Name: Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Impara a tracciare le traiettorie assonali e i target sinaptici nel romboencefalo dell'embrione di pollo mediante elettroporazione. Questa tecnica consente di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni e analizzarne la connettività.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Ringraziamo il Dott. Yuval Gottlieb-Dror per l&#39;illustrazione elettroporazione. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a DSD presso l&#39;Istituto Nazionale per la Psicobiologia in Israele e dal programma di cooperazione di ricerca Niedersachsen-Israele e da sovvenzioni per AK da The Israel Science Foundation, il Ministero Israele di salute, e il centro di eccellenza del Patrimonio-Legacy Biomedical Science collaborazione.</p&gt;

1. Romboencefalo elettroporazione 1.1 gestione Egg <ol><li> Mettere le uova orizzontalmente in un incubatore umidificato (37-38,5 ° C). Gli embrioni sono elettroporati dopo 65-70 ore di incubazione, quando raggiungono 16-17 (HH) stadio (25-30 somiti). </li><li> Togliere le uova dal termostato, rimangono in posizione orizzontale. </li></ol> 1.2 Preparativi <ol><li> Tirare vetro capillari (0,5 mm di diametro). </li><li> Collegare piegati a forma di L oro Genetrodes elettrodi (3 mm di diametro) con un supporto adattatore per il generatore di impulsi. Parametri di elettroporazione sono 25 volt, 5 numeri di impulsi, 45 ms lunghezza dell&#39;impulso, 300 msec intervalli di impulso. </li><li> Preparare una pipetta a bocca, 10 ml della siringa, strisce parafilm, una spazzola morbida, forbici dissezione nitide e 25 ml di soluzione PBS sterile. Tale importo è di solito sufficiente per gestire un vassoio di uovo (18 uova). </li><li> Preparare una miscela adeguata di plasmidi di DNA (5 mg / mL ciascuno) eaggiungere circa 0.025% Veloce colorante verde per visualizzare l&#39;iniezione del DNA. Solitamente un volume di 4 ml è sufficiente per l&#39;iniezione di un vassoio. </li></ol> 1.3 windowing, iniezione ed elettroporazione <ol><li> Pulire i gusci d&#39;uovo con il 70% di etanolo. </li><li> Maneggiare un uovo alla volta a ridurre al minimo il tempo di esposizione embrionale all&#39;aria. </li><li> Fare un buco al polo uovo con le estremità forbici e togliere 3-4 ml di albumina con la siringa. Non rimuovere una maggiore quantità di albumina in quanto riduce la vitalità. </li><li> Aprire una piccola finestra ovale (2,5 x 2 dimensioni cm) al centro superiore del guscio delle uova usando le forbici dissezione. </li><li> Gocciolare qualche goccia di PBS sopra l&#39;embrione per prevenire la secchezza durante tutto il processo. </li><li> Caricare una piccola quantità della miscela DNA nel capillare di vetro usando una pipetta a bocca. </li><li> Posizionare l&#39;embrione con la sua estremità posteriore verso di voi. Nessuna iniezione di inchiostro è richiesta in questa fase, l&#39;embrione è chiaramente visibile. Evitare aumenti di iniezione d&#39;inchiostrosopravvivenza embrionale. Penetrare il romboencefalo caudale tenendo il capillare a ~ 45 °. Non rimuovere la membrana da tutto l&#39;embrione. Iniettare la soluzione di DNA con cura nel lume romboencefalo ed espirare senza formare bolle d&#39;aria. Soluzione di DNA diffonde anteriormente. </li><li> Subito dopo l&#39;iniezione del DNA, posizionare gli elettrodi paralleli al preciso AP e la posizione romboencefalo DV si mira a bersaglio. Spingere gli elettrodi leggermente ventrale senza toccare il cuore, in quanto può ridurre la vitalità. Pulse il elettroporatore. Elettrodi devono essere coperti con bolle per indicare conducibilità elettrica (Figura 1A). </li><li> Rimuovere con attenzione gli elettrodi e gocciolare qualche goccia di PBS per raffreddare l&#39;embrione e per rimuovere le bolle. Sigillare l&#39;uovo apertura correttamente con una striscia di parafilm per evitare l&#39;essiccazione durante l&#39;incubazione. Lavare elettrodi in PBS con la spazzola morbida. </li><li> Mettere uova in incubatrice per il tempo desiderato. La sopravvivenza degli embrioni è di circa il 90% 2-3 giorni dopoelettroporazione, e riduce fino al 50% 12 giorni dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol> 2. Analisi di embrioni 2.1 preparazione Flat-mount e immunofluorescenza <ol><li> Flat-mount preparativi del cervello posteriore possono essere eseguite fino a E6.5 di visualizzare facilmente gli assoni al microscopio o di uno stereo-microscopio. </li><li> Sezionare con cura l&#39;embrione separandola dalla membrane che circondano e vasi sanguigni. Posizionare l&#39;embrione in un piccolo silicone - rivestito piastra di Petri contenente PBS. Attaccare l&#39;embrione al piatto con perni di tungsteno rivolti dorsalmente. Eseguire una fenditura dorsale nel romboencefalo tettoia parapioggia con tagliente capillari di vetro. </li><li> Usando le pinzette taglienti