Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di etichettare sottogruppi specifici di neuroni nel cervello posteriore del pollo e di tracciare le loro traiettorie assonali e i bersagli. Ciò si ottiene aprendo prima una piccola finestra ovale al centro di una giornata embrionale.2.75. I plasmidi del DNA successivo all'uovo vengono iniettati nel lume del cervello posteriore.

Quindi il cervello posteriore viene elettroporato unilateralmente per consentire l'espressione dei costrutti nel gruppo neuronale desiderato e le uova incubate. Infine, il tronco encefalico viene sezionato dall'intero embrione per la preparazione a montaggio piatto o il sezionamento tissutale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano proiezioni assonali e bersagli sinaptici nella parte posteriore, nel cervello e nel cervelletto in varie fasi dello sviluppo attraverso la colorazione immunofluorescente e l'analisi al microscopio.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come ad esempio il modo in cui specifiche cellule neuronali proiettano i loro assoni e formano connessioni sinaptiche durante lo sviluppo embrionale. Per prepararsi all'elettroporazione, incubarli a 37-38 gradi e mezzo Celsius per 65-70 ore fino a raggiungere lo stadio 16-17. Mentre le uova sono in incubazione, i capillari di vetro collegano gli elettrodi d'oro piegati a forma di L con un supporto adattatore al narratore di impulsi.

Impostare i parametri di elettroporazione su 25 volt, cinque numeri di impulso, 45 millisecondi di lunghezza dell'impulso e 300 intervalli di impulso. Preparare una pipetta per la bocca, una siringa da 10 millilitri, strisce di paraforme, una spazzola morbida, forbici da dissezione affilate e 25 millilitri di PBS sterile. Preparare una miscela adeguata di plasmidi di DNA e aggiungere colorante verde veloce per visualizzare il DNA iniettato.

Quando gli ovuli hanno raggiunto il corretto stadio di sviluppo, rimuoverli dall'incubatrice e tenerli in posizione orizzontale. Usa il 70% di etanolo per pulire i gusci d'uovo. Maneggiare un uovo alla volta per ridurre al minimo l'esposizione embrionale.

È ora di arieggiare con la punta delle forbici. Fai un buco sul palo dell'uovo e con la siringa rimuovi da tre a quattro millilitri di albumina. Usando le forbici da dissezione, apri una piccola finestra ovale sul polo orizzontale superiore del guscio d'uovo.

Durante l'intero processo, gocciolare alcune gocce di PBS sopra l'embrione per prevenire la secchezza. Utilizzando una pipetta orale, caricare una piccola quantità della miscela di DNA nel capillare di vetro. Quindi, posiziona l'embrione con la sua vista indiretta all'estremità posteriore.

Quindi, tenendo il capillare a circa 45 gradi, penetrare nel cervello posteriore della coccola. Non rimuovere alcuna membrana intorno all'embrione senza formare bolle d'aria. Espira con attenzione per iniettare la soluzione di DNA nel lume del cervello posteriore.

La soluzione si diffonderà anteriormente subito dopo l'iniezione di DNA. Posizionare gli elettrodi paralleli nelle precise posizioni mirate del cervello posteriore AP e DV. Senza toccare il cuore, spingere leggermente gli elettrodi ventralmente e pulsare l'elettro.

Gli elettrodi devono essere coperti con bolle per indicare la conduttività elettrica, rimuovere con cura gli elettrodi e gocciolare alcune gocce di PBS per raffreddare l'embrione e rimuovere le bolle. Utilizzare una striscia di perfil per sigillare correttamente l'apertura dell'uovo per evitare che si secchi durante l'incubazione con una spazzola morbida e PBS lavare gli elettrodi, posizionare l'uovo nell'incubatrice per il tempo desiderato. La sopravvivenza degli embrioni è di circa il 90% due o tre giorni dopo l'elettroporazione e si riduce fino al 50% 12 giorni dopo l'elettroporazione.

Per preparare il cervello posteriore, sezionare attentamente l'embrione, separandolo dalle membrane e dai vasi sanguigni circostanti. Posizionare l'embrione in una piccola capsula di Petri rivestita di silicone contenente PBS con l'embrione rivolto dorsalmente. Usa i perni di tungsteno per fissarlo al piatto.

