Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Questo esperimento monitora la rottura del VA provocata da patogeni intracellulari in singole cellule. Per prima cosa caricare le celle con il colorante CCF 4:00 AM, che viene scisso dalle esterasi cellulari. Quindi preparare e applicare i neurobatteri FL alle quattro cellule caricate CCF, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per l'invasione batterica delle cellule ospiti.

Quindi determinare il rapporto tra le intensità emesse nei canali a 450 nanometri e 535 nanometri. I risultati mostrano la presenza di agenti patogeni nel citosol a causa della sua adattabilità ad alta produttività. Questa tecnica facilita l'identificazione di nuovi antibiotici affrontando un problema chiave della localizzazione subcellulare dei batteri durante le interazioni tra patogeni dell'ospite.

Insieme al mio collega Tran Vanu, eravamo interessati allo sviluppo di approcci per esaminare i patogeni intracellulari con un'alta risoluzione temporale. Ciò ha portato alla creazione del test CCF a quattro betalattamasi per la rottura regolare dell'ulare. Oggi, questo approccio sarà presentato sperimentalmente da due studenti laureati in laboratorio, Nora MellU e Charlotte Keller Inoculare i ceppi batterici wild type e mutanti in otto millilitri di TCSB contenenti 50 microgrammi per millilitro di ampicillina collocare le colture in uno shaker a 37 gradi Celsius ora semina cinque volte 10 al terzo cellule hela per pozzetto.

In 100 microlitri di DMEM contenenti il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di penicillina, la streptomicina, le cellule in un incubatore al 5% di anidride carbonica, il giorno successivo, sottocoltura, i batteri a una diluizione 100 in TCSB integrati con 50 microgrammi per millilitro di ampicillina crescono in uno shaker a 37 gradi Celsius per due ore e mezza. Ora per caricare le celle hela preparare CCF 4:00 AM colorante in tampone em lavare le cellule una volta con PBS. Quindi aggiungere 25 microlitri di CCF 4:00 AM carico miscela per pozzetto a temperatura ambiente al buio per due ore e 30 minuti per preparare i batteri per l'infezione pellet un millilitro di coltura per centrifugazione dopo un lavaggio con 500 microlitri di PBS Resus, sospendere i batteri in 500 microlitri di PBS integrati con 10 microgrammi per millilitro di poliolo lisina e 40 microgrammi per millilitro di beta-lattamasi.

Incubare per 10 su una ruota rotante a temperatura ambiente, quindi lavare una volta con 500 microlitri di PBS e risospendere ogni pellet batterico in 500 microlitri di un millimolare di Probenecid in tampone EM, lavare le cellule una volta con 150 microlitri di un millimolare di prob in tampone em. Successivamente, diluire 10 microlitri di batteri in 100 microlitri di una soluzione sonda millimolare e distribuirla a ciascun pozzetto di cellule hela. Dopo 15 minuti di incubazione al buio a temperatura ambiente, trasferire la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Lavare una volta con 150 microlitri di una soluzione di probit millimolare. Quindi fissare i campioni con 50 microlitri di aldeide paraforme al 4% in una soluzione millimolare Pro per 10 minuti al buio Dopo un lavaggio con la soluzione di Probenecid, aggiungere 30 microlitri di colorante nucleare 10 micromolare drac five per una segmentazione cellulare ottimale. Incubare le cellule per 30 minuti, lavare una volta e aggiungere 100 microlitri di soluzione millimolare per acquisire le immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertita.

Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione a 405 nanometri. Rileva le emissioni tramite filtri a 450 nanometri e 535 nanometri utilizzando tempi di esposizione di cinque millisecondi per la luce trasmessa. 1000 millisecondi per 535 nanometri e 500 millisecondi per 450 nanometri.

L'uso di un dispositivo di calibrazione della messa a fuoco accoppiato alla microscopia automatizzata consente l'acquisizione simultanea di decine di posizioni diverse in più pozzetti. Se si utilizza un microscopio confocale, utilizzare tempi di esposizione di 240 millisecondi a 450 nanometri, 360 millisecondi a 535 nanometri per il laser a 405 nanometri e 640 millisecondi per il laser a 640 nanometri. Analizza i dati con un algoritmo informatico che consente il punteggio automatico del segnale fluorescente per ogni singola cellula.