e micro-forbici tenere la parte superiore della testa e tirare con molta attenzione il tessuto hindbrain dal rostrale caudale. Dopo separazione della romboencefalo eliminare i rimanenti tessuti ventrali raggiungere una preparazione pulita. </li><li> Incubare la romboencefalo con 4Paraformaldeide soluzione% (PFA) per 1-2 ore a temperatura ambiente (RT). Lavare il romboencefalo con PBT (PBS/0.1% Triton X-100) per rimuovere PFA. </li><li> Per immunofluorescenza in hindbrains piatto montati aggiungere 500 ml di soluzione di bloccaggio (5% di siero di capra in PBT e incubare per 2 ore a RT Incubare con 1 m anticorpo ON a 4 ° C. Lavare con PBT (15 min x 3). Incubare con il 2 ° anticorpo per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBT (15 min x 3). </li><li> Posizionare il romboencefalo fronte dorsalmente su un vetrino. Aggiungi mezzi di montaggio fluorescenti sul cervello posteriore. Utilizzare vetro capillari o aghi di tungsteno per appiattire il romboencefalo sulla diapositiva. </li><li> Aggiungere piccole quantità di grasso ad ogni angolo per impedire spremitura del tessuto dal vetrino. Collocare il vetrino sulla parte superiore del cervello posteriore e di evitare bolle d&#39;aria. Per aderenza aggiungere smalto per coprire i bordi di vetro. </li></ol> 2.2 Cryo-sezioni ed immunofluorescenza <ol><li> Cryo-sezioni del tronco encefalico can essere eseguita in qualsiasi momento per visualizzare traiettorie assonali. Eppure, dopo E6.5 questo dovrebbe essere il metodo preferito per la difficoltà di visualizzare assoni nell&#39;embrione piatto montata, che diventa troppo spesso. Inoltre, la dimostrazione di sinapsi richiede sezionamento del tessuto e una vista di alto ingrandimento al microscopio. </li><li> Sezionare l&#39;embrione e rimuovere tutti i tessuti circostanti. Risciacquare con PBS. Tagliare l&#39;embrione alla parte caudale del midollo utilizzando micro-forbici e pinzette taglienti. Fai una vasta incisione tra il cervelletto e il mesencefalo e rimuovere l&#39;intero tronco encefalico. Il tessuto deve contenere il midollo, ponte e cervelletto. </li><li> Fissare il tronco encefalico in PFA 4% per il pernottamento (ON) a 4 ° C, lavare con PBS (10 min x 3), e incubare con il 30% di saccarosio per ON a 4 ° C fino al naufragio. </li><li> Incorpora il romboencefalo in un crio-stampo con ottobre composto (Optimal Cutting Temperature), e metterlo a -20 ° C fino a congelamento, come descritto altrove 11. </li><li&gt; Posizionare il blocco di ottobre nel criostato in corrispondenza dell&#39;asse della sezione desiderata. Larghezza della sezione è di 12 micron. </li><li> Asciugare i vetrini. Aggiungere 100 microlitri soluzione bloccante in ogni diapositiva per 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 100 ml di anticorpi (diluito in soluzione di blocco fino alla concentrazione desiderata). Il periodo di incubazione per 1 ° e 2 ° anticorpi è ON a 4 ° C o 2 ore a temperatura ambiente, rispettivamente. Per ogni periodo di incubazione, aggiungere delicatamente striscia parafilm sulla parte superiore della diapositiva per prevenire la secchezza. Lavare con PBS (10 min x 3) tra gli anticorpi. Se necessario, aggiungere 1:1.000 Dapi (4&#39;-6-Diamidino-2-fenilindolo), diluito in PBS per 20 minuti a RT. Risciacquare con PBS. </li><li> Montare il vetrino con mezzi di montaggio fluorescenti. Lasciate asciugare per 1 ora prima dell&#39;analisi. </li></ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat%3A+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li>
<li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive%2C+interoceptive%2C+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li>
<li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li>
<li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li>
<li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21(2009).</li>
<li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792(2010).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141(2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm%2C+Pectinophora+gossypiella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li>
<li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo%3A+dynamics+and+modulation+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li>
<li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li>
<li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li>
<li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li>
<li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain%3A+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li>
<li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li>
<li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li>
<li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail%2Fchick+chimeras%3A+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Nessun conflitto di interessi dichiarati.</p

