Name: Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti Plasmodium berghei ANKA topi infettati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Scopri come isolare leucociti infiammatori aderenti dai vasi cerebrali di topi infettati con Plasmodium berghei ANKA. Questo metodo consente la quantificazione e la caratterizzazione fenotipica mediante citometria a flusso.

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Gli autori desiderano ringraziare la signorina Liana Mackiewicz per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato reso possibile grazie vittoriana sostegno governativo Infrastrutture Stato operativo e del governo australiano National Health and Medical Research Council IRIISS e Progetto di sovvenzione 1.031.212.

1. L&#39;infezione di topi con P. berghei-ANKA <ol><li> Sbrinamento un&#39;aliquota di crioconservati P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Trattenere una malaria cerebrale resistente topo BALB / c donatore (8-12 settimane di età) con la tecnica a due mani di ritenuta. Iniettare il mouse con 100-200 ml di PRBC utilizzando un insulina siringa da 1 ml (28G ago). Di routine, 1-2 topi donatori vengono iniettati. </li><li> In 4-5 giorni post-infezione (pi) rimuovere topo donatore da gabbia e collocarla su una workstation o un tampone monouso di lavoro. </li><li> Delicatamente frenare il mouse alla fine della coda e con le forbici piccole tagliare la punta della coda (circa 1 mm). In alternativa, una foratura piccola coda usando un ago 25 G può essere eseguita. </li><li> Una goccia di sangue dalla vena della coda del topo in prossimità della fine di un frosted-end vetrino da microscopio. </li><li> Posizionare una seconda slitta (spreader) su un angolo di 45 ° e sostenerlo nella goccia di sangue. Una volta che il sangue si estende lungo il bordo, premere il divaricatore-slide vigiliaolo attraverso il vetrino da microscopio per rendere la striscio di sangue. Lasciare lo striscio asciugare all&#39;aria. </li><li> Fissare strisci di sangue in metanolo 100% per 30 sec e poi colorare i vetrini in Giemsa appena preparato per 10 min. </li><li> Sciacquare striscio di sangue con acqua corrente per 1 minuto, permette di asciugare vetrino ed esaminare al microscopio (100x, immersione in olio). Enumerare PRBC nel 1000 eritrociti e calcolare parassitemia per cento. Topi donatori dovrebbero raggiungere livelli parassitemia tra il 2,5-5% prima di poter essere sanguinato per infezione di animali da laboratorio. </li><li> Raccogliere il sangue dal topo donatore da retro-orbitale sanguinamento usando un micro-ematocrito eparinizzata tubo capillare. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità con la Sala Walter &amp; Eliza Istituto animali previste dal Comitato Etico. A seconda delle esigenze locali animali Ethic Comitatologia sanguinamento altre potrebbero essere utilizzate. Sciogliere quantità di sangue in mezzo RPMI ad una concentrazione finale di 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Si consideri cheun ematocrito normale mouse è ~ 6x10 9 cellule rosse del sangue / 1 ml. </li><li> Infect C57BL sperimentale / 6 topi (8-12 settimane) iniettando per via intraperitoneale (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml. </li><li> Per monitorare i livelli di parassitemia di topi infettati seguire i passaggi 1,3-1,8. Parassitemia deve essere determinato ogni 2-3 giorni a partire dal giorno 2 o 3 pi </li><li> Insorgenza di malaria grave in C57BL / 6 topi potrebbe manifestarsi come aspetto ingobbito, ruffed pelliccia e bassa attività. Alcuni topi possono recuperare in questa fase, ma la progressione della perdita di auto-raddrizzante riflesso indica malattia irreversibile e gli animali devono essere sottoposti a eutanasia. </li></ol> 2. Perfusione Intracardial di topi e di estrazione del cervello <ol><li> Assemblare un sistema manuale di perfusione gravità assicurando un serbatoio di 500 ml di una colonna di supporto fissato alla parte superiore di una colonna di supporto 60 cm. Collegare tubo di plastica per l&#39;estremità inferiore del serbatoio e fissare un morsetto del tubo per controllare il flusso del buffer. Collegare il tubo di un ago 23 G. Fill il serbatoio con PBS (mantenuto a 22 ° C), aprire la fascetta e permettono di eseguire tampone attraverso il tubo per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria. </li><li> Eutanasia P. berghei ANKA-infetto mouse CO 2 inalazione. Confermare la morte per mancanza di pedale, orbitale e le risposte respiratorie. </li><li> Pin del mouse eutanasia dalle zampe posteriori e anteriori dorsalmente su una tavola di dissezione di polistirolo contenute in un vassoio di plastica. A seconda del locale Comitato di Etica degli animali anestesia requisiti possono essere somministrati prima di inizio pefusion intracardial. </li><li> Pulire lato ventrale con il 70% di etanolo. </li><li> Usare le forbici grandi e pinze per aprire la pelle lungo la linea mediana per esporre la cavità toracica. Piegare la pelle e il pin ai lati. </li><li> Tenere sterno con pinza sottile e tagliare il diaframma e lungo i due lati dello sterno tranciamento delle costole. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni. </li><li> Pin la gabbia toracica dalla sterno liberamente accanto alla testa. </li><li> Tenere spirito ventricolih pinza sottile e accuratamente incise atrio destro con le forbici sottili. </li><li> Inserire l&#39;ago 23G collegato al sistema di perfusione gravità in ventricolo sinistro verso l&#39;aorta ascendente, mentre è in esecuzione PBS. Inserire solo 0,5 cm dalla punta dell&#39;ago. </li><li> Perfusione del mouse per 5 minuti o fino a quando effluenti è chiara. </li><li> Sblocca il mouse e lo posi sul suo addome. Pulire la testa con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando le forbici grandi, fare un taglio appena sopra la zona cervicale del midollo spinale. </li><li> Utilizzare le forbici pregiati per fare una mediana caudale-rostrale taglio a partire dalla base del cranio e la pelle a buccia per scoprire l&#39;cranio. </li><li> Tenendo