Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l'attività neurale nel Locust ( Schistocerca Americana) Circuiti olfattive

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare l'attività neurale multi-unità revocata dall'odore dai primi tre centri di elaborazione del segnale della via olfattiva dell'insetto. Ciò si ottiene trattenendo prima una locusta in una camera progettata su misura e stabilizzando una delle sue antenne per le registrazioni elettrofisiologiche. Il secondo passo consiste nel fabbricare un microelettrodo di vetro e inserirlo alla base di un sole per monitorare le risposte evocate dagli odori.

Accanto a registrare l'attività neurale dal cervello della locusta. Viene seguita una procedura di dissezione in più fasi per esporre il tessuto neurale, che elabora l'input dai neuroni sensoriali olfattivi. La fase finale prevede il posizionamento appropriato degli array di elettrodi multipli per registrare l'attività neurale dell'insieme dalla locusta e dal lobo dell'antenna e dal corpo del fungo.

In definitiva, i metodi di registrazione extracellulare qui dimostrati vengono utilizzati per caratterizzare le risposte evocate dagli odori nei primi tre centri di elaborazione lungo il percorso olfattivo dell'insetto. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per caratterizzare la risposta neurologica evocata dall'odore in un sistema olfattivo di invertebrati relativamente semplice, può anche essere adattato per esaminare l'attività dell'insieme in altri sistemi neurali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché alcuni aspetti chiave di questa procedura, come il posizionamento degli elettrodi e alcune fasi di dissezione, sono molto difficili da imparare.

Inoltre, i metodi sono per lo più qualitativi e diversi laboratori li hanno perfezionati in modo diverso nel tempo. Per iniziare questa procedura, seleziona una giovane locusta adulta di entrambi i sessi con ali completamente sviluppate, ma prima della fase di accoppiamento da una colonia affollata. Quindi, trattieni la locusta amputandole le zampe.

Sigillare i siti di amputazione con adesivo per tessuti. Quindi fissa la locusta alla camera progettata su misura con un piccolo pezzo di nastro isolante drappeggiato attorno al suo torace. Sotto un microscopio da dissezione, praticare una scanalatura poco profonda nella piattaforma di cera per il posizionamento dell'antenna.

Posizionare l'antenna nella scanalatura e stabilizzarla utilizzando la cera bati alle due estremità dell'antenna. Successivamente, inserire un elettrodo di terra nel torace. Utilizzare la cera Batik per sigillare il sito di incisione e per tenere in posizione il filo di terra.

Quindi, posizionare l'antenna a locusta stabilizzata sotto uno stereomicroscopio su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni. Collegare le linee di uscita dei flaconi degli odori al tubo di erogazione degli odori. Posizionare il tubo di erogazione degli odori a pochi centimetri dall'antenna I vapori di odore erogati vengono rimossi da un imbuto a vuoto, posto a circa 10 centimetri dietro l'antenna a locuste.

Quindi fabbricare elettrodi di vetro utilizzando una fresa, un capillare di vetro silicico con una micropipetta, riempire polarmente l'elettrodo di vetro con soluzione salina di robinia. Quindi, posizionare l'elettrodo di vetro in un portamicropipette collegato a un micromanipolatore motorizzato. Assicurarsi che la base del syn di registrazione sia chiaramente visibile al microscopio.

Inserire delicatamente l'elettrodo nella base di un syn. Successivamente amplificare il segnale 10.000 volte. Utilizzo di un amplificatore CA.

Filtra il segnale tra 0,3 e 10,0 kilohertz e acquisiscilo a una frequenza di campionamento di 15 kilohertz. Utilizzando un sistema di acquisizione dati, quando l'elettrodo è posizionato in modo appropriato, è possibile rilevare l'attività neurale spontanea. Le risposte evocate dallo stimolo possono essere monitorate erogando un impulso di odore attraverso il tubo di erogazione dell'odore.

Posizionato vicino all'antenna e tracciando il cambiamento nell'attività extracellulare, ha seguito le procedure di contenimento come descritto in precedenza. Posiziona la locusta in una camera progettata su misura. Inizia il processo di dissezione costruendo una coppa di cera attorno alla testa della locusta.

Costruisci due torri di cera su entrambi i lati della testa della locusta, raggiungendo l'altezza delle antenne. Quindi, inserire ciascuna antenna attraverso un piccolo pezzo di tubo di polietilene che è saldamente inserito in una guarnizione di gomma. Quindi fissare le guarnizioni alle torri di cera in modo che il tubo di plastica possa scivolare liberamente verso o lontano dalla base delle antenne, impedendo il movimento delle antenne.

Quindi, al microscopio, inizia a costruire una coppa di cera attorno alla testa della locusta per consentire la perfusione salina durante e dopo la procedura di dissezione. La coppa della cera dovrebbe iniziare appena sopra le parti della bocca, comprendere entrambe le torri di cera ed estendersi oltre gli occhi composti. Una volta che la coppa della cera è completamente costruita, fissare la base delle antenne all'estremità inferiore del tubo di plastica utilizzando resina epossidica.