Ad esempio, utilizza software come metamorph e acapella per creare uno script per misurare il rapporto tra i segnali di emissione a 450 nanometri e 535 nanometri. Per questo test, avviare una coltura HELOC con due volte 10 alla quinta cellula in un volume finale di due millilitri. Preparare i batteri per l'infezione e caricare le cellule hela con CCF 4:00 AM Disporre un microscopio convo con un obiettivo d'aria a pianta N all'interno di una camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius.

Impostare il laser a 405 nanometri e l'emissione tramite filtri a 450 nanometri e 535 nanometri. Immettere anche tempi di esposizione di cinque millisecondi per la luce trasmessa. 200 millisecondi per 535 nanometri e 100 millisecondi per 450 nanometri.

Imposta l'acquisizione dei dati ogni 90 secondi su 60 minuti. Ora lavare le cellule una volta con due millilitri di soluzione di Probenecid millimolare. Aggiungere due millilitri di un millimolare prob nel tampone em.

Quindi montare il piatto sul tavolino del microscopio e iniziare l'acquisizione dopo sei minuti. Metti in attesa l'acquisizione. Aggiungere 250 microlitri di risospensione batterica sopra le cellule e riavviare l'acquisizione per l'analisi post-acquisizione.

Visualizza i filmati utilizzando il metamorfo di velocità o l'immagine J. Ottieni rapporti di intensità da 450 a 535 nanometri per ogni singola cellula. L'approccio CCF 4:00 AM beta-lattamasi è un metodo robusto e sensibile per tracciare la rottura ulare di patogeni intracellulari come il gel flexneri in seguito a infezione da cellule HELOC. Con il BS 176 AFA non invasivo un deformazione per un'ora, la sonda CCF a quattro tasti rimane intatta ed emette un segnale verde.

Al contrario, il ceppo virulento M 90 TFA I commuta il segnale verso il blu in modo coerente con la scissione della sonda nel citosol per la determinazione del segnale metrico del rapporto. Abbiamo sviluppato uno script per il software metamorph e acapella per automatizzare il rilevamento delle cellule e le misurazioni nei canali a 535 e 450 nanometri. I nuclei e il citosol delle cellule vengono segmentati utilizzando il canale DR a cinque.

Quindi l'algoritmo è in grado di rilevare e quantificare le popolazioni cellulari positive a 450 nanometri e 535 nanometri. I rapporti medi calcolati sono bassi per il ceppo mutante e alti per il ceppo virulento. Gli esperimenti possono essere eseguiti su diversi tipi di cellule umane come le cellule epiteliali di Gila e le cellule simili ai macrofagi THP.

Entrambi i tipi di cellule rispondono al ceppo virulento M 90 T AFA one cha commutando il segnale emesso da verde a blu in caso di infezione. Con il ceppo non invasivo, il segnale verde persiste nella quantificazione utilizzando uno script sviluppato su software di metamorfo e una macro sviluppata in Excel presenta istogrammi di rottura ulare in funzione della distribuzione cellulare. Il metodo può essere adattato con successo per comprendere l'infettività di diversi batteri.

Ad esempio, questo set di dati mostra il micobatterio Bovis. Il BCG risiede nel fagosoma per l'intero corso dell'esperimento, come mostrato dal segnale verde persistente. Al contrario, il mycobacterium tuberculosis provoca la rottura della membrana vaga nei macrofagi THP 1 dopo sette giorni dall'infezione, come evidenziato dalla comparsa di un segnale a 450 nanometri dopo sette giorni dall'infezione utilizzando lo stesso algoritmo.

Per quanto riguarda lo studio della rottura del valar da parte di Ella, abbiamo scoperto che le cellule infettate da mycobacterium tuberculosis mostrano rapporti più elevati da 450 a 535 nanometri rispetto al mycobacterium bovis BCG dopo sette giorni dall'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la rottura ulare da agenti patogeni con il test CCL a quattro betalattamasi Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in quattro ore, ma ricorda che devi aggiungere il processo in ogni tampone durante tutto il protocollo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica o il frazionamento di membrana, è che può essere eseguita in tempo reale senza alcun trattamento biochimico.

Ulteriori analisi come la marcatura dell'actina o il test di protezione della gentamicina possono essere eseguite per valutare l'assorbimento e la proliferazione dei batteri nelle cellule ospiti.