la testa, posizionare le lame di una forbice piccole in ciascuna cavità orbitale ed effettuare un taglio tra le orbite. </li><li> Praticare un taglio longitudinale lungo la sutura sagittale e con attenzione buccia il teschio su ogni emisfero del cervello verso l&#39;esterno. </li><li> Con una spatola, sollevare delicatamente il cervello e metterlo in una provetta da centrifuga da 10 ml contenente mezzo RPMI. </li></ol>3. Isolamento di Brain-sequestrati leucociti (BSL) <ol><li> Lavorare in una cappa di sicurezza, posto appena prelevato cervello sopra un filtro in acciaio inossidabile cella (40-60 maglia) in una piastra Petri contenente 3-5 ml di mezzo di coltura RPMI tessuto. </li><li> Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi. </li><li> Spingere piccoli pezzi di tessuto cerebrale attraverso il filtro cella utilizzando uno stantuffo cristallo. </li><li> Trasferire omogenato cerebrale in una provetta da 10 ml e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Sciogliere pellet in 3 ml di mezzo RPMI, contenente 0,05% Collagenase D e 2U/ml DNAsi I. </li><li> Ruotare miscela per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere i detriti cellulari spingendo la miscela attraverso un filtro 70 micron cella nylon e / o mediante incubazione in ghiaccio per 5 min. </li><li> Lay omogenato cerebrale su un cuscino 7 ml di Percoll 30% e centrifugare a 400 xg (senza freni) per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di tampone di lisi cellulare rosso sangue e incubare in ghiaccio per 5 min alisare PRBC aderente, che non può essere rimosso dal cervello mediante perfusione intracardial. </li><li> Aggiungere 9 ml di terreno RPMI, lavare le cellule e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere BSL contenenti pellet in 50-100 ml di mezzo RPMI e trasferire le cellule su un tubo Eppendorf. </li><li> Diluire un&#39;aliquota 5-10 microlitri del campione cellulare 1:2 in Trypan blu per l&#39;identificazione di cellule vitali. </li><li> Contare le cellule vitali al microscopio utilizzando un emocitometro. Dal giorno 6 in poi, quando pi P. berghei ANKA topi infettati mostrare segni neurologici, 20,000-100,000 BSLs possono essere recuperati. </li></ol> 4. Tipizzazione di BSL di Citometria a Flusso Multicolor <ol><li> Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e risospendere pellet in 50 pl di tampone colorazione (PBS, 1% di siero fetale bovino (FCS), 2 mM EDTA). </li><li> Aggiungere il 1 ml di anticorpo purificato anti-CD16/32 (Fcblock). </li><li> Incubare le cellule per 10 min in ghiaccio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 50 pl di tampone contenente colorazione diluizioni ottimali predeterminate di richieste anticorpi fluorescenti, ovvero anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR e anti-NK1.1. </li><li> Incubare per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS. </li><li> Trasferire le cellule a un tubo di plastica di citometria a flusso. </li><li> Utilizzando un citofluorimetro, acquisire almeno 5.000-10.000 eventi. Adeguati controlli e campioni di cellule non marcate con fluorocromi di compensazione dovrebbe essere incluso come richiesto. </li><li> Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato citometria a flusso. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
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<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
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<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;isolamento e l&#39;analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L&#39;introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell&#39;estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzioni e tamponi </td></tr><tr><td> Giemsa azur eosina blu metilene soluzione </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Diluizione 1:10 in acqua distillata </td></tr><tr><td> RPMI media </td><td></td><td></td><td> Mouse tonicità </td></tr><tr><td> Mouse tonicità PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM fosfato di sodio, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 </td></tr><tr><td> Collagenasi D </td><td> Biochimica Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAsi) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Da pancreas bovino </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> Soluzione al 30% in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapura Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di ammonio (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nM NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA sale disodico </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anticorpi e coniugati </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ml in 50 microlitri tampone di colorazione (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-topo CD4, clone H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-topo NK1.1, clone PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-topo CD8, clone 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-topo TCR-β, clone H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-topo CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato anti-topo-CCR5, clone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzature e materiali </td></tr><tr><td> SuperFrost vetrino da microscopio </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinze, forbici dissezione </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS serbatoio </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi in gomma vulcanizzata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ago 23G </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Cella dissociazione kit contenenti metalli setaccio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron nylon filtro cella </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a Flusso tubi </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e analisi di brain-sequestrati da leucociti<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka topi infettati