Quindi utilizzando un capillare di vetro affilato. Fai una fessura dorsale nella piastra del tetto del cervello posteriore con pinzette affilate e micro forbici. Tenere la parte superiore della testa e tirare il tessuto cerebrale posteriore con molta attenzione dal rostrale al bambino.

Dopo la separazione del cervello posteriore, rimuovere i tessuti ventrali rimanenti. Incubare il cervello posteriore in aldeide paraforme al 4% o in una soluzione di PFA per una o due ore a temperatura ambiente. Quindi lavarlo con PBT per rimuovere il PFA.

Dopo aver seguito la preparazione per l'immunofluorescenza descritta nel protocollo di testo, posizionare il cervello posteriore rivolto dorsalmente su un vetrino. Aggiungere un mezzo di montaggio fluorescente sul cervello posteriore e utilizzare capillari di vetro o aghi di tungsteno per appiattire il cervello posteriore sul vetrino. Aggiungere una piccola quantità di grasso ad ogni angolo per evitare che il fazzoletto venga schiacciato dal vetrino coprioggetto.

Posizionare con cura un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del cervello posteriore evitando bolle d'aria per l'aderenza. Aggiungere lo smalto sui bordi del vetro di copertura. Le criosezioni del tronco encefalico possono essere eseguite in qualsiasi fase dello sviluppo, ma dopo E 6.5.

Dovrebbero essere il metodo preferito a causa della difficoltà di visualizzare gli assoni nell'embrione montato piatto, che diventa molto spesso. Inoltre, la dimostrazione della sinapsi richiede il sezionamento del tessuto e la visione ad alto ingrandimento al microscopio. Per preparare un campione per la criosezione, sezionare l'embrione e rimuovere tutti i tessuti che circondano il cervello.

Risciacquare con PBS. Quindi usa micro forbici e pinzette affilate per tagliare l'embrione nella regione della coccola del midollo. Fai un'ampia incisione tra il cervelletto e il mesencefalo e rimuovi l'intero tronco encefalico.

Il tessuto dovrebbe contenere il midollo e il cervelletto. Nell'esempio seguente, un elemento enhancer che è espresso nel sottogruppo DA uno di interneuroni nel cervello posteriore di controllo è stato clonato a monte della ricombinasi Cree e co-elettroporato con un plasmide reporter GFP citoplasmatico Cree dipendente. Una preparazione a montatura piatta allo stadio E 4.5 rivela due modelli di proiezione assonale ascendente controlaterale per mappare le proiezioni assonali di DA uno interneuroni nelle fasi successive dello sviluppo.

Una cassetta reporter GFP incondizionata pre-con è stata clonata tra due bracci piggyback, insieme all'enhancer A TOH one creen e al vettore di trasposizione. Utilizzando questa strategia, la MG FP precompatibile condizionale al C elettroporata viene integrata nei cromosomi del pollo e, di conseguenza, la cassetta di arresto viene rimossa solo nei neuroni D uno, consentendo un'espressione prolungata della GFP. In DA una cellula.

La forma mesilata della GFP la lega alla membrana in modo tale che sia localizzata lungo la membrana assonale piuttosto che essere diluita nel citoplasma. In steli cerebrali raccolti a E 13.5 e analizzati in sezioni sagittali. È stato riscontrato che gli assoni DA one si accumulano nel cervelletto e si estendono verso lo strato granulare esterno o EGL, che è contrassegnato da cellule ZI one positive.

Sono stati analizzati anche i bersagli sinaptici degli assoni D uno nel cervelletto. Gli embrioni E 2,75 sono stati elettroporati con la proteina della vescicola sinaptica due plasmidi reporter, insieme a un potenziatore Cree H one e la trasposizione piggyback. Questo metodo consente l'espressione del reporter GFP nei termini assonali presinaptici DA.

Il cervelletto è stato sezionato a E 13,5 e colorato con il marcatore presinaptico generale taman sinaptico, nonché con calbindina che etichetta lo strato bikini. Una vista ad alto ingrandimento della sezione mostra SV due vescicole sinaptiche GFP positive in più regioni cerebellari, incluso lo strato bikini. Questo risultato rivela le connessioni sinaptiche di DA un cervello posteriore tra neuroni nel cervelletto.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far funzionare il DNA nell'Hein aviario al secondo giorno embrionale punto 75 al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di cellule neuronali. Questa procedura consente di seguire le proiezioni assonali e le connessioni sinaptiche delle cellule neuronali marcate in più fasi di sviluppo.