In elettroporazione ovo è uno strumento fattibile, affidabile ed efficace per esaminare le specifiche delle cellule e la guida assonale durante pulcino sviluppo del sistema nervoso 20. In questo protocollo si descrive una modalità di elettroporazione in romboencefalo pulcino a E2.75 utilizzando elementi enhancer che consentano l&#39;etichettatura condizionale di interneuroni specifici. Questa strategia è combinato con il sistema di recepimento PiggyBac-mediata di inserire geni estranei nel g...

Romboencefalo rappresenta un mozzo relè chiave del sistema nervoso comunicando tra il sistema nervoso centrale e periferico tramite ascendente e discendente reti neuronali. Esso regola le funzioni di base tra cui la respirazione, la coscienza, l&#39;udito, e la coordinazione motoria 1-3. Durante lo sviluppo embrionale precoce, la romboencefalo vertebrati viene transitoriamente suddiviso lungo il suo asse antero-posteriore (AP) in rhombomeres ripetitivi, in cui si formano diversi tipi di cellule neuronali e generano molteplici centri nuclei del tronco cerebrale 4. Il cervello posteriore è diviso lungo il suo asse dorso-ventrale (DV) in una piastra basale e alari, in cui progenitori neuronali discrete diventano specificati e differenziano in distinti luoghi DV 3,5,6. Come il primo AP e specifiche DV modelli neuronali sono di istituzione dei circuiterie tronco cerebrale funzionale è in gran parte sconosciuto. Di acquisire conoscenze su questo fondamentalequestione, gli strumenti sono necessari al fine di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni nel cervello posteriore e presto per tracciarne la traiettoria degli assoni e la connettività nelle fasi più avanzate. Abbiamo precedentemente utilizzati specifici elementi enhancer, e un sistema di espressione condizionale Cre / loxP-based per il monitoraggio traiettoria assonale delle dorsali interneuroni spinali nei primi embrione di pollo 7-9. Nel manoscritto attuale abbiamo preso di mira il cervello posteriore e aggiornato il paradigma sperimentale per l&#39;etichettatura di fine interneuroni romboencefalo embrionali, gli assoni e ai loro obiettivi sinaptici, utilizzando una strategia di elettroporazione modificato e il PiggyBac - trasposizione del DNA mediata. La nostra nuova strategia permette la codifica dei sottotipi neuronali distinti in un lato del cervello posteriore e il tracciamento delle loro proiezioni assonali e siti sinaptici nelle varie fasi embrionali, da 2 a 12 giorni dopo l&#39;elettroporazione. In base a questo metodo, abbiamo etichettato la dorsale più a sottogruppo di interneuroni romboencefalo (dA1/Atoh1 + </sup&gt; celle) e ha rivelato due controlaterale ascendenti modelli di proiezione assonale, ogni deriva da una posizione diversa AP e allunga in un funicolo distinto. sono stati trovati DA1 assoni al progetto e formano sinapsi nei nuclei uditivi, mesencefalo e in strati multipli del cervelletto 10. La combinazione di pulcino elettroporazione, genetica rintracciamento di neuroni e analisi di siti per proiezioni molto stadi avanzati di sviluppo prevede una piattaforma unica per studiare la formazione di reti neuronali nel cervello e per chiarire i meccanismi molecolari che presiedono circuito.