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Si descrive un metodo per l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L&#39;infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in 1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine ​​parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e 3 emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita. A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic 4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all&#39;interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell&#39;estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L&#39;omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso. Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.

I risultati in Fig. 2 percentuali di spettacoli e di numeri assoluti delle diverse popolazioni BSL recuperati da cervelli di perfusi o unperfused topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR β-anticorpi, come indicato nel testo del protocollo. In linea con i risultati precedenti 7-9, αβTCR + cellule T comprende una percentuale elevata della piscina BSL nel cervello di perfusi malaria topi infettati (giorno 6 pi). Questa popola...

Un metodo per l&#39;isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati è descritto. Il metodo consente la quantificazione e caratterizzazione fenotipica di leucociti isolati dopo colorazione con anticorpi fluorescenti e successiva analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti infiammatori aderenti dai vasi sanguigni cerebrali di topi infetti da plasmodium burge eye anca per indurre la malaria cerebrale sperimentale. I topi sono infettati con plasmodium berge eye anca parassitato globuli rossi mediante iniezione. Dopo che i topi iniziano a mostrare segni di malattia, le cellule circolanti dei topi infetti da malaria vengono rimosse mediante perfusione intraorale.Il cervello viene quindi raccolto e il tessuto viene digerito con enzimi per consentire l'isolamento dei leucociti infiammatori. La citometria a flusso multicolore viene quindi eseguita per l'immunofenotipo. L'analisi dei leucociti sequestrati al cervello dei dati risultanti rivela la percentuale e il numero assoluto di leucociti che migrano verso il cervello dei topi infetti da malaria.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi della malaria, come ad esempio quale tipo di cellule infiammatorie migrano verso il sito di sequestro del parassita nel cervello di animali infetti in diverse condizioni sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Le fasi di perfusione sono difficili da imparare in quanto richiedono velocità e attenzione per non danneggiare i vasi sanguigni significativi. A dimostrare alcune parti di questa procedura saranno Leanna Mcic, un tecnico animale, la signora Victoria, Rick, uno studente di dottorato, e la dottoressa Lisa Aez, un postdoc del mio laboratorio.Inizia questo protocollo infettando i topi con p berge eye anca defrost un'aliquota crioconservata di P berge eye anca ha parassitato i globuli rossi o pbcs lasciandolo raggiungere la temperatura ambiente. Rimuovi un topo donatore di 8-12 settimane dalla sua gabbia e posizionalo su una postazione di lavoro. Afferra la collottola tra l'indice e il pollice.Capovolgere il mouse e iniettare da 100 a 200 microlitri di plasmodium berge eye nella cavità peritoneale. Di routine a due topi donatori vengono iniettati pbcs. Dopo l'iniezione, metti i topi nella loro gabbia quattro o cinque giorni dopo l'infezione.Rimuovi un topo donatore dalla sua gabbia e posizionalo su una postazione di lavoro. Posizionare una goccia di sangue dalla vena della coda del topo vicino all'estremità di un vetrino da microscopio smerigliato. Posiziona un secondo vetrino con un angolo di 45 gradi e rimettilo nella goccia di sangue.Una volta che il sangue si diffonde lungo il bordo, spingere il vetrino del divaricatore in modo uniforme sul vetrino del microscopio per fare lo striscio di sangue. Lasciare asciugare lo striscio all'aria per fissare gli strisci di sangue. Immergere i vetrini in metanolo al 100% per 30 secondi.Quindi colorare i vetrini in GIM ZA appena preparato per 10 minuti dopo la colorazione con gim za, sciacquare il vetrino con acqua corrente