Ciò garantirà che le antenne siano mantenute in posizione anche dopo la rimozione della cuticola circostante. Da questo momento in poi, tenere la coppa della cera piena di soluzione salina. Ora, rimuovi la regione rettangolare centrale tra le due.

Un'antenna. Successivamente, rimuovere la cuticola nelle regioni limitrofe senza disturbare gli occhi composti o la cuticola alla base delle antenne. Usando una pinza sottile, rimuovi delicatamente le sacche d'aria e i corpi adiposi che circondano il cervello.

Il cervello della locusta dovrebbe ora essere chiaramente visibile. Le regioni del cervello che elaborano le informazioni olfattive si trovano tra le due. Un'antenna tira delicatamente il budello e lo taglia usando le forbici sottili.

Quindi rimuovere le ali e praticare una piccola incisione nell'addome appena sopra il retto. Rimuovere l'intestino tirando l'intestino posteriore con una pinza grossolana. Questo passaggio garantisce che il movimento intestinale non destabilizzi la preparazione.

Per evitare perdite di soluzione salina. Legare l'addome appena anteriormente al sito di incisione con fili di sutura. Successivamente, utilizzare una piccola piattaforma costituita da un sottile anello di filo rivestito con un sottile strato di cera per elevare il cervello e stabilizzarlo per l'elettrofisiologia.

La registrazione del cervello è protetta da una guaina semitrasparente, che deve essere rimossa prima delle registrazioni. Per indebolire la guaina, svuotare parzialmente la coppa di cera e stendere con cura una piccola quantità di proteasi sulla superficie del cervello. Dopo circa 5-10 secondi di applicazione dell'enzima, sciacquare accuratamente il cervello con soluzione fisiologica.

Quindi pizzicare e tirare verso l'alto la guaina con una pinza super sottile per aprirla ed esporre i siti di registrazione. In questa procedura, posizionare il preparato di locuste sotto uno stereomicroscopio su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni. Mantenere una velocità di perfusione salina costante di circa 40 millilitri all'ora.

Durante l'esperimento, utilizzare un filo di cloruro d'argento immerso nella coppa di cera riempita di soluzione salina come elettrodo di terra. Preparare la configurazione di erogazione degli odori in modo simile all'esperimento di registrazione del sensore singolo. Prima dell'esperimento, galvanizzare gli elettrodi con l'oro per ottenere le impedenze nell'intervallo da 200 a 300 chili.

Utilizzare una sonda al silicio a 16 canali per le registrazioni dei neuroni principali. Al microscopio. Posizionare l'elettrodo vicino alla superficie del lobo dell'antenna e inserirlo delicatamente nel tessuto utilizzando un manipolatore manuale di microm in un sito di registrazione ideale, i segnali extracellulari verranno raccolti da più canali di registrazione e avranno un elevato rapporto segnale/rumore.

Per le registrazioni di celle Kenyon, viene utilizzato un tero a filo intrecciato su misura che segue le procedure per la galvanica. La sonda in silicone posiziona quindi il tero sulla superficie del corpo del fungo. Poiché le Samara delle cellule keniote sono limitate allo strato superficiale di questa regione, sia le registrazioni dei neuroni principali che quelle delle cellule keniote possono essere effettuate contemporaneamente dalla stessa preparazione di locuste.

Dopo aver identificato la posizione di registrazione, attendere almeno 15 minuti per consentire la stabilizzazione degli elettrodi. Quindi acquisire il segnale extracellulare a 15 kilohertz. Filtralo tra 0,3 e sei kilohertz e amplificalo utilizzando un amplificatore CA a 16 canali, sia spontaneo che evocato dallo stimolo.

Si può osservare l'attività neurale multi-unità dai neuroni di proiezione nel lobo dell'antenna. Tracce grezze di tensione extracellulare che mostrano le risposte di un neurone recettore olfattivo a due diversi odori. Qui sono mostrati due etanolo ottale e uno H.

Qui viene mostrata una traccia extracellulare rappresentativa da una registrazione del lobo dell'antenna multi-unità. In questa traccia di tensione si possono osservare i potenziali d'azione o picchi di varia ampiezza originati da diversi neuroni principali. Si noti che è stato applicato un impulso di odore di quattro secondi durante il periodo di tempo indicato dalla casella grigia.

Un esempio di registrazione extracellulare del corpo del fungo è mostrato qui. A differenza dei neuroni recettori olfattivi e dei neuroni principali, le cellule Kenyon nel corpo del fungo insetto hanno un'attività basale inferiore e rispondono agli odori in modo rado e selettivo. Per isolare le risposte di una singola unità da queste registrazioni multi-unità, eseguiamo una procedura di ordinamento dei picchi utilizzando il software pubblicato in modo offline.

Esempi di neurone principale e di smistamento delle punte cellulari keniote sono mostrati qui dopo aver visto questo video. Dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire registrazioni extracellulari multiunità per caratterizzare l'attività neurale dell'ensemble nei primi tre centri olfattivi lungo la via olfattiva dell'inserto.