<table><tbody><tr><td>Elettrodi da 3 mm Genetrodes in oro a forma di L</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0162</td><td></td></tr><tr><td>generatore di impulsi, ECM 830</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>OCT (temperatura di taglio ottimale) Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura 4583 O.C.T. Smalto composto</td><td></td></tr><tr><td></td><td>da qualsiasi fornitore commerciale</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e obiettivi synaptic in embrione di pollo

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elettroporazione del pulcino embrionale tubo neurale ha molti vantaggi come essere veloce ed efficiente per l&#39;espressione di geni estranei in cellule neuronali. In questo manoscritto forniamo un metodo che dimostra univocamente come l&#39;elettroporazione di DNA nel cervello posteriore aviaria in E2.75, al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di progenitori neuronali, e come seguire le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche in Gran fase avanzata di sviluppo, fino a E14.5. Abbiamo utilizzato nuovi strumenti genetici tra cui specifici elementi enhancer, Cre / Lox - plasmidi base e il sistema di recepimento DNA PiggyBac-mediata di guidare l&#39;espressione della GFP in un sottotipo di cellule romboencefalo (la dorsale più sottogruppo di interneuroni, DA1). Traiettorie e target di DA1 assoni assonale sono seguiti a inizio e fine fasi embrionali in varie regioni del tronco encefalico. Questa strategia contribuisce tecniche avanzate per il targeting di cellule di interesse nel romboencefalo embrionale e per il TRACing formazione circuito a più stadi di sviluppo.

Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per scoprire i modelli assonale e siti di proiezione di DA1 sottogruppo di interneuroni nella romboencefalo pulcino 10. Per etichettare specificamente questi assoni, un elemento enhancer (Atoh1), che è stata precedentemente caratterizzata da specifici per i neuroni spinali DI1 8,12,13, è stato confermato da esprimere in romboencefalo DA1 cellule 10. L&#39;elemento è stato clonato a monte di Cre ricombinasi e co-elettroporato a E2.75 insie...

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di etichettare sottogruppi specifici di neuroni nel cervello posteriore del pollo e di tracciare le loro traiettorie assonali e i bersagli. Ciò si ottiene aprendo prima una piccola finestra ovale al centro di una giornata embrionale.2.75. I plasmidi del DNA successivo all'uovo vengono iniettati nel lume del cervello posteriore.Quindi il cervello posteriore viene elettroporato unilateralmente per consentire l'espressione dei costrutti nel gruppo neuronale desiderato e le uova incubate. Infine, il tronco encefalico viene sezionato dall'intero embrione per la preparazione a montaggio piatto o il sezionamento tissutale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano proiezioni assonali e bersagli sinaptici nella parte posteriore, nel cervello e nel cervelletto in varie fasi dello sviluppo attraverso la colorazione immunofluorescente e l'analisi al microscopio.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come ad esempio il modo in cui specifiche cellule neuronali proiettano i loro assoni e formano connessioni sinaptiche durante lo sviluppo embrionale. Per prepararsi all

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Pulcino in ovo elettroporazione è una tecnica che permette di manipolazione genetica dell'embrione aviaria. Comuni applicazioni di questa tecnica includono l'analisi funzionale dei geni e dei putativi elementi enhancer. Questo video dimostra l'elettroporazione del tubo neurale in HH 10 embrioni di pollo. Tecnica di iniezione e la gestione corretta di uova sono discussi.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino...

Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che...

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Un metodo di espressione genica nel tubo neurale può essere downregulated in una cella di tipo-specifico, tracciabile modo descritto. Noi dimostrare...

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Descriviamo i metodi per l'etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l'imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Impara a tracciare le traiettorie assonali e i target sinaptici nel romboencefalo dell'embrione di pollo mediante elettroporazione. Questa tecnica consente di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni e analizzarne la connettività.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Esplora altri video