per 30 secondi. Lasciare asciugare il vetrino all'aria, quindi esaminarlo al microscopio utilizzando la lente ad immersione in olio 100x. Enumerare il PRBC entro un migliaio di eritrociti e calcolare la percentuale para se il topo donatore ha raggiunto i livelli richiesti dal 2,5 al 5%Parsit Raccogliere il sangue dal topo donatore mediante puntura cardiaca in anestesia o sanguinamento retroorbitale utilizzando un tubo capillare microematocrito eparinizzato.Sciogliere il sangue nel mezzo RPMI a una concentrazione finale di una volta 10 per i sei PRBC per 0,2 millilitri per topo. Si consideri che un ematocrito normale di topo è circa sei volte 10 al nono dei globuli rossi per millilitro. Infatti, i topi sperimentali C 57 neri di età compresa tra 8 e 12 settimane iniettando una volta 10 al sesto PRBC in 0,2 millilitri intraperitoneale come prima.Per monitorare i livelli di para dei topi infetti, preparare uno striscio di sangue come prima. La para deve essere determinata ogni due o tre giorni a partire dal secondo o terzo giorno dopo l'infezione dal quinto giorno. Dopo l'infezione in poi.I topi vengono monitorati quotidianamente per segni di malaria grave una volta che i livelli di para sono superiori al 5% e i topi mostrano sintomi neurologici intorno al sesto giorno dopo l'infezione. I topi infetti vengono soppressi per inalazione di CO2 e immediatamente perfusi con PBS come descritto nel documento di accompagnamento. L'aspetto più difficile di questa procedura è la perfusione intracardiaca.Di seguito sono riportati una serie di suggerimenti per la risoluzione dei problemi: con il mouse bloccato su una tavola di dissezione in polistirolo. All'interno di un vassoio di dissezione. Pulisci il lato ventrale con etanolo al 70%, quindi usa forbici e pinze grandi per aprire la pelle lungo la linea mediana per esporre la cavità toracica, piegare e appuntare la pelle ai lati.Tenere lo sterno con una pinza fine e tagliare il diaframma e lungo entrambi i lati dello sterno, recidendo le costole. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni di grandi dimensioni. Appunta la gabbia toracica vicino allo sterno in modo lasco vicino alla testa.Tenere i ventricoli con una pinza sottile e incidere con cura l'atrio destro con le forbici sottili. Inserire l'ago da 23 gauge collegato al sistema di perfusione gravitazionale nel ventricolo sinistro verso l'aorta ascendente. Mentre il PBS è in esecuzione, inserire solo 0,5 centimetri della punta dell'ago per perfondere il mouse per cinque minuti o fino a quando l'effluente non è limpido.Dopo la perfusione interna, sezionare il cervello e metterlo in una provetta da centrifuga da 10 millilitri contenente RPMI. Medio. Posizionare il cervello appena raccolto sopra un colino di cellule in acciaio inossidabile da 40 a 60 mesh in una capsula di Petri contenente da tre a cinque millilitri di terreno di coltura tissutale RPMI. Taglia il tessuto cerebrale in piccoli pezzi.Quindi, utilizzando uno stantuffo di cristallo, spingere piccoli pezzi di tessuto cerebrale attraverso il filtro cellulare. Trasferire l'omogeneizzato cerebrale in una provetta da 10 millilitri e centrifugarlo a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e sciogliere il pellet in tre millilitri di RPMI.Terreno contenente collagenasi D e DNA cigno. Ruotare il composto per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere eventuali detriti cellulari spingendo la miscela attraverso un colino a celle di nylon da 70 micron.Quindi incubare su ghiaccio per cinque minuti dopo l'incubazione in una provetta da 10 millilitri. Sovrapporre con cura l'omogeneizzato cerebrale su una centrifuga da sette millilitri al 30% per cuscino di chiamata a 400 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente con la pausa. