Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti Plasmodium berghei ANKA topi infettati

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti infiammatori aderenti dai vasi sanguigni cerebrali di topi infetti da plasmodium burge eye anca per indurre la malaria cerebrale sperimentale. I topi sono infettati con plasmodium berge eye anca parassitato globuli rossi mediante iniezione. Dopo che i topi iniziano a mostrare segni di malattia, le cellule circolanti dei topi infetti da malaria vengono rimosse mediante perfusione intraorale.

Il cervello viene quindi raccolto e il tessuto viene digerito con enzimi per consentire l'isolamento dei leucociti infiammatori. La citometria a flusso multicolore viene quindi eseguita per l'immunofenotipo. L'analisi dei leucociti sequestrati al cervello dei dati risultanti rivela la percentuale e il numero assoluto di leucociti che migrano verso il cervello dei topi infetti da malaria.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi della malaria, come ad esempio quale tipo di cellule infiammatorie migrano verso il sito di sequestro del parassita nel cervello di animali infetti in diverse condizioni sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Le fasi di perfusione sono difficili da imparare in quanto richiedono velocità e attenzione per non danneggiare i vasi sanguigni significativi. A dimostrare alcune parti di questa procedura saranno Leanna Mcic, un tecnico animale, la signora Victoria, Rick, uno studente di dottorato, e la dottoressa Lisa Aez, un postdoc del mio laboratorio.

Inizia questo protocollo infettando i topi con p berge eye anca defrost un'aliquota crioconservata di P berge eye anca ha parassitato i globuli rossi o pbcs lasciandolo raggiungere la temperatura ambiente. Rimuovi un topo donatore di 8-12 settimane dalla sua gabbia e posizionalo su una postazione di lavoro. Afferra la collottola tra l'indice e il pollice.

Capovolgere il mouse e iniettare da 100 a 200 microlitri di plasmodium berge eye nella cavità peritoneale. Di routine a due topi donatori vengono iniettati pbcs. Dopo l'iniezione, metti i topi nella loro gabbia quattro o cinque giorni dopo l'infezione.

Rimuovi un topo donatore dalla sua gabbia e posizionalo su una postazione di lavoro. Posizionare una goccia di sangue dalla vena della coda del topo vicino all'estremità di un vetrino da microscopio smerigliato. Posiziona un secondo vetrino con un angolo di 45 gradi e rimettilo nella goccia di sangue.

Una volta che il sangue si diffonde lungo il bordo, spingere il vetrino del divaricatore in modo uniforme sul vetrino del microscopio per fare lo striscio di sangue. Lasciare asciugare lo striscio all'aria per fissare gli strisci di sangue. Immergere i vetrini in metanolo al 100% per 30 secondi.

Quindi colorare i vetrini in GIM ZA appena preparato per 10 minuti dopo la colorazione con gim za, sciacquare il vetrino con acqua corrente per 30 secondi. Lasciare asciugare il vetrino all'aria, quindi esaminarlo al microscopio utilizzando la lente ad immersione in olio 100x. Enumerare il PRBC entro un migliaio di eritrociti e calcolare la percentuale para se il topo donatore ha raggiunto i livelli richiesti dal 2,5 al 5%Parsit Raccogliere il sangue dal topo donatore mediante puntura cardiaca in anestesia o sanguinamento retroorbitale utilizzando un tubo capillare microematocrito eparinizzato.

Sciogliere il sangue nel mezzo RPMI a una concentrazione finale di una volta 10 per i sei PRBC per 0,2 millilitri per topo. Si consideri che un ematocrito normale di topo è circa sei volte 10 al nono dei globuli rossi per millilitro. Infatti, i topi sperimentali C 57 neri di età compresa tra 8 e 12 settimane iniettando una volta 10 al sesto PRBC in 0,2 millilitri intraperitoneale come prima.

Per monitorare i livelli di para dei topi infetti, preparare uno striscio di sangue come prima. La para deve essere determinata ogni due o tre giorni a partire dal secondo o terzo giorno dopo l'infezione dal quinto giorno. Dopo l'infezione in poi.

I topi vengono monitorati quotidianamente per segni di malaria grave una volta che i livelli di para sono superiori al 5% e i topi mostrano sintomi neurologici intorno al sesto giorno dopo l'infezione. I topi infetti vengono soppressi per inalazione di CO2 e immediatamente perfusi con PBS come descritto nel documento di accompagnamento. L'aspetto più difficile di questa procedura è la perfusione intracardiaca.

Di seguito sono riportati una serie di suggerimenti per la risoluzione dei problemi: con il mouse bloccato su una tavola di dissezione in polistirolo. All'interno di un vassoio di dissezione. Pulisci il lato ventrale con etanolo al 70%, quindi usa forbici e pinze grandi per aprire la pelle lungo la linea mediana per esporre la cavità toracica, piegare e appuntare la pelle ai lati.

Tenere lo sterno con una pinza fine e tagliare il diaframma e lungo entrambi i lati dello sterno, recidendo le costole. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni di grandi dimensioni. Appunta la gabbia toracica vicino allo sterno in modo lasco vicino alla testa.

