l'esame di pattern di fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre sezioni trasversali di comunità di lievito per esaminare la distribuzione spaziale di diverse popolazioni di cellule fluorescenti all'interno di una comunità. Ciò si ottiene prima congelando la comunità e poi fissandola utilizzando il metanolo per preservare la distribuzione spaziale delle cellule nella comunità. Come seconda fase, il metanolo viene evaporato per consentire la penetrazione del composto OCT incorporante.

La comunità incorporata viene quindi congelata in preparazione per la criosezione. Successivamente, una sezione criome. La comunità e le sezioni trasversali possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza Si ottengono risultati che mostrano la distribuzione spaziale delle popolazioni cellulari fluorescenti all'interno di una comunità.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sezionamento ottico, è che rivela la distribuzione spaziale delle popolazioni all'interno di queste comunità. Per iniziare questa procedura, far crescere le comunità di lievito su un filtro a membrana. Questo protocollo corrisponde a una comunità tipica di meno di due volte 10 alle otto celle su un filtro a membrana di sei millimetri di diametro successivo in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.

Per preservare un maggior grado di fluorescenza, utilizzare un pezzo di carta da filtro watman 5 4 1 per coprire il fondo di un centimetro di diametro. Bene, questa carta da filtro viene utilizzata come vettore per trasferire la comunità Nelle fasi successive, aggiungi un millilitro di meno 20 gradi Celsius, metanolo al 100% al pozzo e lascia il pozzo a meno 20 gradi Celsius affinché la temperatura si equilibri. Ora, congela la comunità di lievito usando una pinzetta per immergere il filtro a membrana con la comunità in azoto liquido per almeno 15 secondi.

Quindi, trasferisci la comunità congelata nel pozzo con meno 20 gradi Celsius. Il metanolo nel congelatore assicura che la comunità sia mantenuta orizzontale. Quando lo si immerge nel metanolo, attendere 20 minuti, il filtro a membrana inizierà a disintegrarsi nel metanolo.

Dopo 20 minuti, trasferire la comunità utilizzando la carta da filtro watman dal pozzetto di metanolo a una capsula di Petri fredda mantenuta a meno 20 gradi Celsius. Durante il trasferimento, mantenere la comunità sopra il filtro Watman del vettore. Prelevare le gocce extra di metanolo usando un altro pezzo di carta watman spessa prima di metterlo nella capsula di Petri fredda.

Ciò garantirà che il tempo di evaporazione del metanolo sia costante da un campione all'altro. Attendi dalle quattro alle sei ore affinché il metanolo evapori. Terminare l'evaporazione al momento giusto è fondamentale per il successo di questa procedura.

Per evitare di asciugare eccessivamente il campione, controllare periodicamente lo stato della comunità di lievito durante l'evaporazione, mentre il metanolo sta evaporando. Crea un contenitore rettangolare cubico di alluminio abbastanza grande da far sì che il campione abbia margini di almeno due millimetri da ciascun lato. Aggiungere una goccia di OCT sul fondo di questo contenitore per assicurarsi che il campione sia circondato da OCT da tutti i lati.

Al termine dell'evaporazione, estrarre il campione dal congelatore a meno 20 gradi Celsius. Tagliare le parti della carta da filtro non coperte dalla comunità di lievito. È importante eseguire rapidamente questo passaggio.

Per evitare di asciugare eccessivamente il campione. Posizionare la comunità sulla superficie inferiore del contenitore di alluminio e coprire immediatamente il campione con OCT a tre o quattro millimetri sopra l'altezza della comunità. Attendi 10 minuti.

Infine, posizionare il campione incorporato nell'OCT su una piastra metallica su ghiaccio secco per congelare le comunità congelate a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius. In preparazione per il sezionamento delle comunità congelate, impostare la temperatura della camera di criosezione a meno 25 gradi Celsius. Lasciare i campioni nella camera fino a quando la sua temperatura raggiunge la temperatura della camera.

Quindi rimuovere la pellicola dal campione e tagliare l'OCT in eccesso. Applicare una goccia di OCT su una montatura criogenica e montare il campione sulla montatura criogenica. Stendere uniformemente l'OCT sul lato del campione con carta da filtro watman esposta in modo che lo spessore dell'OCT sia di due o tre millimetri.

Garantire un margine OCT di due o tre millimetri su tutti i lati del campione aiuta a preservare l'integrità delle sezioni. Lasciare congelare l'OCT all'interno della camera del criostato prima di sezionarlo. Utilizzare i lati del blocco campione OCT per allineare il campione rispetto alla pala.

Se il campione non è allineato rispetto alla lama, il sezionamento inizierà da un angolo o da un lato del campione. Regolare il supporto per assicurarsi che la lama tagli una faccia perfettamente verticale del blocco campione. Le sezioni tipiche per le comunità di lievito hanno uno spessore di circa 14 micrometri.

Dopo aver tagliato una sezione, utilizzare un vetrino da microscopio tenuto a temperatura ambiente per raccogliere la sezione. Spostando lentamente il vetrino sulla sezione tagliata, la sezione si scioglierà e si trasferirà al microscopio. È possibile trasferire fino a 18 sezioni su un unico carrello.

Conservare i vetrini a basse temperature, preferibilmente meno 20 gradi Celsius prima dell'imaging. La perdita di segnale è minima se mantenuta per una settimana a quattro gradi Celsius per il massimo segnale fluorescente. L'imaging deve essere eseguito immediatamente dopo il sezionamento.

Qui sono mostrate immagini rappresentative a fluorescenza di sezioni trasversali verticali di comunità di lieviti coltivate in condizioni identiche. La comunità è costituita da due ceppi fototropici di visier marcati con le proteine fluorescenti. M ciliegio visualizzato come rosso e Y-E-G-F-P visualizzato come verde competizione per le risorse condivise, compresi i porti spaziali ai modelli colonnari come visualizzati nelle loro sezioni trasversali verticali.

Le risoluzioni fino a una singola cella possono essere risolte in sezioni trasversali. Questa figura confronta le sezioni trasversali ottenute con il fissaggio del metanolo mostrato nel pannello inferiore e senza il fissaggio del metanolo mostrato nel pannello superiore. Il segnale fluorescente viene preservato nelle sezioni della comunità senza fissaggio, ma l'integrità della comunità è compromessa.

Di conseguenza, alcune celle galleggiano attorno al bordo della sezione e la resa complessiva è inferiore rispetto alle comunità fisse. La fissazione del metanolo tiene insieme le cellule della comunità, ma provoca un restringimento come osservato nella diminuzione dell'altezza della comunità. Questa figura mostra sezioni d'urto verticali rappresentative in campo chiaro e fluorescenza di una comunità di lievito costituita da due ceppi Protopic di visier teed con proteine fluorescenti DS RED e YFP.

Le cellule sopra la comunità formano una corona che appare distinta dalle cellule madri, caratterizzata da una maggiore dispersione in campo chiaro e da una fluorescenza più luminosa. Questi modelli sono coerenti con i modelli di differenziazione riportati nelle colonie di lievito. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la criosezione per esaminare i modelli spaziali di fluorescenza all'interno delle comunità di lievito.