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di lisi dei globuli rossi, tamponare e incubare su ghiaccio per cinque minuti.Per lisare i pbc aderenti, che non vengono rimossi dal cervello dalla perfusione intraorale. Aggiungere nove millilitri di celle di lavaggio medie RPMI e centrifugare a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resus sospendere i leucociti sequestrati al cervello o BSL contenenti pellet in 50-100 microlitri di terreno RPMI e trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga contare le cellule vitali al microscopio utilizzando un emocitometro e l'esclusione del blu trian.Sei giorni dopo l'infezione, da 20.000 a 100.000 BSL possono essere recuperati una volta ottenuta la conta delle cellule vitali. Le cellule vengono preparate per l'analisi mediante citometria a flusso. I dettagli di questa procedura sono riportati nel documento di accompagnamento, ma sono riassunti qui per primo.Tutte le cellule isolate da ciascun cervello vengono centrifugate in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri e vengono risospese in tampone di colorazione con anticorpi bloccanti anti CD 16 e CD 32. Dopo un'incubazione di 10 minuti su ghiaccio, le cellule vengono lavate con tampone di colorazione, centrifugate nuovamente e risospese in tampone di colorazione contenenti anticorpi fluorescenti anti CD quattro, anti CD otto, anti TCR e anti NK 1.1. Le cellule vengono incubate su ghiaccio per un'ora lavate con colorazione, tampone e centrifuga.Dopo la rotazione, le cellule vengono risospese in PBS e almeno 5.000-10.000 eventi vengono acquisiti su un citometro a flusso. I dati risultanti vengono analizzati utilizzando un software di citometria a flusso appropriato. Le popolazioni di BSL sono state recuperate da cervelli di topi di controllo perfusi o perfusi dall'ONU, infetti dalla malaria e naïve e colorati con anticorpi pe, anti NK 1.1 e un PC anti TCR beta.Questi dot plot rappresentano le percentuali di cellule NK, linfociti T, cellule NK 1.1 positive TCR positive e cellule doppie negative. NK 1.1 TCR negativo negativo in topi di controllo perfusi o non fusi, infetti da malaria e naïve, coerenti con i risultati precedenti. Le cellule T alfa-beta TCR positive costituivano un'alta percentuale del pool BSL nel cervello di topi infetti da malaria perfusa il sesto giorno dopo l'infezione.Questa popolazione sembrava essere significativamente sottorappresentata nel cervello degli animali non perfusi. L'apparente riduzione delle frequenze delle cellule T nei cervelli non perfusi è stata associata a una percentuale considerevolmente più alta e al numero totale di cellule doppie negative in questi animali. Un'alta percentuale e un numero elevato di cellule doppie negative in cervelli non perfusi sono stati rilevati non solo nei topi infetti da malaria, ma anche nei controlli naïve, suggerendo che queste cellule sono leucociti non infiammatori presenti nei vasi sanguigni cerebrali che vengono recuperati insieme alle cellule infiammatorie se la perfusione intracardiaca non viene eseguita.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire un'ampia profusione intracardio di topi infetti prima dell'estrazione dell'organo per evitare la contaminazione dei leucociti sequestrati con cellule circolanti non infiammatorie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e analizzare i leucociti sequestrati al cervello da topi infetti da Plasmodium virga mediante geometria fluida.

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Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.

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Questo video dimostra la generazione di un modello murino sperimentale di malaria cerebrale. Gli sporozoiti isolati da zanzare femmine infette da Plasmodium berghei vengono iniettati nelle vene della coda di un topo trattenuto, causando l'interruzione della barriera emato-encefalica e l'infiammazione cerebrale, causando la malaria cerebrale. Questo modello murino infetto offre uno strumento prezioso per studiare in vivo la patologia microvascolare associata alla malaria cerebrale.

Generazione di un modello murino di malaria cerebrale sperimentale utilizzando sporozoiti derivati da zanzare ospiti

Questo video mostra un test per l'immunizzazione di un modello murino con sporozoiti vivi attenuati. Gli sporozoiti di Plasmodium attenuati dalle radiazioni vengono iniettati nel lato dorsale dell'orecchio del topo. Dopo le iniezioni in più punti su entrambe le orecchie, il topo può riprendersi.

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Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

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