Tenere i ventricoli con una pinza sottile e incidere con cura l'atrio destro con le forbici sottili. Inserire l'ago da 23 gauge collegato al sistema di perfusione gravitazionale nel ventricolo sinistro verso l'aorta ascendente. Mentre il PBS è in esecuzione, inserire solo 0,5 centimetri della punta dell'ago per perfondere il mouse per cinque minuti o fino a quando l'effluente non è limpido.

Dopo la perfusione interna, sezionare il cervello e metterlo in una provetta da centrifuga da 10 millilitri contenente RPMI. Medio. Posizionare il cervello appena raccolto sopra un colino di cellule in acciaio inossidabile da 40 a 60 mesh in una capsula di Petri contenente da tre a cinque millilitri di terreno di coltura tissutale RPMI. Taglia il tessuto cerebrale in piccoli pezzi.

Quindi, utilizzando uno stantuffo di cristallo, spingere piccoli pezzi di tessuto cerebrale attraverso il filtro cellulare. Trasferire l'omogeneizzato cerebrale in una provetta da 10 millilitri e centrifugarlo a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e sciogliere il pellet in tre millilitri di RPMI.

Terreno contenente collagenasi D e DNA cigno. Ruotare il composto per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere eventuali detriti cellulari spingendo la miscela attraverso un colino a celle di nylon da 70 micron.

Quindi incubare su ghiaccio per cinque minuti dopo l'incubazione in una provetta da 10 millilitri. Sovrapporre con cura l'omogeneizzato cerebrale su una centrifuga da sette millilitri al 30% per cuscino di chiamata a 400 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente con la pausa. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di lisi dei globuli rossi, tamponare e incubare su ghiaccio per cinque minuti.

Per lisare i pbc aderenti, che non vengono rimossi dal cervello dalla perfusione intraorale. Aggiungere nove millilitri di celle di lavaggio medie RPMI e centrifugare a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resus sospendere i leucociti sequestrati al cervello o BSL contenenti pellet in 50-100 microlitri di terreno RPMI e trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga contare le cellule vitali al microscopio utilizzando un emocitometro e l'esclusione del blu trian.

Sei giorni dopo l'infezione, da 20.000 a 100.000 BSL possono essere recuperati una volta ottenuta la conta delle cellule vitali. Le cellule vengono preparate per l'analisi mediante citometria a flusso. I dettagli di questa procedura sono riportati nel documento di accompagnamento, ma sono riassunti qui per primo.

Tutte le cellule isolate da ciascun cervello vengono centrifugate in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri e vengono risospese in tampone di colorazione con anticorpi bloccanti anti CD 16 e CD 32. Dopo un'incubazione di 10 minuti su ghiaccio, le cellule vengono lavate con tampone di colorazione, centrifugate nuovamente e risospese in tampone di colorazione contenenti anticorpi fluorescenti anti CD quattro, anti CD otto, anti TCR e anti NK 1.1. Le cellule vengono incubate su ghiaccio per un'ora lavate con colorazione, tampone e centrifuga.

Dopo la rotazione, le cellule vengono risospese in PBS e almeno 5.000-10.000 eventi vengono acquisiti su un citometro a flusso. I dati risultanti vengono analizzati utilizzando un software di citometria a flusso appropriato. Le popolazioni di BSL sono state recuperate da cervelli di topi di controllo perfusi o perfusi dall'ONU, infetti dalla malaria e naïve e colorati con anticorpi pe, anti NK 1.1 e un PC anti TCR beta.

Questi dot plot rappresentano le percentuali di cellule NK, linfociti T, cellule NK 1.1 positive TCR positive e cellule doppie negative. NK 1.1 TCR negativo negativo in topi di controllo perfusi o non fusi, infetti da malaria e naïve, coerenti con i risultati precedenti. Le cellule T alfa-beta TCR positive costituivano un'alta percentuale del pool BSL nel cervello di topi infetti da malaria perfusa il sesto giorno dopo l'infezione.

Questa popolazione sembrava essere significativamente sottorappresentata nel cervello degli animali non perfusi. L'apparente riduzione delle frequenze delle cellule T nei cervelli non perfusi è stata associata a una percentuale considerevolmente più alta e al numero totale di cellule doppie negative in questi animali. Un'alta percentuale e un numero elevato di cellule doppie negative in cervelli non perfusi sono stati rilevati non solo nei topi infetti da malaria, ma anche nei controlli naïve, suggerendo che queste cellule sono leucociti non infiammatori presenti nei vasi sanguigni cerebrali che vengono recuperati insieme alle cellule infiammatorie se la perfusione intracardiaca non viene eseguita.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire un'ampia profusione intracardio di topi infetti prima dell'estrazione dell'organo per evitare la contaminazione dei leucociti sequestrati con cellule circolanti non infiammatorie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e analizzare i leucociti sequestrati al cervello da topi infetti da Plasmodium virga mediante geometria fluida.